具有刺猬通路拮抗剂活性的手性杂环化合物及其制备方法和应用与流程
本申请要求于2016年7月4日提交中国专利局、申请号为cn201610511917.7、发明名称为“具有刺猬通路拮抗剂活性的手性杂环化合物及其制备方法和应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
本发明涉及具有刺猬通路拮抗剂活性的手性杂环化合物及其制备方法和应用的领域，属于医药技术领域。更具体地，本发明涉及可用于细胞信号和癌症治疗领域的新型杂环化合物。更具体地，本发明涉及靶向哺乳动物中刺猬信号通路介导的疾病(例如癌症)的疗法。
背景技术：
恶性肿瘤是危害人类健康的最主要疾病之一，每年恶性肿瘤新发病例约1090万，而每年因恶性肿瘤而死亡的患者约670万[1]。因此，肿瘤的防治亦是医药界的重大课题，其中抗肿瘤药物的研发经过多年的研究探索也发生了巨大的变化。以前临床治疗上常用的抗肿瘤药物主要是细胞毒类药物，这类抗肿瘤药具有选择性差、毒副作用强、易产生耐药性等缺点；近年来随着生命科学研究的飞速进展，恶性肿瘤细胞内的信号转导、细胞周期的调控、细胞凋亡的诱导、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程逐步被阐明。因此，使用一些与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号转导通路的关键酶作为药物筛选靶点，选择性作用于这些特定靶点，同时具备高效、低毒性质的新型先导化合物已成为当今抗肿瘤药物研究开发的重要方向。曲妥珠单抗(trastuzumab)、伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)以及埃罗替尼(erlotinib)等靶向药物的成功上市就是典型的例子[2]。
转移与再生不仅是恶性肿瘤的特点，而且也是治疗恶性肿瘤的难题。即使是新一代的靶向药物也对肿瘤的转移与再生疗效甚微。基于此，近年来hedgehog(hh)信号通路-刺猬通路的研究受到了科学界越来越多的重视，这不仅是因为hh信号通路异常活化在许多肿瘤包括基底细胞癌、脑肿瘤、乳腺癌、前列腺癌和一些消化系统恶性肿瘤的发生发展过程都起了举足轻重作用[3-11]，更重要的是hh信号通路是胚胎发育通路，对调控肿瘤干细胞，从而控制肿瘤转移与再生有重要作用。
hedgehog信号通路是一个高度保守的细胞间信号转导系统，1980年在果蝇中发现，由于果蝇的该通路基因突变可导致幼虫体表现出许多形似刺猬的刺突,故命名为刺猬通路(hedgehog(hh)pathway)[12]。hh信号通路由hh配体、两个跨膜蛋白受体patched膜受体(ptch)和smoothened跨膜蛋白受体(smo)及下游转录因子gli蛋白等组成[13]。ptch和smo是位于靶细胞膜上的两种跨膜蛋白，其中ptch是由抑癌基因ptch编码的12次跨膜蛋白，是一种细胞表面受体，具有隔离和转导hh的双重作用。smo是一个7次跨膜蛋白，结构上与g蛋白偶联受体家族高度相似，具有转导hh信号的作用。ptch和smo在hh信号传递过程中起到受体的作用，其中ptch为hh的受体，当不存在hh时，ptch阻止smo转位到细胞膜，从而抑制smo的活性，进而抑制下游基因的转录表达。当hh信号存在，hh与ptch结合，诱导smo羧基端的多个丝/苏氨酸残基发生磷酸化，导致smo在细胞表面聚集并激活，激活的smo与驱动蛋白样分子costal2(cos2)及丝/苏氨酸激酶fused(fus)、suppressoroffused(sufu)形成复合物并从微管上解离出来。smo以全长的形式发挥转录激活作用，最终引起锌指样转录因子gli活化，而后者进入细胞核内引起靶基因的转录。因此，在hh信号通路中，hh是该信号通路的起点，而gli作为转录因子是该信号通路的终点，hh与smo作为激动因子，ptch作为抑制因子，调控着信号通路的活性[12,14]。
跨膜蛋白受体smo作为hh信号通路的关键成员，是hh信号通路中的信息转换器，它能够把细胞外的hh信号转换成细胞内的gli1信号，从而启动细胞核内基因的转录，对hh信号通路具有激活作用[15]。绝大多数与hh通路激活相关的肿瘤细胞的发生、发展过程中均存在着smo的功能性突变。小分子smo蛋白拮抗剂通过对抗smo而特异性阻断hh信号通路，而hh信号通路在正常成体中处于失活状态，所以拮抗剂对机体的其他部位不会产生副作用，这是肿瘤的靶向性治疗可行性的理论基础。因此，smo蛋白已经成为当前抗肿瘤药物研发中最令人关注的靶点之一。靶向smo蛋白的小分子拮抗剂的合成也成为国际上各大制药公司的研发热点。现今至少有5个靶向smo蛋白的小分子拮抗剂在进行临床测试。其中，美国genentech公司和curis公司共同研发的小分子smo拮抗剂gdc-0449，于2012年1月被美国食品药品监督管理局fda批准用于晚期基底细胞癌病人的治疗[16]。这证明小分子smo拮抗剂作为抗肿瘤药物的研发有着良好的应用价值和市场前景。
刺猬(hh)信号通路在胚胎发育过程中参与调控细胞的构型、生长和迁移。在成体细胞中，hh信号通路仅限于组织维持和修复。然而，该通路在组织修复和再生期间会被重新激活。在正常条件下，内源性配体声波刺猬、印度刺猬和沙漠刺猬与其受体patched(ptch)结合，这反过来减轻了ptch对下游蛋白smoothened(smo)的抑制作用。smo活化最终会导致由gli家族转录因子介导的特异性基因表达(jiangandhui,dev.cellreview(2008)15:801-812)。异常的hh信号与人类相关的许多癌症有关。抑制通路组分的突变失活导致hh信号通路的组成型配体非依赖性激活，导致癌症如基底细胞癌、成神经管细胞瘤(xieetal.,nature(1998)391:90-92)和胶质母细胞瘤等(baretal.stemcells(2007)25(10):2524-33；filbinetal.naturemedicine(2013)19:1518-1523dio:10.10.38/nm.3328)。hh信号的配体依赖性激活与前列腺癌(sanchezetal.pnas101(2004)(34):12561-566)、胰腺癌(thayeretal.nature(2003)423:851-856)、乳腺癌(kuboetal.cancerres.(2003)64:6071-6074)、非小细胞肺癌(yuanetal.oncogene(2007)26:1046-1055)、小细胞肺癌(watkinsetal.nature(2003)422:313-317)和一些血癌(scalesetal.,trendspharmacol.sci.(2009)30:303-312)都有相关。因此，对异常hh信号的抑制为癌症治疗提供了一种新的途径(peukertandmiller-moslin,chemmedchem(2010)5:500-512)。
已经发现刺猬信号能调节abc转运蛋白多药耐药蛋白-1(mdr1、abcb1、p-糖蛋白和bcrp、abcg2)的表达，并且通过小干扰rna部分逆转hh诱导的化学抗性靶向敲除mdr1和bcrp表达。这表明hh通路可能是克服mdr和增加化学治疗反应的目标(sims-mourtadaetal.oncogene(2007)26:5674-79)。另外，声波刺猬信号通路的阻断能增强egfr抑制剂在胰腺癌细胞(huetal.actapharmacol.sin.(2007)281224-30)和前列腺癌细胞(mimeaultetal.int.j.cancer(2006)118:1022-31)中的抗增殖作用。
刺猬通路还与化学放射疗法后的肿瘤再生和作为改善放射反应的潜在靶标相关(sim-mourtadaetal.clin.cancerres.(2006)12:6565-6572)。
还有报道称，刺猬信号通路的抑制可用于治疗与炎症、上皮细胞增生、组织纤维化或免疫病症有关的一系列疾病(lambetal.ep1183040)。
环巴胺(cyclopamine)是一种天然存在的生物碱，是首次报道的hh信号通路抑制剂(cooperetal.,science(1998)280:1603-1607)，后来被鉴定为smo拮抗剂(chenetal.,genes.dev.(2002)16:2743-2748)。环巴胺衍生物ipi-926，其表现出比环巴胺更好的活性、稳定性以及其他药物理化性质，已进入临床开发阶段(trembleyetal.,j.med.chem.(2009)52:4400-4418)。gdc-0449作为一种胚胎通路抑制剂(robargeetal.,bioorg.med.chem.lett.(2009)19:5576–5581)，于2012年1月被fda批准用于治疗不适合手术的基底细胞癌。
尽管这些化合物取得了进展，但仍存在许多问题。例如，gdc-0449除了一个甲基的碳原子外，所有的碳原子都是sp2杂化的，从而使其具有较高的熔点(251℃)和较低的溶解度(9.5μg/ml)——通过在右侧苯环引入邻位的氯原子可以一定程度上降低右侧苯环和酰胺的平面性从而改善该化合物的溶解度(robargeetal.)。另外，临床试验也发现它能引起smo的突变并导致至少一名患者快速肿瘤复发(yauchetal.,science(2009)326:572-574)。
我们在先前的专利(wo2014113191a1)中公开了一系列化合物，其中代表性化合物(a-55和a97)具有下述结构，其对hh信号通路的抑制活性(nih3t3-gre-luc的ic50)分别为5.5nm(参照vismodegib8.8nm，比率1.6倍)和84nm(参照vismodegib45nm，比率0.54倍)。
当wo2014113191a1中的一系列化合物(式i)的r5和r6为氢时，活性更好。然而，随后的药代动力学研究发现所述化合物的亚甲基部分(wo2014113191a1中的式i，r5和r6中为氢)很容易发生氧化代谢。
参考文献
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16.curispharmaceuticalspressrelease:
http://investors.curis.com/releasedetail.cfm？releaseid＝643756.
技术实现要素：
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种具有刺猬通路拮抗剂活性的手性杂环化合物及其制备方法和应用。该化合物能够阻断刺猬通路，从而能够抑制细胞异常增长，并阻断肿瘤细胞转移再生。
本发明的目的通过以下技术方案得以实现：
一种具有刺猬通路拮抗剂活性的手性杂环化合物，及其药学上可接受的盐，具有式i所示的结构：
一种具有刺猬通路拮抗剂活性的手性杂环化合物的制备方法，其包括将化合物
上述的制备方法中，所述化合物
上述的制备方法中，所述化合物
上述的制备方法中，甲酸的乙腈溶液中，甲酸的浓度为约2.0-3.5mmol/ml；化合物
本发明还提供具有刺猬通路拮抗活性的手性杂环化合物在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤的药物组合物中的应用。所述肿瘤包括肝癌、肺癌、直肠癌、子宫颈癌、胰脏癌、乳癌、胃癌、口腔癌、食管癌、鼻咽癌、皮肤癌、骨癌、脑癌、肾癌和血癌或几种的组合。
本发明还提供一种抗肿瘤的药物组合物，其包含上述的具有刺猬通路拮抗剂活性的手性杂环化合物和至少两种其药学上可接受的盐的混合形成的组合物。
本发明还提供一种抗肿瘤药物的联合应用组合物，其包含顺铂、紫杉醇、喜树碱、曲妥珠单抗、格列卫、伊马替尼、吉非替尼、埃罗替尼和拉帕替尼中的一种或几种的组合与上述的具有刺猬通路拮抗剂活性的手性杂环化合物的联合。
本发明还提供一种抗肿瘤药物的联合应用组合物，其包含顺铂、紫杉醇、喜树碱、曲妥珠单抗、格列卫、伊马替尼、吉非替尼、埃罗替尼和拉帕替尼中的一种或几种的组合与上述的抗肿瘤的药物组合物的联合。
本发明的具有刺猬通路拮抗剂活性的手性杂环化合物是一种新型的抗肿瘤化合物，其结构中有一个手性碳，构型为r构型。与消旋化合物相比，该手性化合物对刺猬通路的抑制活性提高了3倍。在体外cyp肝酶的抑制实验中，消旋化合物在10μm时对cyp-2c9的抑制活性为52％，而该手性化合物在10μm时对cyp-2c9的抑制活性仅为26％，显示出了更好的安全性。在大鼠的药代动力学测试中，相较于消旋化合物，该手性化合物的生物利用度提高了将近一倍，达到100％。此外，曲线下面积等参数也均有显著提高。在小鼠肿瘤模型中，100mg/kg的剂量下，消旋化合物只能使肿瘤不再生长，而该手性化合物可以使肿瘤体积缩小至近乎消失，具有强烈的抗肿瘤作用。与先前专利(wo2014113191a1)中的a-55(其为去甲基类似物)相比，手性化合物对刺猬通路的抑制活性可增加约12倍。在大鼠的药代动力学试验中，相较于化合物a-55，该手性化合物的生物利用度提高了将近一倍，达到100％；体内半衰期也会增加；药物暴露(曲线下面积auc)可以显著增加。这表明手性化合物与其相应的去甲基类似物相比，对抑制异常细胞生长和阻断肿瘤细胞的转移和再生具有更突出的、意想不到的作用，例如更好的活性、更好的生物利用度等许多优点，从而具有更好的肿瘤治疗应用前景。
本发明的有益效果为：具有刺猬通路拮抗剂活性的手性杂环化合物可以阻断刺猬通路，从而抑制异常细胞生长、阻断肿瘤细胞的转移和再生。本发明的手性杂环化合物与其去甲基类似物相比，还具有更好的生物活性和更好的药代动力学性质，具有更好的肿瘤治疗应用前景。
以下便结合实施例附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解和掌握。
在一个方面，本发明提供式ii的化合物：
或其药学上可接受的盐、立体异构体或溶剂化物，其中，
x、y和y’独立地为c1-3烷基、cd3、cf3、cn、卤化物或ome；
r2和r’2独立地为h、c1-3烷基、cd3或cf3，条件是r2和r’2中的至少一个不为h；
r1为-nrxry，其中rx和ry独立地为h、烷基、环烷基、烷基环烷基、c(o)r”，或-nrxry可以一起形成4-7元杂环，其中4-7元杂环为取代或未取代的；
r”为c1-5烷基；
w1、w2、w3、w4、w5、w6、w7、w8和w9独立地为h或d，并且
a是n或ch。
在一些实施方式中，y和y’独立地为ch3、cd3、cf3、cl或f。在一些实施方式中，x为卤素、cf3、cd3或ch3。在一些实施方式中，r1为
在另一个方面，本发明提供式iii的化合物：
或其药学上可接受的盐、立体异构体或溶剂化物，其中，
r2和r’2独立地为h、c1-3烷基、cd3或cf3，条件是r2和r’2中的至少一个不为h；
r1为-nrxry，其中rx和ry独立地为h、烷基、环烷基、烷基环烷基、c(o)r”，或-nrxry可以一起形成4-7元杂环，其中4-7元杂环为取代或未取代的；
r”为c1-5烷基；
w1、w2、w3、w4、w5、w6、w7、w8和w9独立地为h或d，并且
a是n或ch。
在一些实施方式中，r1为
在另一个方面，本发明提供式iv的化合物：
或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中，
r2为h、c1-3烷基、cd3或cf3；
r1为-nrxry，其中rx和ry独立地为h、烷基、环烷基、烷基环烷基、c(o)r”，或-nrxry可以一起形成4-7元杂环，其中4-7元杂环为取代或未取代的；
r”为c1-5烷基；并且
w1、w2、w3、w4、w5、w6、w7、w8和w9独立地为h或d。
在一些实施方式中，r1为
在一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含式ii-iv中任一项的化合物和药学上可接受的载体。
在另一个方面，本发明提供一种抑制被诊断患有过度增殖性疾病的患者中的刺猬通路激活的方法，包括向患者施用包含有效量的刺猬通路抑制剂的组合物，以减少患者细胞中的刺猬通路的激活，其中所述刺猬通路抑制剂为式ii-iv中任一项的化合物。
附图说明
图1是实施例1的中间体b1-3的d-酒石酸盐的单晶衍射图。
图2是实施例3中化合物b1对hh通路抑制活性的曲线图。
图3是实施例3中化合物b对hh通路抑制活性的曲线图。
图4是实施例3中化合物b2对hh通路抑制活性的曲线图。
图5是实施例5中化合物b1的药代动力学曲线图。
图6是实施例5中化合物b的药代动力学曲线图。
图7是实施例6中肿瘤体积抑制对比曲线图。
图8是实施例6中肿瘤体积抑制对比实物图。
图9是通过单晶衍射测定的实施例7的中间体b1-3的d-酒石酸盐的结构。
图10描绘了主要测定中标准化合物a的ic50曲线。
图11描绘了主要测定中化合物b1的ic50曲线。
图12描绘了主要测定中化合物b的ic50曲线。
图13描绘了主要测定中化合物b2的ic50曲线。
图14显示实施例14中化合物b1对大鼠的代谢曲线。
图15显示实施例14中化合物b对大鼠的代谢曲线。
图16描绘了实施例15中对于肿瘤的肿瘤体积随时间变化的曲线。
图17描绘了实施例15中不同时间点的肿瘤照片。
在进行详细描述之前，应理解，以下详细描述本质上仅是示例性的，并不意图限制本发明或其应用和用途。因此，尽管为了便于解释，本发明如某些说明性实施方式那样描述和记载，但是应当理解，本发明可以在各种其他类型的实施方式和等同物中以及在各种其他系统和环境中实现。此外，不意在受前述背景技术或以下详细描述中提出的任何理论的约束。
具体实施方式
本文一般使用标准命名法描述化合物。对于具有不对称中心的化合物，应理解(除非另有说明)包括所有光学异构体及其混合物。此外，具有碳-碳双键的化合物可以以z-型和e-型存在，除非另有说明，否则所述化合物的所有异构形式都包括在本发明中。当化合物以各种互变异构形式存在时，所列举的化合物不限于任何一种特定的互变异构体，而是旨在包括所有的互变异构形式。
如本文所用，术语“烷基”是指直链或支链饱和脂族烃。烷基包括具有1至8个碳原子(c1-8烷基)、1至6个碳原子(c1-6烷基)和1至4个碳原子(c1-4烷基)的基团，包括例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、2-戊基、异戊基、新戊基、己基、2-己基、3-己基和3-甲基戊基。在某些情况下，具体指出烷基的取代基。例如，“氰基烷基”是指被至少一个氰基取代基取代的烷基。
“烯基”是指直链或支链烯基，其包含至少一个不饱和碳-碳双键。烯基包括c2-8烯基、c2-6烯基和c2-4烯基，它们分别具有2至8、2至6或2至4个碳原子，包括例如乙烯基、烯丙基或异丙烯基。“炔基”是指直链或支链炔基，其具有一个或多个不饱和碳-碳键，其中至少一个是三键。炔基包括c2-8炔基、c2-6炔基和c2-4炔基，其分别具有2至8、2至6或2至4个碳原子。
“环烷基”是包含一个或多个饱和环的基团，其中所有环成员都为碳，包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、金刚烷基。环烷基不包含芳环或杂环。某些环烷基是c3-7环烷基，其中环烷基含有具有3-7个环成员的单环，所有这些环成员都为碳。“环烯基”是包含一个或多个不饱和环的基团，其中所有环成员都为碳。
“烷氧基”是指通过氧桥连接的如上所述的烷基。烷氧基包括c1-6烷氧基和c1-4基团，其分别具有1至6或1至4个碳原子。甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、2-戊氧基、3-戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、己氧基、2-己氧基、3-己氧基和3-甲基戊氧基是代表性的烷氧基。
“烷基氨基”是指具有通式结构-nh-烷基或-n(烷基)(烷基)的仲胺或叔胺，其中每个烷基独立地选自烷基、环烷基和(环烷基)烷基。这些基团包括，例如，单-和二-(c1-6烷基)氨基，其中每个c1-6烷基可以相同或不同。显而易见的是，术语“烷基氨基”中使用的“烷基”的定义不同于用于所有其它含烷基的基团包括环烷基和(环烷基)烷基的“烷基”的定义。
“卤素”表示氟、氯、溴和碘。“卤代烷基”是被一个或多个独立选择的卤素取代的烷基(例如，具有1至6个碳原子和至少一个卤素的“c1-6卤代烷基”)。卤代烷基的实例包括但不限于单-、二-或三-氟甲基；单-、二-或三-氯甲基；单-、二-、三-、四-或五-氟乙基；单-、二-、三-、四-或五-氯乙基；和1,2,2,2-四氟-1-三氟甲基-乙基。
“杂芳基”是芳族基团，其中至少一个芳环包含至少一个选自n、o和s的杂原子。杂芳基包括例如5-12元杂芳基。实例包括但不限于咪唑、呋喃、呋咱、异噻唑、异恶唑、恶二唑、恶唑、吡嗪、吡唑、哒嗪、吡啶、嘧啶、四唑、噻唑和噻吩。
术语“杂环族(heterocyclic)”或“杂环(heterocycle)”是指含有3-12个环原子的环结构，其中至少一个环原子是碳，并且至少一个环原子是选自n、o和s的杂原子。杂环基团可以是芳族的或非芳族的。哌啶和氧杂环丁烷是非芳族杂环的非限制性实例。噻唑和吡啶是芳族杂环的非限制性实例。
本文所用的“取代基”和“取代的”表示分子部分与目标分子内的原子共价键合。例如，环取代基可以是诸如卤素、烷基、卤代烷基或与作为环成员的原子(优选碳或氮原子)共价键合的其他基团的部分。芳族基团的取代基通常与环碳原子共价键合。类似地，链取代基可以是诸如卤素、烷基、卤代烷基或与作为链成员的原子(优选碳或氮原子)共价键合的其他基团的部分。
当使用根据式ii-iv化合物时，术语“药学上可接受的”旨在表示对受试者给药安全的化合物形式。例如，式ii-iv化合物的游离碱、盐形式、溶剂化物、水合物、前药或衍生物形式，其已通过管理机关或监管机构，例如美国的食品和药品管理局(fda)，被批准通过口服摄入或任何其它施用途径用于哺乳动物，是药学上可接受的。
式ii-iv化合物中包括游离碱化合物的药学上可接受的盐形式。术语“药学上可接受的盐”包括盐，通常用于形成碱金属盐和形成游离酸或游离碱的加成盐，其已经由监管机构批准。盐由离子缔合，电荷-电荷相互作用、共价键合、络合、配位等形成。盐的性质并不重要，只要它是药学上可接受的。
在一些实施方式中，式ii-iv的化合物用于通过施用化合物作为药物组合物来治疗受试者。为此，在一个实施方式中，将化合物与一种或多种药学上可接受的赋形剂(包括载体、稀释剂或佐剂)组合，以形成合适的组合物，其在本文中有更详细的描述。
本文所用的术语“赋形剂”表示除活性药物成分(api)之外的任何药学上可接受的添加剂、载体、佐剂或其他合适的成分，其通常被包括在内用于配制和/或施用目的。“稀释剂”和“佐剂”在下文中定义。
本文所用的术语“处理”、“进行处理”、“处理作用”和“治疗”是指治疗，包括但不限于治愈性治疗、预防性治疗和防止性治疗。预防性治疗通常构成预防疾病的发作或延迟个体的临床前明显的疾病阶段的发作。
短语“有效量”旨在量化每种药剂的量，其将实现改善病症严重性和每种药剂自身治疗的发生频率的目标，同时避免通常与替代疗法相关的不良副作用。在一个实施方式中，有效量以单一剂型或多剂型给药。
无论选择何种给药途径，将本发明化合物(可以合适的水合形式使用)和/或本发明的药物组合物配制成药学上可接受的剂型或通过其他本领域技术人员已知的方法。
可改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得有效量的活性成分，以在对患者无毒的情况下实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应。
所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括所用的本发明特定化合物的活性，给药途径，给药时间，所用的特定化合物的排泄速率，治疗持续时间，与所用的特定刺猬抑制剂联合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、病情、一般健康状况和既往病史等医学艺术领域已知的因素。
具有本领域普通技能的医生或兽医可以容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医生或兽医可以以低于实现所需治疗效果所需的水平开启药物组合物中使用的本发明化合物的剂量，并逐渐增加剂量直至达到所需效果。
通常，本发明化合物的合适日剂量是化合物的量，其是有效产生治疗效果的最低剂量。这种有效剂量通常取决于上述因素。通常，用于患者的本发明化合物的静脉内、脑室内和皮下剂量范围为每天每千克体重约0.0001至约100mg。给药方式对剂量有很大影响。较高剂量可用于局部递送途径。
如果需要，活性化合物的有效日剂量可以任选地以单位剂型，作为两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量在一天中以适当的间隔分开施用。本领域技术人员将容易理解，剂量水平可以根据具体化合物、症状的严重程度和受试者对副作用的敏感性而变化。本领域技术人员可通过各种方法容易地确定本文公开的给定化合物的剂量。
新化合物
在wo2014113191a1中的一系列化合物中公开了以下所示的化合物a-55和a-97。据报道，化合物a-55和a-97对hh信号通路的抑制活性(nih3t3-gre-luc的ic50)分别为5.5nm(参照vismodegib8.8nm，约1.6倍)和84nm(参照vismodegib45nm，约0.54倍)活性。然而，有文献报道去甲基化合物a-55易于在四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶环的c-5苄位的亚甲基上发生氧化代谢。该氧化代谢可能会导致生成二氢异喹啉样代谢物，从而可能引起毒性(dmd34：1310-1316,2006)。因此，需要在四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶环中封闭该氧化位点。
在一些情况下，本发明制备了式ii中所示的刺猬通路抑制剂：
或其药学上可接受的盐、立体异构体或溶剂化物，其中，
x、y和y’独立地为c1-3烷基、cd3、cf3、cn、卤化物或ome；
r2和r’2独立地为h、c1-3烷基、cd3或cf3，条件是r2和r’2中的至少一个不为h；
r1为-nrxry，其中rx和ry独立地为h、烷基、环烷基、烷基环烷基、c(o)r”，或-nrxry可以一起形成4-7元杂环，其中4-7元杂环为取代或未取代的；
r”为c1-5烷基；
w1、w2、w3、w4、w5、w6、w7、w8和w9独立地为h或d，并且
a是n或ch。
在一些情况下，本发明制备了式ii中所示的刺猬通路抑制剂：
或其药学上可接受的盐、立体异构体或溶剂化物，其中，
x、y和y’独立地为c1-3烷基、cd3、cf3、cn、卤化物或ome；
r2和r’2独立地为h、c1-3烷基、cd3或cf3，条件是r2和r’2中的至少一个不为h；
r1为-nrxry，其中rx和ry独立地为h、烷基、环烷基、烷基环烷基、c(o)r”，或-nrxry可以一起形成4-7元杂环，其中4-7元杂环为取代或未取代的；
r”为c1-5烷基；
w1、w2、w3、w4、w5、w6、w7、w8和w9独立地为h或d，并且
a是n或ch。
在一些情况下，本发明制备了式iv中所示的刺猬通路抑制剂：
或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中，
r2为h、c1-3烷基、cd3或cf3；
r1为-nrxry，其中rx和ry独立地为h、烷基、环烷基、烷基环烷基、c(o)r”，或-nrxry可以一起形成4-7元杂环，其中4-7元杂环为取代或未取代的；
r”为c1-5烷基；并且
w1、w2、w3、w4、w5、w6、w7、w8和w9独立地为h或d。
在一些情况下，本发明提供了制备式ii-iv化合物的方法。例如，下面的方案1描述了可用于制备式iv化合物的步骤。在一些情况下，中间体a中的硫代甲基可被氧化以产生甲磺酰基中间体，其可被nhrxry取代生成式iv的化合物。
方案1
在一些情况下，中间体a可以由中间体b和c之间的偶联反应制备，如下面的方案2所示。
方案2
在一些情况下，中间体c可以由中间体d的还原反应制备，如下面的方案3所示。
方案3
在一些情况下，当甲酸保持在约2mmol/ml至约3.5mmol/ml时，可以进行方案3的还原。在一些情况下，当中间体d保持在约0.1mmol/ml至约1.0mmol/ml时，可以进行方案3的还原。
在一些情况下，本发明公开了式iv的手性化合物，其在四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶环的c-5位包含r构型的手性碳。例如，表5中的化合物b1(见下文)比其外消旋对应物化合物b的活性高约三倍。在一些情况下，在体外细胞色素p450(cyp)抑制测定中显示外消旋化合物b(10μm)可表现出约52％的cyp-2c9抑制，而手性化合物b1(10μm)可表现出约26％的cyp-2c9抑制。与外消旋化合物b相比，手性化合物b1可能与cyp-2c9代谢的药物具有较少的药物-药物-相互作用(ddi)潜力。
在一些情况下，药代动力学实验可以显示，与外消旋化合物b相比，手性化合物b1的生物利用度可以加倍，约100％。此外，手性化合物b1相对于外消旋化合物b，曲线下面积(auc)测量也可以得到改善。
在一些情况下，在小鼠肿瘤模型中，在100mg/kg剂量下，外消旋化合物b可以阻止肿瘤生长。相反，在小鼠肿瘤模型中，手性化合物b可以随时间减小肿瘤的大小，并且在选择的情况下，可以大大减小肿瘤的大小接近无法识别其大小的水平。
在一些情况下，当与化合物a-55(化合物b1的去甲基类似物)相比时，手性化合物b1几乎可以使药物的生物利用度加倍，增加药物在动物体内的半衰期，提高auc。
药物组合物/制剂
一个实施方式提供药物组合物，其包含式ii-iv化合物、或其立体异构体、互变异构体、水合物、溶剂化物或药学上可接受的盐，和至少一种药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方式中，本发明提供了用于调节刺猬通路的方法。该方法包括给哺乳动物受试者施用治疗有效量的至少一种式ii-iv化合物。该方法包括治疗或预防基底细胞癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、神经胶质瘤、肝细胞癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、成神经管细胞瘤、多发性骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、上gi癌、食道癌、鼻咽癌、皮肤癌、骨癌、肾癌和肉瘤。
在一些实施方式中，将本文所述的化合物配制成药物组合物。使用一种或多种药学上可接受的非活性成分以常规方式配制药物组合物，所述非活性成分有助于将活性化合物加工成可以药学上使用的制剂。适当的配方取决于所选择的给药路径。本文所述的药物组合物的概述可见于例如remington:thescienceandpracticeofpharmacy,nineteenthed.,easton,pa.:mackpublishingcompany(1995)；hoover,johne.,remington’spharmaceuticalsciences,mackpublishingco.,easton,pennsylvania(1975)；liberman,h.a.andlachman,l.,eds.,pharmaceuticaldosageforms,marceldecker,newyork,n.y.(1980)；和pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems,seventhed.,lippincottwilliams&wilkins(1999)，上述公开内容通过引用并入本文。
本文所用的药物组合物是指式ii化合物与其他化学组分(即药学上可接受的非活性成分)的混合物，所述其他化学组分例如载体、赋形剂、粘合剂、填充剂、悬浮剂、调味剂、甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、润湿剂、增塑剂、稳定剂、渗透促进剂、润湿剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂或其一种或多种组合。药物组合物有助于将化合物给予至生物体。在实施本文提供的治疗方法或用途时，将治疗有效量的本文所述的化合物以药物组合物的形式给予患有待治疗的疾病、障碍或病症的哺乳动物。在一些实施方式中，哺乳动物是人。治疗有效量可以根据疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康状况、所用化合物的药效活性和其他因素而广泛变化。该化合物可单独使用或与一种或多种作为混合物组分的治疗剂组合使用。
通过适当的给药途径将本文所述的药物制剂给予受试者，所述给药途径包括但不限于口服、肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌肉内)、鼻内、口腔、局部、直肠或透皮给药途径。本文所述的药物制剂包括但不限于水性液体分散体、自乳化分散体、固体溶液、脂质体分散体、气溶胶、固体剂型、粉末、速释制剂、控释制剂、快速熔融制剂、片剂、胶囊、丸剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂、以及混合速释和控释制剂。
用于口服给药的所有制剂都处于适合于这种给药的剂量。这种剂量单位的实例是片剂或胶囊剂。在某些实施例中，这些物质含有大约1至2000毫克的活性成分，在大约1至500毫克之间有利地起作用，而且通常在5至150毫克之间。对于人或其他哺乳动物，合适的日剂量根据患者的状况和其他因素而广泛变化，但是，可以再次使用常规方法和实践来确定。
常规制剂技术包括，例如，一种方法或方法组合：(1)干混，(2)直接压制，(3)研磨，(4)干法或非水造粒，(5)湿法造粒，或(6)融合。其他方法包括例如喷雾干燥、锅包衣、熔融造粒、造粒、流化床喷雾干燥或涂覆(例如，wurster涂覆)、切向涂覆、顶部喷涂、压片、挤出等。
用于本文所述固体剂型的合适载体包括但不限于阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糖糊精、甘油、硅酸镁、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、钠氯化物、磷酸三钙、磷酸氢二钾、硬脂酰乳酸钠、角叉菜胶、甘油单酯、甘油二酯、预胶化淀粉、羟丙基甲基纤维素、乙酸羟丙基甲基纤维素硬脂酸酯、蔗糖、微晶纤维素、乳糖、甘露糖醇等。
用于本文所述固体剂型的合适填充剂包括但不限于乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉末、右旋糖、葡萄糖结合剂、葡聚糖、淀粉、预胶化淀粉、羟丙基甲基纤维素(hpmc)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素乙酸酯硬脂酸酯(hpmcas)、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、氯化钠、聚乙二醇等。
用于本文所述固体剂型的合适崩解剂包括但不限于天然淀粉，例如玉米淀粉或马铃薯淀粉、预胶化淀粉或淀粉乙醇酸钠；纤维素，例如甲基晶体纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、羧基纤维素(croscarmellose)；或交联纤维素，例如交联羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素或交联羧基纤维素；交联淀粉，例如羟乙酸淀粉钠；交联聚合物，例如交联聚维酮、交联聚乙烯吡咯烷酮；海藻酸盐，例如海藻酸或海藻酸的盐如海藻酸钠；树胶，例如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆、刺梧桐、果胶或黄芪胶；羟基乙酸淀粉钠、膨润土、十二烷基硫酸钠、组合淀粉中的十二烷基硫酸钠等。
粘合剂赋予固体口服剂型制剂凝聚性：对于填充粉末的胶囊制剂，它们有助于形成可以填充到软壳或硬壳胶囊中的栓塞，并且对于片剂制剂，它们确保片剂在压缩后保持完整并且有助于确保在压缩或填充步骤之前的混合均匀性。适合用作本文所述固体剂型中的粘合剂的材料包括但不限于羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸羟丙基甲基纤维素硬脂酸酯、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素和微晶纤维素、微晶右旋糖、直链淀粉、镁铝硅酸盐、多糖酸、膨润土、明胶、聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物、交联聚维酮、聚维酮、淀粉、预胶化淀粉、黄芪胶、糊精、糖(如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糖蜜、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、乳糖)、天然或合成树胶(如阿拉伯树胶、黄芪胶、印度胶，isapol皮的粘液)、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、落叶松阿拉伯半乳聚糖、聚乙二醇、蜡、海藻酸钠等。
通常，在填充粉末的明胶胶囊制剂中使用20-70％的粘合剂水平。无论是直接压片、湿法制粒、碾压还是使用其他赋形剂(如填料本身可以作为中等粘合剂)，片剂配方中的粘合剂用量水平各不相同。片剂配方中的粘合剂含量高达70％是常见的。
用于本文所述固体剂型的合适润滑剂或助流剂包括但不限于硬脂酸、氢氧化钙、滑石、玉米淀粉、硬脂酰富马酸钠、碱金属和碱土金属盐(例如铝盐、钙盐、镁盐、锌盐)、硬脂酸、硬脂酸钠、硬脂酸镁、硬脂酸锌、蜡、
用于本文所述固体剂型的合适稀释剂包括但不限于糖(包括乳糖、蔗糖和右旋糖)，多糖(包括葡聚糖和麦芽糖糊精)，多元醇(包括甘露醇、木糖醇和山梨糖醇)，环糊精等。
用于本文所述固体剂型的合适润湿剂包括，例如，油酸、单硬脂酸甘油酯、单油酸山梨糖醇酯、单月桂酸脱水山梨糖醇酯、油酸三乙醇胺、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯、季铵化合物(例如，polyquat
用于本文所述固体剂型的合适的表面活性剂包括，例如，十二烷基硫酸钠、脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、聚山梨醇酯、伯洛沙姆(polaxomers)、胆汁盐、单硬脂酸甘油酯、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物，例如
用于本文所述固体剂型的合适悬浮剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮，例如聚乙烯吡咯烷酮k12、聚乙烯吡咯烷酮k17、聚乙烯吡咯烷酮k25或聚乙烯吡咯烷酮k30，聚乙二醇，例如聚乙二醇可以具有约300至约6000、或约3350至约4000、或约7000至约5400的分子量，乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(s630)，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，聚山梨醇酯-80，羟乙基纤维素，海藻酸钠，树胶类，例如黄芪胶和阿拉伯树胶、瓜尔胶，黄原胶类，包括黄原胶，糖，纤维素，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素，聚山梨醇酯-80，海藻酸钠，聚乙氧基化脱水山梨糖醇单月桂酸酯，聚乙氧基化脱水山梨糖醇单月桂酸酯，聚维酮等。
本发明的方法包括使用至少一种式ii-iv化合物，其在多种细胞、组织和器官的修复和/或功能性能的调节中抑制刺猬信号，并具有以下治疗和化妆品应用：神经组织的调节，骨和软骨的形成和修复，精子发生的调节，平滑肌的调节，来自原始肠道肺、肝和其他器官的调节，造血功能的调节，皮肤和头发生长的调节。因此，本发明的方法和组合物包括本发明的抑制剂的用途，可能涉及用于刺猬蛋白的抑制剂的所有这些用途。此外，本发明方法可以在培养物(体外)或整个动物细胞(体内)提供的细胞上进行。
以下提供的实施例和制备说明并例示了本文所述的化合物和制备这些化合物的方法。通常，本文所述的化合物可通过一般化学领域中已知的方法制备。
本发明化合物可以使用各种合成路线(包括下文描述的那些)从市售材料开始制备。本发明的原料是已知的、可商购的、或者可以类似于或根据本领域已知的方法合成。许多原料可以根据已知方法制备，特别是可以使用实施例中描述的方法制备。在合成原料时，在某些情况下，官能团在必要时用合适的保护基团保护。可以根据本领域已知的方法除去官能团。
材料和方法
所有试剂和溶剂均在商业上获得。需要时，所有试剂和溶剂均通过标准技术纯化：通过蒸馏从钠中纯化四氢呋喃。所有薄层色谱(tlc)分析在硅胶(青岛海洋化学有限公司)上进行，并且通过在254nm的紫外分析仪和i2蒸气或磷钼酸显示斑点。如图所示，使用varianunityinova400nb光谱仪在400mhz下记录所有核磁共振光谱，或使用varianvnmrs光谱仪在300mhz下记录所有核磁共振光谱。使用agilent1100系统用ageladurashellc183.5μm4.6×50mm柱运行lc-ms。在指定的运行时间内使用0.1三氟乙酸/水和乙腈以梯度5/95至95/5进行梯度运行。
现将详细描述本发明的技术方案，以便更清楚地理解本发明的技术特征、目的和优点，但不应解释为限制本发明的范围。如果没有特别说明，以下实施例中描述的实验方法是常规方法；除非另有说明，试剂和材料是可商购的。使用的溶剂和药物是分析纯或化学纯；在使用前将溶剂再蒸馏；按照标准方法或记载的方法处理无水溶剂。柱层析硅胶(100～200目)和薄层层析硅胶(gf254)是青岛海洋化工厂和烟台化工厂的产品。如果没有规定，洗脱液是石油醚(60℃～90℃)/乙酸乙酯(v/v)；显色试剂为碘或磷钼酸-乙醇溶液；所有萃取溶剂用无水na2so4干燥。在bruck-400核磁共振仪上记录1h-nmr，并将tms用作内标。lc-ms使用高效液相色谱-离子阱质谱仪(lc-msdtrap)记录，二极管阵列检测器(dad)，214nm和254nm的检测波长，离子阱质谱(esi)。hplc柱为ageladurashellc18(4.6×50mm，3.5μm)；流动相为0.1％nh4hco3水溶液：乙腈(5分钟内5:95至95：5)；流速为1.8毫升/分钟。
实施例1
本实施例提供一种r构型的具有刺猬通路拮抗活性的手性杂环化合物(b1)。该化合物是通过如下方法制备得到的：
1)中间体b1-2的合成：
将b1-1(4.3g,14.576mmol)溶于40ml的四氢呋喃中，在-60℃下加入甲基氯化镁(在thf中3.0m，5.3ml，15.9mmol)的溶液。反应2小时后，将反应混合物加水(30ml)淬灭，用乙酸乙酯萃取(30ml×3)，有机相无水硫酸钠干燥浓缩。剩余物溶于20ml二氯甲烷和10ml三氟乙酸中，反应液在室温下搅拌5小时。旋出溶剂，加入10ml水。用饱和碳酸氢钠将系统的ph调节到8-9。水相用二氯甲烷(20ml×3)萃取干燥，浓缩后柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝4:1)得到黄色固体b1-2(1.7g，60％)。b1-2的nmr数据如下：
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)8.50(s,1h),3.85(t,j＝6.8hz,2h),2.82(t,j＝7.2hz,2h),2.60(s,3h),2.37(s,3h)。
2)中间体b1-3的合成：
将(1s,2s)-(+)-n-对甲苯磺酰基-1,2-二苯基乙二胺(209mg，0.57mmol)和二氯(对甲基异丙苯)钌(ii)二聚体(174mg，0.28mmol)加入到250ml的烧瓶中，在氮气保护下加入三乙胺(2.3g，22.8mmol)和甲酸(2.6g，56.5mmol)的乙腈(20ml)溶液。搅拌10分钟后将中间体b1-2(2.2g，11.4mmol)的乙腈(40ml)溶液加入。反应液在室温下搅拌过夜。加10ml水淬灭反应，用饱和碳酸氢钠调节ph到8。旋出乙腈后加入二氯甲烷(40ml×5)，有机相合并干燥。浓缩后柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝100：1到50：1)得到粗产物(1.4g)。将粗产物溶于20ml甲醇中并加入d(-)-酒石酸(1.4g，9.3mmol)的甲醇溶液(15ml)。在70℃下回流10小时，室温下过滤。固体用甲醇重结晶，得到中间体b1-3的d-酒石酸盐(1.1g)。单晶衍射测试的结果如图1所示，确定其构型为r构型。
将所得的中间体b1-3的d-酒石酸盐溶于水(10ml)，调节ph到8。水相用二氯甲烷(30ml×5)萃取，干燥浓缩后得到b1-3(483mg，21％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)8.29(s,1h),4.14(q,j＝6.7hz,1h),3.42～3.35(m,1h),3.15～3.09(m,1h),3.01～2.93(m,1h),2.87～2.80(m,1h),2.55(s,3h),1.51(d,j＝6.4hz,3h)。
3)中间体b1-5的合成：
将中间体b1-3(130mg，0.67mmol)、b1-4(168mg，0.67mmol)和叔丁醇钠(128mg,1.33mmol)溶于10ml甲苯中，在氮气保护下加入pd(dba)2(38mg，0.067mmol)和binap(42mg,0.067mmol)。反应液在120℃下搅拌过夜。冷却后将反应溶液过滤。滤液浓缩后柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝5：1)得到黄色油状物b1-5(50mg,18％)。
4)产物b1的合成：
在50ml的封管中加入中间体b1-5(35mg，0.085mmol)和2ml叔丁醇，然后加入过硫酸氢钾复合盐(65mg，0.21mmol)反应5小时。将4-羟基哌啶(86mg，0.85mmol)溶于5ml叔丁醇加入反应，并加热到90℃反应过夜。冷却后将溶剂旋干，加入盐水(20ml)，用乙酸乙酯(10ml×3)萃取。有机相合并干燥，浓缩后柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)得到白色固体(11mg，24％)b1。其结构式为
b1的1hnmr数据如下：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)8.35(s,1h),8.21(s,1h),8.10(s,1h),7.43(s,1h),6.60(s,1h),5.35(s,1h),4.47～4.31(m,3h),3.98～3.88(m,1h),3.45～3.36(m,1h),3.30～3.24(m,2h),2.93～2.85(m,1h),2.78～2.72(m,1h),2.38(s,3h),2.18(s,3h),2.00～1.90(m,2h),1.54～1.50(m,2h),1.42(d,j＝6.8hz,3h)；ee＝97％；[α]25.9d＝-50.0(c＝0.5,chcl3)。
实施例2
本实施例提供一种s构型的具有刺猬通路拮抗活性的手性杂环化合物(b1)。该化合物是通过如下方法制备得到的：
1)中间体b2-2的合成：
将b2-1(1.8g，8.9mmol)、钛酸四乙酯(6g，26mmol)和s-叔丁基亚磺酰胺(2.14g，17.7mmol)溶于无水二氧六环(40ml)中，并且加热到90℃反应2小时。反应液冷却到室温除去溶剂。剩余物用乙酸乙酯(150ml)稀释，然后加少量的水淬灭。通过过滤将固体除去，滤液浓缩后得到中间体b2-2直接用于下一步。中间体b2-2的1hnmr数据如下：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)8.51(s,1h),2.76(s,3h),2.60(s,3h),1.31(s,9h)。
2)中间体b2-3的合成：
将中间体b2-2(500mg，1.6mmol)溶于无水四氢呋喃(25ml)中，在0℃下缓慢加入三叔丁氧基氢化铝锂(1.245g，4.9mmol)。在此温度下继续反应40分钟。用水淬灭反应，加乙酸乙酯(50ml)稀释，过滤。滤液用硫酸钠干燥，浓缩后柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)得到黄色油状物b2-3(220mg,43％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)8.54(s,1h),4.85～4.78(m,1h),3.77(s,1h),2.56(s,3h),1.58(d,j＝6.4hz,3h),1.24(s,9h)。
3)中间体b2-4的合成：
将中间体b2-3(21mg，0.018mmol)、对苯二甲酸钾(72mg，0.54mmol)、四三苯基膦钯(21mg，0.018mmol)和氟化铯(108mg，0.71mmol)加入到二氧六环(10ml)和水(2ml)的混合溶剂中。反应液在氮气保护下加热到105℃并反应2小时。将反应溶液冷却到室温过滤，滤液用乙酸乙酯(40ml)稀释。有机相用饱和食盐水洗涤后干燥。浓缩后柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)得到黄色油状物b2-4(100mg，93％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)8.56(s,1h),7.08～7.01(m,1h),6.74～6.70(m,1h),5.74～5.71(m,1h),4.84～4.77(m,1h),3.41(s,1h),2.59(s,3h),1.57(d,j＝6.4hz,3h),1.23(s,9h)。
4)中间体b2-5的合成：
将中间体b2-4(330mg，1.1mmol)溶于4ml的乙酸乙酯中，并加入2m氯化氢的乙酸乙酯(2ml)溶液。反应液在室温下搅拌5小后旋出溶剂，将剩余物溶于水(10ml)，然后加入碳酸钾(305mg，2.2mmol)和碘化钾(183mg，1.1mmol)，反应液在100℃下搅拌16小时，反应液用二氯甲烷(20ml×4)萃取，合并有机相干燥，浓缩后得到黄色油状物b2-5(88mg，40％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)8.30(s,1h),4.20～4.13(m,1h),3.44～3.37(m,1h),3.18～3.10(m,1h),3.04～2.96(m,1h),2.91～2.82(m,1h),2.55(s,3h),1.53(d,j＝6.4hz,3h)。
5)中间体b2-6的合成：
将中间体b2-5(88mg，0.45mmol)、b1-4(137mg，0.54mmol)和叔丁醇钠(86mg,0.90mmol)溶于10ml甲苯中，在氮气保护下加入pd(dba)2(26mg,0.045mmol)和binap(28mg,0.045mmol)，反应液在120℃下搅拌过夜。冷却后将反应液过滤。滤液浓缩后柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)得到黄色油状物b2-6(40mg,21％)，其1hnmr数据如下：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)8.36(s,1h),8.32(s,1h),8.22(s,1h),7.43(s,1h),6.64(s,1h),5.54(s,1h),4.41～4.33(m,1h),3.46～3.39(m,1h),3.07～2.98(m,1h),2.94～2.86(m,1h),2.56(s,3h),2.38(s,3h),2.18(s,3h),1.48(d,j＝6.8hz,3h)。
6)产物b2的合成：
在50ml的封管中加入中间体b2-6(40mg，0.1mmol)和10ml叔丁醇，然后加入过硫酸氢钾复合盐(76mg，0.25mmol)反应5小时。将4-羟基哌啶(40mg，0.4mmol)加入并加热到90℃反应过夜。冷却后将溶剂旋干，加入盐水(20ml)，用乙酸乙酯(20ml×3)萃取。有机相合并干燥，浓缩后柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1到1:1)得到白色固体(11mg，24％)b2，其1hnmr数据如下：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.35(s,1h),8.21(s,1h),8.10(s,1h),7.42(s,1h),6.61(s,1h),5.35(s,1h),4.48-4.38(m,2h),4.35-4.27(m,1h),3.99-3.87(m,1h),3.50-3.36(m,1h),3.32-3.21(m,2h),2.96-2.84(m,1h),2.79-2.70(m,1h),2.37(s,3h),2.18(s,3h),1.99-1.90(m,2h),1.54-1.48(m,2h),1.43(d,j＝6.8hz,3h)；97％ee；[α]26.7d＝+54.0(c＝0.2,chcl3)。
实施例3
在本实施例中，对实施例1-2所得的化合物b1和b2以及相应的外消旋化合物进行nih3t3-gre-luc荧光素酶报告基因检测实验，验证所得化合物对刺猬通路的阻断效果。
将nih3t3细胞(crl-1658,atcc)在含有10％fbs(hyclone)的dmem(gibico)中培养。gre-luc质粒经由8×gli-1响应元素植入pgl4.26载体(promega)的多克隆位点获得。在用gre-luc荧光素酶报告质粒转染后，通过潮霉素(invitrogen)选择建立nih3t3-gre-luc报道细胞系。单克隆经过重组声波刺猬(shh)蛋白或小分子激动剂sag(abin629346)验证。被选择的克隆用于检测hh信号。
将nih3t3-gre-luc细胞在完全培养基(具有4mml-gln、1.5g/l碳酸氢钠和4.5g/l葡萄糖、补充有100μg/ml潮霉素和10％fbs的dmem)中培养。当汇合时，将细胞用胰蛋白酶消化并重悬于测定培养基(含0.5％血清的dmem)中。将100μl/孔的细胞悬浮液加入96孔板(最终细胞浓度为15,000个细胞/孔)后，将细胞再培养48小时，然后加入化合物。
将化合物在dmso中连续稀释，并用测定培养基进一步稀释。在一个实施方式中，在测定培养基中加入10nmsag作为hh信号的激动剂。制备化合物和激动剂后，小心地除去培养基。将100μl含有化合物和激动剂的测定培养基小心地加入细胞中。将细胞板在37℃下再孵育48小时。
在孵育48小时后，将40μl/孔的荧光素酶培养基(brigh-glo，promega)加入细胞中。将板在室温下温和振荡培养5分钟。用平板读数器(pherastarfs，bmg)测量发光信号。基于对发光信号的抑制来计算化合物的活性。
在本实施例中，依照上述的nih3t3-gre-luc荧光素酶报告基因检测实验，对实施例中的化合物b1和b2以及外消旋化合物b的生物活性进行测定。使用小分子smo拮抗剂gdc-0449为对照药物。结果如下表1及图2-4所示。
表1
结果表明，s构型的化合物b2对hh通路抑制活性相对较差，对治疗与hh信号通路相关的疾病并不重要。r构型的化合物b1是最优化合物，其对hh通路抑制活性相较于外消旋化合物b提高了3倍，优于s构型的化合物b2二十倍。与外消旋化合物b和s构型的化合物b2相比，r构型的化合物b1可以更好地抑制hh信号通路，从而对与hh信号通路相关的疾病有更好的治疗应用前景，并且可以避免因为存在s构型化合物b2带来的潜在的副作用风险。
实施例4
在本实施例中，对实施例1所得的r构型化合物b1以及外消旋化合物b进行cyp肝酶抑制实验，以评价r构型的化合物b1与消旋化合物b的体外安全性。
实验操作：
五个主要cyp同工酶和它们各自的探针底物为：cyp-1a2(非那西丁(phenacetin)，30μm)，cyp-2c9(甲苯磺丁脲，100μm)，cyp-2c19(40μm)，cyp-2d6(右美沙芬(dextromethorphan)，5μm)和cyp-3a4(咪达唑仑(midazolam)，1μm)。所有探针都是在接近或低于其kms浓度使用。混合物(200μl)在37℃的恒温水浴锅里进行孵育，该混合物含有hlm(0.2mg/ml)，磷酸盐缓冲液(100mm，ph7.4)，nadph(1μm)，试验化合物(10μm)和各自的cyp探针底物。在与nadph的反应之前，将混合物预孵育10分钟，进行抑制剂-酶相互作用。之后在特定的时间段(cyp-1a2，2d6和3a4为10分钟；cyp-2c9和2c19为30分钟)，反应后通过加入到100μl含有适量冷乙腈的溶液进行淬灭。然后将反应体系离心并将待测样品注入lc-ms/ms来定量分析底物与cyp酶形成特定代谢物的浓度。每个待测化合物至少独立地完成三次测试。实验结果如下表2所示。
表2
结果表明，在五个主要cyp同工酶中，r构型化合物b1和外消旋化合物b对其中的4个的抑制率都相差不大。但是b在10μm浓度时对cyp-2c9的抑制率超过50％，具有潜在的药物-药物作用风险，而r构型化合物b1在10μm浓度时对cyp-2c9的抑制率为26％，表现出很好的安全性。
实施例5
在本实施例中，对实施例1所得的r构型化合物b1、相应的外消旋化合物b以及专利wo2014113191a1中公开的去甲基类似物进行药物代谢实验，以测试这些药物的药代动力学性质。
具体实验操作：
雄性sprague-dawley鼠(体重：220g-250g)购买于slaclaboratoryanimals(上海)。所有化合物的浓度都是1mg/ml，静脉给药是对于尾部注射给药剂量为1ml/kg；口服给药量是10ml/kg。通过眼眶后取血，所取血样置于含有edta(作为抗凝剂)的管中，经冷冻离心机离心后储存于-80℃的环境中。取(25μl倍数的)血样，往其中加入含内标的冷的乙腈(100μl)。离心10分钟使血浆蛋白沉淀。最后取上清液(10μl)注入lc-ms/ms系统中用于分析。
lc-ms/ms分析方法：所有样品均通过api4000qtrap质谱仪的lc-ms/ms系统进行分析，该仪器配有lc-20ad与cbm-20a控制器，dgu-20a溶剂脱气泵和sil-20a自动进样器(日本岛津，哥伦比亚，md，usa)。博纳艾杰尔(bonna-agela)venusilxbpc18柱(50×2.1mm；填料为5微米颗粒度)被用作hplc分离。柱温保持在40℃。流速为0.3ml/min，总运行时间为6分钟。
对于ms/ms的定量，所述api4000qtrap质谱仪在配有多个反应监测(mrm)的esi正模式下进行操作。所有化合物和内标设置为100毫秒的停留时间进行监测。其他的ms/ms参数设置如下：在30psi下雾化气(gs1)，涡轮气压为55磅，离子喷雾电压为4500v，离子源温度为500℃。对于选定的离子的过渡，每个待测物在最佳灵敏度的分簇电势(dp)和碰撞能量(ce)下进行测试的。最后使用absciexanalysist1.5.2数据收集和集成软件对数据进行收集和处理的。
实验所得结果如下表3和图5、图6所示：
表3
结果表明，相较于外消旋化合物b，r构型的化合物b1曲线下面积高了将近一倍，生物利用度也从53％提高到了100％。这个实验数据表明，与外消旋化合物b相比，在动物体内r构型的化合物b1的吸收率更高，在相同剂量下，r构型的化合物b1在动物体内的血浆浓度持续得更加平稳，持续时间也更长。口服剂量为10mg/kg时，r构型的化合物b1在8小时后的血浆浓度为623ng/ml，经分子量换算后为1340nm，是其ic50(0.8nm)的1675倍，扣除血浆蛋白结合，还能很好地发挥其抑制hh通路的作用。而外消旋化合物b在8小时后的血浆浓度为83ng/ml，经分子量换算后为178nm，是其ic50(2.7nm)的66倍，再扣除血浆蛋白的结合，就没有足够的血浆浓度抑制hh通路了。与去甲基类似物a-55相比，手性化合物b1的生物利用度高了将近一倍；半衰期增加；并且药物暴露(曲线下面积auc)显着增加。因此药代动力学实验结果表明，与去甲基类似物和外消旋化合物相比，r构型的化合物b1可以更好、更持久地抑制hh信号通路，从而对与hh信号通路相关的疾病有更好的治疗应用前景。
实施例6
在本实施例中，对实施例1所得的r构型化合物b1以及相应的外消旋化合物b进行小鼠抑瘤模型实验，以测试r构型的化合物b1和外消旋化合物b抑制hh通路相关肿瘤的效果。
具体实验操作：
patched(ptch)+/-,p53-/-的小鼠的原代髓母细胞瘤的肿瘤细胞皮下注射到scid小鼠的右侧。植入后约7天，当肿瘤体积平均长至200mm3开始治疗。动物随机分为空白组、化合物b给药组和化合物b1给药组。化合物b1和外消旋化合物b的剂量为100mg/kg/天。肿瘤体积(m3)和体重(g)每两天记录一次。给药14天后处死小鼠，取出肿瘤。实验结果如图7和图8所示。
在100mg/kg的剂量下，外消旋化合物b只能使肿瘤不再生长，而b1可以使肿瘤体积缩小至近乎消失。实验结果表明，r构型的化合物b1具有更加突出、意想不到的抗肿瘤作用。
由上述实施例可见，本发明实施例1的手性化合物b1能够阻断刺猬通路，从而能够抑制细胞异常增长，阻断肿瘤细胞转移再生。相较于外消旋化合物b，手性化合物b1具有更优的抑制hh通路的活性、更优的安全性、更优的生物利用度。在活体内，手性化合物b1具有更突出的、意想不到的抑制细胞异常增长、阻断肿瘤细胞转移再生的效果，具有更好的治疗肿瘤的应用前景。
合成
实施例7：(r)-1-(6-(5'-氯-3,5-二甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)-5-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-基)哌啶-4-醇(b1)的制备
合成路线a：
5-甲基-2-(甲硫基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶(b1-2)。
在n2气氛下，在-60℃下，将甲基氯化镁(3.0m的thf溶液，5.3ml，15.9mmol)滴加到2-(甲硫基)-5-氧代-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(化合物b1-1，4.3g，14.576mmol)的thf(40ml)中。在相同温度下搅拌2小时后，将反应混合物用盐水(30ml)淬灭。过滤得到混合物，滤液用etoac(30ml×3)萃取。将合并的有机层用na2so4干燥，并过滤。减压浓缩滤液。将残余物溶于20mlch2cl2中，并加入tfa(10ml)。将混合物在室温下搅拌5h并减压浓缩。通过加入饱和nahco3水溶液将残余物调节至ph8-9并用ch2cl2(30ml×3)萃取。将合并的有机层用na2so4干燥，并过滤。滤液浓缩后柱层析纯化(石油醚/etoacv：v＝1/3)得到化合物b1-2，黄色固体(1.7g，60％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)8.50(s,1h),3.85(t,j＝6.8hz,2h),2.82(t,j＝7.2hz,2h),2.60(s,3h),2.37(s,3h)。
(r)-5-甲基-2-(甲硫基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶(b1-3)。
(1s,2s)-(+)-n-(4-甲苯磺酰基)-1,2-二苯基乙二胺(209mg，0.571mmol)和二氯(对甲基异丙苯)钌(ii)二聚体(174mg，0.284mmol)装入圆底烧瓶(250ml)中。然后在n2气氛下加入tea(2.3g，22.772mmol)和甲酸(2.6g，56.522mmol)的乙腈(20ml)溶液，将混合物在室温下搅拌10分钟。加入5-甲基-2-(甲硫基)-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶(2.2g，11.4mmol)的乙腈(40ml)溶液，在n2气氛下在室温下搅拌该混合物过夜。将反应溶液用水(10ml)淬灭并通过加入饱和nahco3水溶液调节至ph8-9。减压浓缩混合物以除去大部分乙腈，并用ch2cl2(40ml×5)萃取。将合并的有机层用na2so4干燥，并过滤。滤液浓缩后柱层析纯化(ch2cl2/meohv：v＝100/1至50/1)得到棕色固体(1.4g，ee＝60％)，将该固体溶解于20mlmeoh中，然后在70℃下加入d-酒石酸(1.4g，9.333mmol)的meoh(5ml)溶液。混合物在相同温度下搅拌2小时。通过过滤分离所得沉淀物并用meoh(5ml)洗涤。将固体加入到15mlmeoh中，并在70℃下搅拌10小时。冷却至室温后，过滤悬浮液。将固体加入到meoh(15ml)中，并再次在70℃下搅拌10h。将反应冷却至室温并过滤，得到作为d-酒石酸盐的白色固体(1.2g)，将其溶于10ml水中，并通过加入饱和nahco3水溶液调节至ph8-9。用ch2cl2(30ml)萃取水溶液。将合并的有机层用na2so4干燥，并过滤。减压浓缩滤液，得到化合物b1-3(483mg，22％)，白色固体。
(r)-6-(5'-氯-3,5-二甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)-5-甲基-2-(甲硫基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶(b1-5)
将(r)-5-甲基-2-(甲硫基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶(130mg,0.67mmol)，2',5'-二氯-3,5-二甲基-2,4'-联吡啶(b1-4,168mg,0.0.67mmol)，叔丁醇钠(128mg,1.33mmol)，pd(dba)2(38mg,0.07mmol)和binap(42mg,0.07mmol)的甲苯(10ml)溶液在n2气氛下在120℃下反应过夜。冷却至室温后，过滤反应混合物，滤液用ch2cl2(20ml)洗涤。滤液浓缩后柱层析纯化(石油醚/etoacv：v＝5/1)纯化残余物，得到化合物b1-5，黄色油状物(50mg,18％)
(r)-1-(6-(5'-氯-3,5-二甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)-5-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-基)哌啶-4-醇(b1)
向10ml密封管中加入(r)-6-(5'-氯-3,5-二甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)-5-甲基-2-(甲硫基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶(化合物b1-5，50mg，0.12mmol)和t-buoh(5ml)。在室温下缓慢加入过硫酸氢钾(oxone)(93mg，0.30mmol)的h2o(1ml)溶液，并搅拌5小时。然后将4-羟基哌啶(61mg，0.61mmol)加入到反应溶液中，并将混合物在90℃下搅拌36小时。除去溶剂后，将残余物用饱和食盐水(20ml)淬灭并用etoac(20ml×3)萃取。将合并的有机层用na2so4干燥。滤液浓缩后柱层析纯化(石油醚/etoacv：v＝1/1)得到化合物b1，黄色固体(15mg，26％)。
实施例8：(s)-1-(6-(5'-氯-3,5-二甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)-5-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-基)哌啶-4-醇(b2)的制备
合成路径b：
(s,e)-n-(1-(4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-5-基)亚乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰基(b2-2)。
1-(4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-5-基)乙-1-酮(化合物b2-1,1.8g，8.87mmol)，ti(oet)4(6g，26.32mmol)和(s)-(-)-2-甲基-2-丙烷亚磺酰胺(2.14g,17.69mmol)在1,4-二氧六环(40ml)中的混合物在n2气氛下在90℃下反应2小时。将反应冷却至室温并减压浓缩。向残余物中加入150ml乙酸乙酯(etoac)，然后在搅拌下加入h2o(1ml)。将得到的混合物在室温下搅拌0.5小时，然后过滤。将滤液用na2so4干燥，并过滤。滤液浓缩后柱层析纯化(石油醚/etoac，v：v＝3/1)得到化合物b2-2，为红色油状物(1.9g，70％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)8.51(s,1h),2.76(s,3h),2.60(s,3h),1.31(s,9h)。
(s)-n-((s)-1-(4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-5-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰基(b2-3)。
在0℃下向(s,e)-n-(1-(4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-5-基)亚乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰基在25ml干燥的thf的溶液中分批加入lialh[oc(ch3)3]3(1.24g,4.9mmol)，并将混合物在相同温度下搅拌40分钟。然后混合物用h2o(1ml)处理，并在减压下浓缩以除去大部分的thf。向残余物中加入etoac(40ml)，并将混合物在室温下搅拌0.5小时。过滤，滤液用na2so4干燥，过滤。滤液浓缩后柱层析纯化(石油醚/etoacv：v＝5/1)得到化合物b2-3，黄色油状物(220mg，43％)。
(s)-2-甲基-n-((s)-1-(2-(甲硫基)-4-乙烯基嘧啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰基(b2-4)。
将(s)-n-((s)-1-(4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-5-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰基(110mg,0.36mmol)、乙烯基三氟硼酸钾(72mg，0.54mmol)、pd(pph3)4(21mg,0.018mmol)和csf(108mg,0.71mmol)在1,4-二氧六环(10ml)和水(2ml)的混合溶液中的混合物n2气氛下105℃下反应2小时。将反应冷却至室温并减压浓缩以除去1,4-二氧六环。将残余物用etoac(40ml)稀释，并用饱和食盐水(20ml)洗涤。将有机层用na2so4干燥，并过滤。滤液浓缩后柱层析纯化(石油醚/etoacv：v＝5/1)得到化合物b2-4，黄色油状物(100mg，93％)。
(s)-5-甲基-2-(甲硫基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶(b2-5)。
向(s)-2-甲基-n-((s)-1-(2-(甲硫基)-4-乙烯基嘧啶-5-基)乙基)丙烷-2-亚磺酰基(330mg,1.1mmol)的etoac(4ml)溶液中加入2nhcl(4mmol)的etoac(2ml)溶液。将混合物在室温下搅拌5小时并减压浓缩。将残余物溶于水(10ml)中，然后加入k2co3(305mg，2.2mmol)和ki(183mg，1.1mmol)。混合物在100℃下搅拌过夜。冷却至室温后，过滤。滤液用ch2cl2(20ml×4)萃取。合并的有机层用na2so4干燥，并过滤。浓缩得到化合物b2-5，黄色油状物(88mg，0.451mmol，40％)。
(s)-6-(5'-氯-3,5-二甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)-5-甲基-2-(甲硫基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶(b2-6)
(s)-5-甲基-2-(甲硫基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶(88mg,0.45mmol)、2',5'-二氯-3,5-二甲基-2,4'-联吡啶(137mg,0.54mmol)、叔丁醇钠(86mg,0.9mmol)、双(二亚苄基丙酮)钯(0)(pd(dba)2,26mg,0.045mmol)和2,2′-双(二苯基膦基)-1,1′-联二萘(binap,28mg,0.045mmol)在甲苯(10ml)中n2气氛下120℃反应过夜。冷却至室温后，过滤反应混合物并用ch2cl2(20ml)洗涤。滤液浓缩后柱层析纯化(石油醚/etoacv/v＝5/1)得到化合物b2-6，黄色油状物(40mg，21％)。
(s)-1-(6-(5'-氯-3,5-二甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)-5-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-基)哌啶-4-醇(b2)。
向10ml密封管中加入(s)-6-(5'-氯-3,5-二甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)-5-甲基-2-(甲硫基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶(40mg,0.1mmol)和t-buoh(5ml)。在室温下缓慢加入过硫酸氢钾(75mg，0.25mmol)的h2o(1ml)溶液，并搅拌5小时。然后将4-羟基哌啶(40mg，0.4mmol)加入到反应溶液中，混合物在90℃下搅拌过夜。除去溶剂后，将残余物用盐水(20ml)淬灭并用etoac(20ml×3)萃取。合并的有机层用na2so4干燥，并过滤。滤液浓缩后柱层析纯化(石油醚/etoacv/v＝1/1)得到化合物b2，黄色固体(11mg，24％)。
实施例9：(5s)-6-[5-氯-4-(3,5-二甲基-2-吡啶基)-2-吡啶基]-n-环丙基-5-甲基-7,8-二氢-5h-吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺(b3)的制备
合成路径c：
(s)-6-(5'-氯-3,5-二甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)-n-环丙基-5-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺(b3)。
向10ml密封管中加入(s)-6-(5'-氯-3,5-二甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)-5-甲基-2-(甲硫基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶(化合物b2-6，40mg，0.1mmol)和t-buoh(5ml)。在室温下缓慢加入过硫酸氢钾(75mg，0.25mmol)的h2o(1ml)溶液，搅拌5小时。然后将环丙胺(57mg，1.0mmol)加入到反应溶液中，并将混合物在90℃下搅拌36小时。除去溶剂后，将残余物用饱和食盐水(20ml)淬灭并用etoac(20ml×3)萃取。合并的有机层用na2so4干燥，并过滤。滤液浓缩后柱层析纯化(石油醚/etoacv/v＝2/1至1/1)得到化合物b3，黄色固体(14mg，34％)。
实施例10：(r)-6-(5'-氯-3,5-二甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)-n-环丙基-5-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺(b4)
合成路径d：
(r)-6-(5'-氯-3,5-二甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)-n-环丙基-5-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺(b4)。
向10ml密封管中加入(r)-6-(5'-氯-3,5-二甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)-5-甲基-2-(甲硫基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶(化合物b1-5，35mg，0.08mmol)和t-buoh(5ml)。在室温下缓慢加入过硫酸氢钾(65mg，0.21mmol)的h2o(1ml)溶液，并搅拌5小时。然后将环丙胺(48mg，0.85mmol)加入到反应溶液中，混合物在90℃下搅拌36小时。除去溶剂后，将残余物用饱和食盐水(20ml)淬灭并用etoac(20ml×3)萃取。合并的有机层用na2so4干燥，并过滤。滤液浓缩后柱层析纯化(石油醚/etoacv/v＝2/1至1/1)得到化合物b4，黄色固体(7mg，20％)。
实施例11：(r)-n-(6-(5'-氯-3,5-二甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)-5-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-基)丙酰胺(b5)的制备。
合成路径e：
(r)-6-(5'-氯-3,5-二甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)-5-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺(b5-1)。
向45ml密封管中加入(r)-6-(5'-氯-3,5-二甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)-5-甲基-2-(甲硫基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶(化合物b1-5，550mg，1.3mmol)和t-buoh(20ml)。在室温下缓慢加入过硫酸氢钾(820mg，2.6mmol)的h2o(5ml)溶液，并搅拌5小时。然后将nh4oh(25-28％，3ml)加入到反应溶液中，并将混合物在90℃下搅拌36小时。除去溶剂后，将残余物用饱和食盐水(20ml)淬灭并用etoac(20ml×3)萃取。将合并的有机层用na2so4干燥，并过滤。滤液浓缩后柱层析纯化(石油醚/etoacv/v＝1/1至2/1)得到化合物b5-1，黄色固体(200mg，39％)。
(r)-n-(6-(5'-氯-3,5-二甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)-5-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-基)丙酰胺(b5)。
向(r)-6-(5'-氯-3,5-二甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)-5-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺(b5-1，50mg，0.13mmol)和三乙胺(141mg,1.4mmol)的10mlch2cl2溶液中加入丙酰氯(120mg,1.3mmol)。将混合物在室温下搅拌5小时。反应完成后，将混合物用饱和食盐水(20ml)处理并用ch2cl2(30ml)萃取。浓缩有机层，残余物溶于10mlthf中。然后加入nh4oh(25-28％，2ml)。将得到的混合物在室温下搅拌过夜。将反应用饱和食盐水(20ml)稀释，并用etoac(15ml×3)萃取。将合并的有机层用na2so4干燥，并过滤。滤液浓缩后柱层析纯化(石油醚/etoacv/v＝1/1)得到化合物b5，白色固体(20mg，35％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)8.38(s,1h),8.35(s,1h),8.22(s,1h),8.04(s,1h),7.43(s,1h),6.64(s,1h),5.62-5.50(m,1h),4.41-4.38(m,1h),3.46-3.39(m,1h),3.07-2.98(m,1h),2.90-2.86(m,1h),2.80-2.66(m,2h),2.38(s,3h),2.18(s,3h),1.48(d,j＝6.4hz,3h),1.23(t,j＝7.4hz,3h)。
实施例12：(r)-n-(6-(5'-氯-3,5-二甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)-5-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-基)三甲基乙酰胺(pivalamide)(b6)的制备。
合成路径f：
(r)-n-(6-(5'-氯-3,5-二甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)-5-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-基)三甲基乙酰胺(b6)
将(r)-6-(5'-氯-3,5-二甲基-[2,4'-联吡啶]-2'-基)-5-甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-2-胺(100mg,0.26mmol)、三甲基乙酰氯(157mg,1.3mmol)和dipea(201mg,1.56mmol)在5ml1,4-二氧六环中的混合物在100℃搅拌过夜。反应用2mnahco3(20ml)淬灭，并用etoac(20ml×2)萃取。合并的有机层用na2so4干燥，并过滤。滤液浓缩后柱层析纯化(石油醚/etoacv/v＝2/1)得到化合物b6，白色固体(40mg，32％)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)8.41(s,1h),8.35(s,1h),8.22(s,1h),8.03(s,1h),7.43(s,1h),6.63(s,1h),5.65-5.43(m,1h),4.47-4.27(m,1h),3.48-3.30(m,1h),3.09-3.01(m,1h),2.94-2.86(m,1h),2.37(s,3h),2.18(s,3h),1.47(d,j＝6.0hz,3h),1.33(s,9h)。
实施例13：细胞色素p450(cyp)抑制的体外评价
在cyp抑制测定中检测化合物b和b1。
cyp抑制测定：
五个主要cyp同工酶和它们相应的底物分别为：cyp-1a2(非那西丁，30μm)，cyp2a6(甲苯磺丁脲，100μm)，cyp2c9(甲苯磺丁脲羟化)，cyp2c19(s-美芬妥英，40μm)，cyp2d6(右美沙芬，5μm)和cyp3a4(咪达唑仑，1μm)。所有探针都是在接近或低于其kms浓度使用。
混合物(200μl)在37℃下进行孵育。该混合物含有hlm(0.2mg/ml)，磷酸盐缓冲液(100mm，ph约7.4)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐nadph(1μm)，试验化合物(化合物b或化合物b1)和各自的用于测试的cyp同工酶的底物。
在与nadph的反应之前，可以将上述混合物预孵育10分钟，进行抑制剂-酶相互作用。之后在特定的时间段(cyp-1a2，2d6和3a4为10分钟；cyp-2c9和2c19为30分钟)，加入约100μl冷乙腈将反应淬灭。然后将淬灭的混合物离心，然后可以通过lc-ms/ms分析混合物的等分试样以定量每种cyp同工酶的特定代谢产物的浓度。对于每种测试化合物，可以完成至少三次独立测定。cyp抑制测定的结果可以显示在下表6中。
表6.化合物b和b1的cyp抑制结果。
根据表6，在10μm浓度下化合物b表现出大于50％的cyp-2c9抑制，而化合物b1表现出约26％的cyp-2c9抑制。
实施例14：化合物b、b1和a-55的药代动力学实验
在药代动力学评估中测试化合物b、b1和a-55如下。
药代动力学实验：
测试受试者：sprague-dawley鼠(体重为约220g-约250g)，购买于slaclaboratoryanimals(上海，中国)。测试的所有化合物的浓度都是1mg/ml，对于一组测试受试者以1ml/kg的剂量在尾静脉进行静脉内注射，或者在另一组测试受试者中以10ml/kg的剂量口服施用。然后在注射/给药后的时间间隔内通过眼眶后静脉穿刺收集血液样品的等分试样。将血样置于含有edta的管中，离心并在分析前储存于-80℃的环境中。在用化合物处理大鼠之前，通过相同的方法收集空白血浆。通过从保存的血液样品中除去约25μl来获得用于分析的血浆样品；加入冷乙腈(约100μl)作为内标；离心10分钟使血浆蛋白沉淀；收集约10μl上清液，用于lc-ms/ms系统分析。
lc-ms/ms分析方法：
所有样品均通过api4000
使用配备有多反应监测(mrm)和正电喷雾电离(esi+)模式的上述api4000qtrap质谱仪，通过ms/ms进行定量。所有化合物和内标设置为100毫秒的停留时间进行监测。其他的ms/ms参数设置如下：在30psi下雾化气(gs1)，涡轮气压为55磅，离子喷雾电压为4500v，离子源温度为500℃。使用针对每种分析物优化的分簇电势(dp)和入口电势(ep)值进行分析物的mrm测量。最后，所有操作，数据采集和分析均由analyst(版本1.5.2，absciex，usa)控制。
实验所得结果如下表7和图14-15所示。
表7.化合物b、b1和a-55的药代动力学实验结果。
结果表明，手性化合物b1比外消旋化合物b在auc(高了将近一倍)和生物利用度(从53％提高到了约100％)测量中更优。此外，与外消旋化合物b相比，在动物体内手性化合物b1的吸收率更高。与外消旋化合物b相比，手性化合物b1也可具有更稳定的血浆水平和更长的持续时间。口服剂量为10mg/kg时，手性化合物b1在8小时的时间点将血浆浓度维持在623ng/ml，其可为约1340nm，约为其ic50值的1675倍(0.8nm)。即使考虑到血浆蛋白的吸收，手性化合物b1也可以实现其对刺猬信号的所需抑制。相反，外消旋化合物b在8小时时间点可具有83ng/ml的血浆浓度，或约178nm，约为其ic50值(2.7nm)的66倍。
实验结果还显示，与去甲基化合物a-55相比，手性化合物b1可以提高其生物利用度(b1为100％，a-55为62％)，动物体内半衰期更长，药物暴露更好(b1比a-55的aus增加了122％)。
总的来说，实验结果表明，与去甲基化合物a-55和外消旋化合物b相比，手性化合物b1可以更好和更长时间地抑制hh信号通路，从而可以更好地应用于治疗与hh信号通路相关的疾病。
实施例15：对小鼠中肿瘤的抑制
在小鼠的肿瘤抑制研究中测试化合物b和b1如下。
肿瘤抑制实验：
patched(ptch)+/-,p53-/-小鼠的原代髓母细胞瘤可以静脉注射到scid小鼠的右侧。植入后约7天，当肿瘤体积平均长至200mm3开始用药物治疗。将受试者随机分为空白组、化合物b治疗组和化合物b1治疗组。化合物b和b1可以约100mg/kg/天的剂量给药。受试者的肿瘤体积和体重可以每两天记录一次。给药14天后处死受试者，取出肿瘤。实验结果如图16和图17所示。
在100mg/kg的剂量下，外消旋化合物b可以阻止肿瘤生长。相反，在100mg/kg的剂量下，手性化合物b1可以降低肿瘤体积并且可以大幅度地减小肿瘤尺寸以至于可以认为肿瘤被移除。
表4显示了根据本发明公开的方法制备的化合物的选择。
生物活性：
主要测定基于nih3t3-gre-luc报告基因测定：
将nih3t3细胞(crl-1658,atcc)在补充有10％fbs(hyclone)的dmem(11965，gibico)中培养。gre-luc质粒通过将8×gli-1响应元素(gre)克隆到pgl4.26的mcs(promega)中产生。在用gre-luc荧光素酶报告质粒转染后，通过潮霉素(invitrogen)选择建立nih3t3-gre-luc报道细胞系。用重组声波刺猬蛋白或小分子激动剂sag的n-末端片段(abin629346)测定质量验证单克隆。被选择的克隆用于检测hh信号。
将nih3t3-gre-luc细胞在完全培养基(具有4mml-gln、1.5g/l碳酸氢钠和4.5g/l葡萄糖、补充有100μg/ml潮霉素和10％fbs的dmem)中培养。当汇合时，将细胞用胰蛋白酶消化并重悬于测定培养基(含0.5％血清的dmem)中。将100μl/孔的细胞悬浮液加入96孔板(最终细胞浓度为15,000个细胞/孔)后，将细胞再培养48小时，然后加入化合物。
将化合物在dmso中连续稀释，并用测定培养基进一步稀释。在一个实施方式中，在测定培养基中加入10nmsag作为hh信号的激动剂。制备化合物和激动剂后，小心地除去培养基(用移液管代替真空吸出培养基，否则将使nih3t3细胞单层分离)。将100μl含有化合物和激动剂的测定培养基小心地加入细胞中。将细胞板在37℃下再孵育48小时。
在孵育48小时后，将40μl/孔的荧光素酶培养基(brigh-glo，promega)加入细胞中。将板在室温下温和振荡培养5分钟。用平板读数器(pherastarfs，bmg)测量发光信号。基于对发光信号的抑制来计算化合物的活性。当使用主要测定时，标准gdc-0449(vismodegib)的ic50测量曲线如图10所示。
gdc-0449(vismodegib)
确认测定基于肾上腺素-环巴胺(bodipy-cyclopamine)结合测定：
肾上腺素-环巴胺结合测定是用于分析smo激动剂结合的基于荧光的测定。在用smo-ha-plvx质粒转染后，通过嘌呤霉素(1ug/ml，invitrogen)选择建立hek293-smo稳定的克隆。将hek293-smo细胞在完全培养基(具有4mml-gln、1.5g/l碳酸氢钠和4.5g/l葡萄糖、补充有100μg/ml潮霉素和10％fbs的dmem)中培养。用westernblot和细胞免疫荧光验证smo的表达。肾上腺素-环巴胺购自torontoresearchchemicals并溶解在甲醇中。
将hek293-smo细胞接种在96孔板(3340，corning)中，最终细胞浓度为在100μl含1％血清的dmem中15,000细胞/孔。将板在37℃孵育另外48小时。
将hek293-smo板用pbs洗涤，并在室温下用4％多聚甲醛(pfa)/pbs固定20分钟。除去pfa缓冲液后，将细胞用dapi/pbs(5μg/ml)孵育10分钟，然后用pbs洗涤两次。洗涤后，将细胞在室温下在含有100nm肾上腺素-环巴胺和含有0-10μm浓度范围的用于竞争性结合的化合物的结合缓冲液(hbssw/oca2+和mg2+)中孵育2小时，。孵育后，用pbs洗涤细胞两次。通过高含量荧光成像系统(arrayscanvti，thermo)自动捕获和分析荧光图像。gdc-0449用作参考化合物以使数据标准化。使用graphpadprism软件使用s形剂量-反应函数计算ic50值。按照cheng-prusoff方程计算ki，其中ki＝ic50/[1+[肾上腺素-环巴胺]/kd)]。用于wt-smo的肾上腺素-环巴胺的kd为3.5±0.8nm。
在上述测定中，测试上述化合物和几种其他化合物，数据总结在表5中。标准化合物是vismodegib，其效力在第4栏中作为对照列出。该比率是在相同测定中vismodegib相对于测试化合物的ic50值。一些测试曲线如图11-13所示。
表5.本发明的所选化合物(b1-b6)和主要测定中的其他化合物(b-d)的测试结果。
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