本发明涉及一种微生物菌株及其应用，具体的说涉及一种枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术：
资源的循环利用对于减轻环境污染，提高废弃物的应用价值具有重要的作用，核心问题是将废弃物资源加以转化，变为可以利用的成分，如秸秆转化为糖类、蛋白转化为氨基酸、脂肪转化为脂肪酸和甘油等，近年基于循环经济的理念，对废弃物的综合利用得到了广泛的提倡。
我国是蛋白资源缺乏的国家，蛋白类废弃资源的循环利用具有重要的价值。养殖场废弃家禽羽毛、动物毛发、畜禽加工的废弃骨类以及低值水产废弃鱼骨与加工下脚料等均未充分高效和综合利用，其生物转化为多肽、氨基酸和用于微生物培养基制备具有较好的意义和价值。
角蛋白是一种来源于外胚层细胞，广泛存在于自然界中的硬性蛋白，角蛋白的组成结构主要可以分为两大类，即α-角蛋白与β-角蛋白，主要存在于各种动物的毛、发、羽、鳞、甲、角、足中。角蛋白结构中的二硫键使其具有抗降解性，所以角蛋白的化学结构比较的稳定，不易溶于水，不会被大多数蛋白酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等降解。对于传统的降解利用角蛋白的方法如：高压加热水解法，酸碱水解法以及挤压膨化处理法都会对角蛋白和环境造成一定的破坏。而利用微生物降解法则可以有效降低这一系列的问题。
以畜禽养殖废弃物角蛋白为例，传统利用角蛋白的方法如高压降解和酸碱水解存在对氨基酸的破坏和环境污染等问题，基于角蛋白的微生物酶解发具有良好的应用效果。同时在目前针对生物有机肥的生产过程中，主要用到的原材料之一是家禽养殖和家畜养殖的动物粪便，能够提供较为充足的氮源，并结合秸秆等生物质用于制备有机肥，目前在畜禽养殖过程中，动物的羽毛和毛发的利用尚不够充分，其在降解过程中需要微生物的作用，高效降解羽毛和毛发的微生物具有潜在的应用价值。
技术实现要素：
针对废弃蛋白资源利用不足的问题，本发明提供一种枯草芽孢杆菌及其应用，该枯草芽孢杆菌具有良好的降解废弃蛋白的能力，培养所需的培养基成分简单易得，且廉价，生长速度快；该枯草芽孢杆菌在降解废弃蛋白资源的同时，可以作为发酵剂用于制备有机肥腐熟剂。具体技术方案如下：
一种枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌sl-10(bacillussubtilissl-10)，该枯草芽孢杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2017年6月28日，保藏编号：cctccno:m2017387，分类命名为：枯草芽孢杆菌sl-10。
一种如上所述的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，该枯草芽孢杆菌用于降解角蛋白。
进一步地，该角蛋白包括羽毛、羊毛、牛毛、猪毛、蚕丝、鱼鳞、人发中的角蛋白。
一种利用如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌降解角蛋白的方法，具体步骤如下：
(1)配制种子培养基：每升种子培养基含有蛋白胨5-15g，牛肉膏3-8g，氯化钠2-4g，ph值6-9；
(2)将枯草芽孢杆菌的斜面培养物接种于步骤(1)配制的种子培养基中，于20-40℃温度下120-220rpm转速下培养10-20小时至对数生长期，得种子液；
(3)配制发酵培养基：每升发酵培养基含有废弃蛋白10-30g，磷酸二氢钾2-6g，磷酸氢二钾1-5g，硫酸镁1-3g，氯化钠1-3g，ph值6-9，培养基经灭菌冷却备用；
(4)将步骤(2)获得的种子液以体积比2-6％的比例接种于所述的发酵培养基，于20-40℃温度下120-220rpm转速下培养30-60小时，得到含有蛋白降解物、菌体和蛋白酶和角蛋白酶的发酵液。
进一步地，所述的发酵液作为发酵剂用于制备有机肥腐熟剂。
进一步地，所述的有机肥腐熟剂的制备方法如下：
步骤一：将待发酵底物原料混合，按照重量比1:1到1：5添加水，充分混合后，并将混合物进行灭菌冷却备用；
步骤二：将所述的含有蛋白降解物、菌体和蛋白酶和角蛋白酶的发酵液添加入步骤一的混合物中，充分混合后于20-40℃温度下固态发酵24-96小时，即得到有机肥腐熟剂。
进一步地，所述的待发酵底物原料由麸皮、谷壳、米糠、蛋白废弃物中的一种或多种按任意配比组成。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明筛选得到的枯草芽孢杆菌具有良好的降解废弃蛋白的能力，培养所需的培养基成分简单易得，且廉价，生长速度快；
(2)枯草芽孢杆菌在降解废弃蛋白资源的同时，可以作为发酵剂用于制备有机肥腐熟剂，鉴于该菌种的良好分解蛋白能力，在畜禽类废弃物发酵有机肥的过程中具有良好的作用。
附图说明
图1为实施例1中的羽毛作为底物发酵前后降解的电镜图；
图2为实施例2中的猪毛作为底物发酵前后降解的电镜图；
图3为实施例3中的羽毛作为底物发酵前后降解效果图；
图4为实施例4中的人发作为底物发酵前后降解的电镜图。
生物保藏：
枯草芽孢杆菌sl-10(bacillussubtilissl-10)于2017年6月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，保藏编号：cctccno:m2017387。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体说明。
本发明中微生物蛋白酶的活性以1％酪蛋白tris-hcl(ph8.0)溶液进行反应，具体过程如下：取经缓冲液适当稀释的酶液1ml，加入1ml酪蛋白底物于50℃水浴中反应10min后以2mltca终止，对照先加入2mltca再加入底物。反应结束后3000rpm离心30min，取上清液1ml于玻璃管中，加入5ml0.4mna2co3溶液和1ml福林-酚试剂，于40℃水浴中反应15min后，放至室温。以680nm条件下相对空白对照吸光度增加值表示酶活性。
本发明中角蛋白酶的活性以天青角蛋白为底物进行测试：取5mg天青角蛋白粉碎，以lml50mm的不同ph8.0的缓冲液悬浮，加入以同种缓冲液10倍稀释的粗酶液1ml于50℃水浴中200rpm反应30min。之后以2ml4m三氯乙酸终止反应并以3000rpm离心20min，于595nm测定上清液中释放染料的吸光度。天青角蛋白溶液在加入酶液前加入2mltca溶液作为对照。1单位酶活性定义为上述各反应条件下使595nm下校正吸光度增加0.01单位所需的酶量。
本发明中微生物的数量以平板计数法进行计算，即将待测样品进行梯度稀释后，以平板计数法进行样品中微生物数量的计算，以菌落形成单位cfu表示。
下面的实施例中所用的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌sl-10，该枯草芽孢杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2017年6月28日，保藏编号：cctccm2017387。
实施例1
一种枯草芽孢杆菌降解角蛋白的方法，具体如下：
(1)配制种子培养基：每升种子培养基含有蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠3g，ph值7.0，并于121℃下灭菌20分钟后冷却至室温待用。
(2)接种斜面上的枯草芽孢杆菌的1环于种子培养基中，于30℃温度下150rpm转速下培养16小时至对数生长期，得种子液；
(3)配制发酵培养基，每升发酵培养基含有家禽羽毛20g，磷酸二氢钾3g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁1g，氯化钠1g，ph值7.0，培养基经115℃灭菌30分钟后冷却备用。
(4)将步骤(2)获得的种子液以体积比为3％的比例接种于步骤(3)的发酵培养基，于30℃温度下150rpm转速下培养48小时，得到含有蛋白降解物、菌体和蛋白酶和角蛋白酶的发酵液。此时，计数得到菌落数1.5*109cfu/ml，蛋白酶活性1648.6u/ml，角蛋白酶活性18.6u/ml。
上述制备的蛋白降解物、菌体和蛋白酶和角蛋白酶的发酵液用于制备有机肥发酵载体，具体步骤如下：
有机肥腐熟剂载体的制备：称量8份麸皮和2份羽毛粉，加水10份，达到固体液体比例1：1，充分混合后，在121℃下灭菌20分钟，冷却后接种步骤4所得的发酵混合液，接种比例为20％，充分混合后30℃下固态发酵48小时，得到有机肥腐熟剂，此时菌落数为5.6*108cfu/ml，蛋白酶活性为1036.2u/ml，角蛋白酶活性16.4u/ml。
为考察该微生物对羽毛的降解情况，将降解前后的羽毛进行电镜观察，考察羽毛变化，如图1所示，其中图1(a)为羽毛降解前电镜图，图1(b)为羽毛降解后电镜图，从图中可以看出，羽毛发酵后被显著降解。
实施例2
一种枯草芽孢杆菌降解角蛋白的方法，具体如下：
(1)配制种子培养基：每升种子培养基含有蛋白胨15g，牛肉膏6g，氯化钠3g，ph值7.2，并于121℃下灭菌20分钟后冷却至室温待用。
(2)接种斜面上的枯草芽孢杆菌的1环于种子培养基中，于37℃温度下200rpm转速下培养20小时至对数生长期，得种子液。
(3)配制发酵培养基：每升发酵培养基含有猪毛粉20g，磷酸二氢钾2.5g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁1g，氯化钠2g，ph值7.2，培养基经121℃灭菌20分钟后冷却备用。
(4)将步骤(2)获得的种子液以体积比5％的比例接种于步骤(3)的发酵培养基，于37℃温度下200rpm转速下培养60小时，得到含有蛋白降解物、菌体和蛋白酶和角蛋白酶的发酵液。此时，计数得到菌落数1.2*109cfu/ml，蛋白酶活性1452.6u/ml，角蛋白酶活性15.8u/ml。
上述制备的蛋白降解物、菌体和蛋白酶和角蛋白酶的发酵液用于制备有机肥发酵载体，具体步骤如下：
有机肥腐熟剂载体的制备：称量8份麸皮、1份羽毛粉和1份猪毛粉，加水10份，充分混合后，在121℃下灭菌20分钟，冷却后接种步骤4所得的发酵混合液，接种比例为30％，充分混合后30℃下固态发酵72小时，得到有机肥腐熟剂，此时菌落数为4.8*108cfu/ml，蛋白酶活性为1078.2u/ml，角蛋白酶活性14.2u/ml。
为考察该微生物对猪毛的降解情况，将降解前后的猪毛进行电镜观察，考察猪毛变化，如图2所示，图2(a)为降解前电镜图，图2(b)为降解后电镜图，从图中可以看出，猪毛发酵后被显著降解。
实施例3
一种利用枯草芽孢杆菌降解角蛋白的方法，具体步骤如下：
(1)配制种子培养基：每升种子培养基含有蛋白胨5g，牛肉膏8g，氯化钠4g，ph值6，并于121℃下灭菌20分钟后冷却至室温待用。
(2)接种斜面上的枯草芽孢杆菌的1环于种子培养基中，于37℃温度下220rpm转速下培养10小时，得种子液。
(3)配制发酵培养基：每升发酵培养基含有羽毛20g，磷酸二氢钾6.0g，磷酸氢二钾5.0g，硫酸镁3.0g，氯化钠1g，ph值8.5，培养基经121℃灭菌20分钟后冷却备用。
(4)将步骤(2)获得的种子液以6％的比例接种于步骤(3)的发酵培养基，于40℃温度下200rpm转速下培养20小时，得到含有蛋白降解物、菌体和蛋白酶和角蛋白酶的发酵液，羽毛降解效果如图3所示。此时，计数得到菌落数0.8*109cfu/ml，蛋白酶活性1247.4u/ml，角蛋白酶活性12.8u/ml。
上述制备的蛋白降解物、菌体和蛋白酶和角蛋白酶的发酵液用于制备有机肥发酵载体，具体步骤如下：
有机肥腐熟剂载体的制备：称量8份麸皮、1份羽毛粉和1份米糠，加水20份，充分混合后，在121℃下灭菌20分钟，冷却后接种步骤4所得的发酵混合液，接种比例为40％，充分混合后37℃下固态发酵90小时，得到有机肥腐熟剂，此时菌落数为6.0*108cfu/ml，蛋白酶活性为1246.0u/ml，角蛋白酶活性15.4u/ml。
图3为本实施例的羽毛降解效果图，图3(a)为对照组，图3(b)为降解后的效果图，从图中可以看出，降解效果明显。
实施例4
一种利用枯草芽孢杆菌降解角蛋白的方法，具体步骤如下：
(1)配制种子培养基：每升种子培养基含有蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠2g，ph值6.5，并于121℃下灭菌15分钟后冷却至室温待用。
(2)接种斜面上的枯草芽孢杆菌的1环于种子培养基中，于20℃温度下120rpm转速下培养10小时，得种子液。
(3)配制发酵培养基：每升发酵培养基含有人发10g，磷酸二氢钾2g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁1g，氯化钠1g，ph值6.5，培养基经121℃灭菌20分钟后冷却备用。
(4)将步骤(2)获得的种子液以2％的比例接种于步骤(3)的发酵培养基，于20℃温度下220rpm转速下培养60小时，得到含有蛋白降解物、菌体和蛋白酶和角蛋白酶的发酵液，对人发降解情况进行电镜拍照，结果如图4所示。此时，计数得到菌落数1.1*109cfu/ml，蛋白酶活性1468.6u/ml，角蛋白酶活性16.0u/ml。
上述制备的蛋白降解物、菌体和蛋白酶和角蛋白酶的发酵液用于制备有机肥发酵载体，具体步骤如下：
有机肥腐熟剂载体的制备：称量7份麸皮、2份羽毛粉和1份米糠，加水20份，充分混合后，在121℃下灭菌20分钟，冷却后接种步骤(4)所得的发酵混合液，接种比例为20％，充分混合后28℃下固态发酵80小时，得到有机肥腐熟剂，此时菌落数为4.2*108cfu/ml，蛋白酶活性为1024.2u/ml，角蛋白酶活性13.8u/ml。
该实施例的人发降解效果图如图4所示，其中(a)为降解前的电镜图，(b)为降解后的电镜图。从图中可以看出，降解效果明显。