一种生物法制备的金纳米粒子及其应用的制作方法

本发明属于金纳米材料领域，具体涉及一种生物法制备的金纳米粒子及其应用。

背景技术：

纳米科技正成为一个重要研究领域。金属纳米粒子是一类具有微小尺寸的粒子，其大小在1-100nm。金属纳米粒子(银、金、铂、锌、镉、铜)具有比表面积大、导电导热性能良好、磁响应度高的特点，在物理、化学、电学、光学、材料科学和生物医学领域具有重要应用。现阶段合成金属纳米粒子主要有物理法、化学法和生物法。由于物理法和化学法存在毒性大、反应条件苛刻、环境不友好等缺点，而生物法合成金属纳米粒子具有操作简单、经济、环境友好、无毒性等一系列的优点，正在逐步取代物理法和化学法合成金属纳米粒子。

对硝基苯酚是合成医药、农药、染料等的重要中间体，但在生产过程中对硝基苯酚被排放到土壤或者水中，对硝基苯酚的降解非常缓慢，随着工业的大规模发展，对硝基苯酚对环境的危害日益严重。由于金纳米粒子具有极高的催化性能，金纳米粒子在硼氢化钠的存在下能高效降解对硝基苯酚，相比于其他物理化学方法降解对硝基苯酚，金纳米粒子降解对硝基苯酚具有高效、条件温和且绿色的优点。

技术实现要素：

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种生物法制备金纳米粒子的方法。

本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的金纳米粒子。

本发明的再一目的在于提供上述金纳米粒子在催化降解对硝基苯酚中的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种生物法制备金纳米粒子的方法，包括如下步骤：

(1)将铁皮石斛内生真菌菌株经接种后于液体发酵培养基中进行扩大发酵培养，过滤、洗涤后收集菌丝体；

(2)将步骤(1)所得菌丝体经液氮冷冻后研磨成粉，然后溶于缓冲液中，超声破碎菌体后，离心，收集上清液；

(3)冰浴及搅拌条件下往步骤(2)所得上清液中加入硫酸铵，静置后离心收集还原酶沉淀；

(4)将步骤(3)所得还原酶沉淀用缓冲液溶解，置于透析袋中透析，透析后冻干得到粗酶粉；

(5)将步骤(4)所得粗酶粉溶于缓冲液中，然后加入haucl4进行反应，反应结束后，离心收集沉淀，得到金纳米粒子。

进一步地，步骤(1)中所述铁皮石斛内生真菌菌株分离自铁皮石斛根部，拉丁名为fusariumavenaceumly554，2018年8月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno.m2018559。

进一步地，步骤(1)中所述接种的条件为：无菌条件下，斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，于28±1℃的培养箱中活化培养72～96h。

进一步地，步骤(1)中所述液体发酵培养基采用马铃薯葡萄糖水培养基；所述扩大发酵培养的过程为：先将接种后的菌体在液体发酵培养基中于28±1℃、转速120rpm摇床培养24-48h，得到种子液，然后在无菌条件下，将得到的种子液按照体积含量为1％的接种量接入液体发酵培养基中，于28±1℃、转速120rpm的摇床下培养6～8天。

进一步地，步骤(1)中所述洗涤是指用无菌去离子水洗涤。

进一步地，步骤(2)中所述缓冲液为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液；所述研磨成粉后的菌丝体溶于缓冲液中的质量体积比为1:10g/ml。

进一步地，步骤(2)中所述超声程序为：开4s，关4s，总时间20min，功率300w；所述离心是在温度4℃，8000rpm下离心15min。

进一步地，步骤(3)中所述收集还原酶沉淀为40％～100％的硫酸铵饱和度产生的沉淀；所述离心是在温度4℃，8000rpm下离心15min。

进一步地，步骤(4)中所述缓冲液为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液；所述透析袋的截留分子量为3500da，透析先采用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液作为透析液，最后采用无菌去离子水透析。

进一步地，步骤(5)中所述缓冲液为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，粗酶粉溶于缓冲液中的浓度为0.2mg/ml。

进一步地，步骤(5)中所述加入haucl4进行反应的浓度为1mmol/l，所述反应条件为60℃水浴下反应8～24h。

进一步地，步骤(5)中所述离心是在温度4℃、12000g离心20min。

一种金纳米粒子，通过上述方法制备得到；所述金纳米粒子为圆形或椭圆形纳米颗粒材料，颗粒的粒径为35～80nm。

上述金纳米粒子在催化降解对硝基苯酚中的应用。

本发明金纳米粒子的制备原理为：通过液氮冷冻研磨和超声破碎使胞内的还原酶释放到缓冲液中，通过硫酸铵沉淀使酶沉淀并通过离心收集酶，一方面酶会使au³⁺被还原为金纳米粒子，另一方面酶会附着在生成的金纳米粒子表面防止其聚集。

本发明的制备方法及所得到的金纳米粒子具有如下优点及有益效果：

本发明的制备方法具有反应条件温和、绿色环保、易于重复等优点，该制备方法合成的金纳米粒子不仅具备均一稳定、粒径较小的特点，还具有高效催化降解对硝基苯酚的性能。

附图说明

图1为实施例步骤(9)中加入haucl4反应前后的颜色对比图。

图2为实施例中haucl4及酶+haucl4反应后的溶液在紫外-可见分光光度计下250-800nm的全波长扫描图。

图3为实施例中制备的金纳米粒子的扫描电子显微镜图。

图4为实施例中制备的金纳米材料在不同时间下(0min，5min，10min，15min，20min)催化降解对硝基苯酚的反应液在紫外-可见分光光度计下250-800nm的全波长扫描图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

以下实施例中采用的铁皮石斛内生真菌菌株fusariumavenaceumly554于2018年8月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武昌路珞珈山武汉大学，邮编430072)，保藏号为cctccno.m2018559。

实施例

(1)马铃薯琼脂糖葡萄糖培养基于121℃下高压灭菌20分钟，在无菌条件下在马铃薯琼脂糖葡萄糖培养基接种铁皮石斛内生真菌菌株菌丝，于28±1℃培养箱中活化培养3天。

(2)100ml马铃薯葡萄糖液体培养基于121℃下高压灭菌20分钟，在无菌条件下挑取少量活化菌丝于已灭菌的马铃薯葡萄糖液体培养基，于28±1℃、120rpm摇床培养36小时。

(3)在无菌条件下按1v％(体积百分比)接种量接入1000ml马铃薯葡萄糖液体培养基中，于28±1℃、120rpm摇床发酵培养7天。

(4)将步骤(3)的发酵液于无菌条件下真空抽滤，菌丝体用无菌水冲洗，再次真空抽虑，重复三次以去除菌丝体残留培养基成分；收集菌丝体。

(5)先用液氮预冷研钵，加入菌丝体后迅速加入液氮，待液氮快挥发完全后开始研磨，待菌丝体研磨成粉后，收集菌丝体粉末。

(6)将1g菌丝体粉末溶于10ml碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(ph为9.1，浓度为20mm)中，超声破碎20min，超声设置为功率300w，开4s，关4s，超声时间为20min。将超声后的液体于4℃，8000rpm下离心20min，收集上清液。

(7)在冰浴、磁力搅拌的条件下，向步骤(6)的上清液中缓慢加入硫酸铵粉末，当硫酸铵饱和度为40％时，停止加入硫酸铵，继续在冰浴下磁力搅拌2h，然后在4℃冰箱静置2h，4℃，8000rpm下离心15min去除沉淀和漂浮物，继续在冰浴、磁力搅拌的条件下向上清液加入硫酸铵至其饱和度为100％，继续在冰浴下磁力搅拌2h，然后在4℃冰箱静置4h，4℃，8000rpm下离心15min收集沉淀。

(8)将步骤(7)所得沉淀用20ml碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(ph为9.1，浓度为20mm)溶解得到粗酶溶液。将上述粗酶溶液置于3500da透析袋中，透析外液为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(ph为9.1，浓度为20mm)，透析24h，期间每隔4-6h换一次透析外液，最后一次用水透析。将上述透析好的粗酶溶液置于-20℃中预冻2h以上，于-70℃冷冻真空干燥机中冻干12h，得到粗酶粉。

(9)将步骤(8)所得粗酶粉10mg溶于50ml碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(ph为9.1，浓度为20mm)中，然后加入haucl4，使haucl4的终浓度为1mmol/l，反应液置于60℃水浴下反应12h。反应12h后溶液从微黄色变为酒红色(如图1所示)，反应液于紫外可见分光光度计250-800nm波长扫描，结果如图2所示。由图2可见酶+haucl4反应后在525nm处左右有特征吸收峰，确定有金纳米材料生成。反应结束后，反应液于12000g、4℃离心20分钟收集沉淀，干燥后扫描电子显微镜表征结构，结果如图3所示。结果显示本发明所得金纳米粒子为圆形或椭圆形纳米颗粒材料，颗粒的粒径为35～80nm。

将本实施例得到的金纳米材料用于降解对硝基苯酚的实验。实验步骤如下：

(1)分别配置10mmol/l的对硝基苯酚(4-np)，100mmol/l的硼氢化钠(nabh4)，0.1mg/ml的金纳米材料(aunps)水溶液。

(2)10ml试管中加入9.4ml去离子水，然后加入0.1ml10mmol/l的对硝基苯酚，0.5ml100mmol/l的硼氢化钠，然后分别加入1ul、10ul、100ul的0.1mg/ml金纳米材料水溶液启动反应。

(3)用去离子水调零，上述反应液在不同时间(0min，5min，10min，15min，20min)于紫外可见分光光度计250-800nm波长扫描。结果如图4所示。

由图4可知，本发明所得金纳米粒子用于降解对硝基苯酚，在20min可以完全降解对硝基苯酚，而对硝基苯酚自然降解的速度远远大于20min，说明本发明合成的金纳米粒子具有高效快速降解对硝基苯酚的作用。

对比例1

本对比例与实施例相比，不同在于步骤(9)中不加入haucl4进行反应，将所得粗酶粉的缓冲液用于全波长扫描，在525nm处并没有金纳米粒子的特征吸收峰出现，说明本对比例没有金纳米粒子的生成。

对比例2

本对比例与实施例相比，不同在于步骤(9)中用不含粗酶粉的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(ph为9.1，浓度为20mm)进行反应。反应前后的溶液颜色基本没有发生改变，并且把反应后的溶液用于全波长扫描，在525nm处并没有金纳米粒子的特征吸收峰出现，说明本对比例中没有金纳米粒子的生成。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。