专利名称:中国对虾抗菌肽基因的重组表达与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物基因工程技术领域：
中重组表达和纯化等技术，具体涉及对虾抗菌肽(对虾素)基因表达、表达产物纯化与活性测定等技术，属于分子生物学技术领域：
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抗菌肽是20世纪70年代研究昆虫免疫系统时发现的一类具有抗菌特性的小分子多肽。昆虫抗菌肽具有分子量小、热稳定高、水溶性好、杀菌力强、抗菌谱广等优点，对细菌、真菌、病毒、肿瘤细胞均有明显的杀伤作用，而对正常真核细胞无毒害作用。这就使得研究人员对抗菌肽产生了浓厚的兴趣，并在诱导释放、抗菌机理、结构功能、重组表达等各个方面进行了深入的研究。
水产养殖品种生活于富含各种各样微生物的水环境中，长期的生存适应使其形成了有效的防卫功能。抗菌肽被认为是鱼、虾、贝等防御系统的主要成分之一。对水产养殖品种抗菌肽的分离纯化并研究其结构与功能，进而通过基因工程技术在原核细胞、真核细胞或某些藻类中重组表达，将有希望成为对付水产养殖品种主要病原菌特别是耐药菌或病毒的新型药物。
同属甲壳纲的虾类抗菌肽的研究起步较晚。法国贝车瑞(Bachere)教授实验室对凡纳对虾抗菌肽(对虾素)进行了系统研究1997年他们从养殖的凡纳对虾(Penaeusvannamei)的血细胞和血浆中分离了3种抗菌肽，称为对虾素1，2和3(penaeidin-1，2 and 3)，具有抗真菌、细菌尤其是革兰氏阳性菌的活力，参见戴斯特谬克司等的“对虾素-从凡纳对虾分离得到的抗菌肽的一个新家族”，刊于生物化学杂志，1997年272卷，28398-28406页(Destoumieux D，Bulet P，Loew D，et al.Penaeidins，a new familyof antimicrobial peptides isolated from the shrimp Penaeus vannamei(Decapoda).J.Biol.Chem.，1997，27228398～28406)。戴斯特谬克司-卡森等又在凡纳对虾(Litopenaeus vannamei)和南美白对虾(Litopenaeus stylirostris)中发现了具有严格抗真菌活性的3种于阴离子抗菌肽。该文的题目为“微生物诱导产生的来自对虾血蓝蛋白C-末端的的抗真菌肽”发表在生物化学杂志2002年276卷47070-47077页(Destoumieux-Garzon D，Saulniner D，Garnier Jet al.Crustacean Immunityantifungal peptides are generated from the c terminus of shrimp hemocyanin inresponse to microbial challenge.J.Biol.Chem.2001，276，47070-47077)。戴斯特谬克司将编码对虾素成熟肽的基因克隆到PCRscript SK(+)载体，并转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，进行表达和抗菌活性分析，发现基因工程合成的抗菌肽与天然抗菌肽在结构上虽有差异，但活性相似。参见戴斯特谬克司等刊于欧洲生物化学杂志1999年266卷第335-346页的文章，题目为“来自对虾的抗菌肽，对虾素的重组表达和活性研究”(Deatoumieux D，Bulet P，Strub J M，et al.Recombinantexpression and range of activity of penaeidins，antibacterial peptides frompenaeid shrimp.Eur J Biochem，1999，266335～346)。我们利用RT-PCR和末端快速扩增等方法，从中国对虾血细胞中克隆得到1种对虾素(Penaeidins)家族的抗菌肽Ch-penaedin基因(chp)，见康翠洁，王金星，赵小凡，相建海，2002，中国对虾抗菌肽成熟肽cDNA克隆，山东大学学报(理学版)37(6)552-556，并对其表达和性质进行了系统研究。申请号02109931、公开号1381587的专利文献也公开了克隆到的对虾抗菌肽的cDNA序列。
根据克隆得到的对虾素基因，分别构建原核和真核表达载体，利用大肠杆菌、酵母菌和昆虫细胞表达系统分别表达了有活性的抗菌肽(对虾素)，建立纯化方法和活性鉴定方法。
本发明中国对虾抗菌肽基因的重组表达方法，包括重组载体构建、转化与筛选和表达产物鉴定、纯化和抗菌谱测定。分别说明如下1.重组载体构建根据已克隆到的对虾抗菌肽成熟肽的cDNA序列(申请号02109931，公开号1381587)，利用特异引物在其两端引入两个不同的限制性内切酶位点，亚克隆到表达载体，载体包括pET系列、pGEX-4T系列、pPIC系列、pAO815和杆状病毒表达载体。
2.转化与筛选将构建得到的载体分别转化大肠杆菌和酵母菌及转染昆虫细胞，筛选工程菌株并诱导表达。
3.表达产物鉴定、纯化和抗菌谱测定采用诱导剂诱导表达工程菌，破细胞收集上清液，分泌型表达的细胞直接收集上清液，采用层析的方法纯化抗菌肽，并测定抗菌谱。
上述的诱导剂是原核表达的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，简称IPTG，酵母表达的诱导剂是甲醇。
上述特异性引物是下列之一(1)以重组质粒chp/pGEM T-easy为模板，以chppGEXF/chppGEXR为引物，引物两端加EcoR I和Xho I酶切位点，扩增对虾抗菌肽成熟肽基因chp，引物序列为ChppGEX F 5’GCGC GAA TTC AAG GGT GGT TAC ACA CGC 3’，ChppGEX R 5’GCGC CTCGAG ACT TAC ATC CCA CAT GCA C3’。
(2)以对虾Chp/pGEM T-easy质粒为模板进行PCR扩增，两条引物分别为F 5’CTGGGAA TTC ATG AAG GGT GGT TAC ACA CGC 3’加EcoR I位点，R 5’TCGG GCG GCC GC ACTTAC ATC CCA CATG 3’加Not I位点。
(3)以chp/pGEM-T easy为模板，以ChpBac F ChpBac R为引物扩增对虾素基因，引物序列为ChpBac F 5’GCGC GGA TCC AAG GGT GGT TAC ACA CGC 3’，ChpBac R5’GCGC CTC GAG ACT TAC ATC CCA CAT GCA C3’，引物两端加Bam H I和Xho I酶切位点。
本发明在大肠杆菌、酵母菌和昆虫细胞中分泌表达了有活性的抗菌肽。用本发明重组表达的对虾抗菌肽(对虾素)进行抑菌实验，表明对虾素对大肠杆菌、金黄葡萄球菌、藤黄微球菌等革蓝氏阴性菌和阳性菌有抑菌活性。
本发明表达产物可用于制作饲料添加剂、保鲜剂、化妆品和医药产品。
PCR反应体积25μl，扩增条件94℃2min；94℃30s，51℃45s，72℃45s共30循环；72℃10min。经2％琼脂糖凝胶电泳检测得到大约350bp左右的扩增产物。用胶纯化试剂盒纯化所得的产物。2)m-chp-pGEX-4T-1重组质粒的构建载体pGEX-4T-1和纯化的PCR产物(m-chp)分别用Eco RI/Xho I 37℃酶切3h，然后将对虾素成熟肽基因连于pGEX-4T-1质粒，连接反应于22℃进行6小时。3)m-chp-pGEX-4T-1重组质粒转化E.coli BL21将m-chp-pGEX-4T-1重组质粒转化E.coli DH5α，以chppGE F/chppGE R为引物PCR筛选chp-pGEX-4T-1-DH5α阳性菌株。提取m-chp-pGEX-4T-1-DH5α阳性菌株质粒，用于测序。用测序正确的质粒转化E.coli BL21，筛选阳性克隆。4)m-chp-pGEX-4T-1 BL21菌株的诱导表达及纯化挑取m-chp-pGEX-4T-1-BL21单菌落于5ml LB/Amp培养液中试诱导表达。挑取试诱导表达为阳性的菌落于5ml LB/Amp培养液中37℃过夜培养，次日取1ml接种于100mlLB/Amp培养液中37℃培养4h，至OD600为0.8-1.0，加入IPTG至终浓度1mM，诱导培养5小时。7000rpm离心10分钟收集细胞，加入5ml PBS，50μl 20％ Triton X-100重悬细胞，并超声波破碎细胞12min，12000rpm离心10分钟收集上清。将上清过GlutathioneSepharose 4B亲和层析柱纯化GST-CHP融合蛋白，12.5％SDS-PAGE检测，电泳方法参照Laemmli(1970)的方法。5)氨基酸序列测定，酶裂解后的融合蛋白经15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法转移到PVDF膜，ponceau 3R染液中染色，切下目的带，在ab Appllid Biosystems，491蛋白质测序仪上测序。6)液体生长抑制方法检测CHP活性以1μl凝血酶100mg GST-CHP融合蛋白的比例于23℃裂解GST-CHP融合蛋白8h。于5ml LB培养液中37℃过夜培养E.coli DH5α，次日以1μl过夜培养物1mlLB培养液的比例将E.coli DH5α稀释，于96孔板中每孔加入稀释后的E.coli DH5α菌液100μl，然后加入经过裂解GST-CHP融合蛋白样品100μl。用LB，GST-CHP融合蛋白，PBS，Glutathione Elution Buffer作为对照。每组设定三个平行试验，25℃ 30rpm摇动培养，在450nm波长下每30min测定吸光度。对每组的平行试验求平均值，绘制吸光度与时间的曲线，见附
图1。实施例2.利用酵母表达系统表达对虾素，pPIC载体系列。1)载体构建(以pPIC9K为例)以对虾Chp/pGEM T-easy质粒为模板进行PCR扩增，两条引物分别为F 5’CTGG GAA TTC ATG AAG GGT GGT TAC ACA CGC 3’加EcoR I位点，R 5’TCGG GCG GCC GC ACT TAC ATC CCA CATG 3’加Not I位点，PCR反应条件94℃ 2分钟，进入下面30个循环94℃ 30秒，53℃ 45秒，72℃30秒；最后72℃延伸10分钟。扩增反应完成后，用胶纯化试剂盒纯化所得的产物。先后进行Not I、EcoR I双酶切，酚/氯仿抽提。
pPIC9K质粒同样进行Not I、Eco R I双酶切，与chp基因连接。将m-chp/pPIC9K-重组载体转入大肠杆菌DH5α的感受态细胞中，在含氨苄青霉素(50μg/ml)的固体LB平板上，37℃倒置过夜培养。PCR筛选阳性克隆，扩大培养提取重组质粒，测序验证重组质粒中m-chp序列的正确性。2)对虾素表达的酵母工程菌株的筛选将m-chp/pPIC9K重组质粒、pPIC9K空质粒分别进行Sal I酶切，酚/氯仿抽提纯化。转化酵母KM71感受态细胞。涂布在不含His的MD平板上，收集长出的his+菌落。再在含有不同浓度G418的YPD梯度平板进行梯度筛选。挑取单菌落于10μl水中，沸水煮5分钟，冰浴5分钟，再煮5分钟。室温下离心，取2μl作为模板，PCR检测，正向引物为载体上5’-AOX1 Primer，逆向引物为chp基因的逆向引物。将筛到的阳性菌落进行表达研究。
取m-chp/pPIC9K/KM71、pPIC9K/KM71在YPD平板上划线，28℃培养两天后挑单菌落分别接种于5ml的YPD液体培养基中，28℃，200-250rmp培养24h。然后将菌液转移到BMGY中扩大培养，28℃，200-250rpm培养至OD600为2-6，5000rpm离心取沉淀，换用1/5体积含0.5％甲醇的BMMY诱导表达。每隔24h取1ml菌液，12000rpm离心5min，-20℃保存上清液，同时补加甲醇至0.5％继续诱导。一直诱导3-4天。每天所得上清液进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测分泌表达的情况。3)表达产物纯化表达产物过亲和层析柱，然后过Sephadex柱脱盐，得到纯化产物。4)表达产物抗菌活性的测定琼脂孔穴扩散法将处于对数生长期的大肠杆菌DH5α悬浮液(0D600＝0.3)20μl与固体PBM(Poor broth medium1％agar，1％trypton，0.5％Nacl)培养基15mL在45℃左右混合均匀，铺在水平的无菌培养皿中，待其凝固后在皿内打直径为5mm的小孔，加入待测样品液，37℃培养过夜。
液体生长抑制法将过夜培养的大肠杆菌DH5α悬浮液，金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌等用液体PBM(Poor broth medium1％trypton，0.5％Nacl)培养基调至OD600值为0.001。取100μl加入96孔板的小孔中，加入50μl含有抗菌肽的上清液，37℃震荡培养，每1h用酶标仪测一次吸光度OD600。实施例3.利用酵母表达系统表达对虾素，pAO815载体。
如实施例2所述，所不同的是载体拷贝筛选在体外进行，表达产物纯化要破细胞。实施例4.利用昆虫细胞表达系统表达对虾素以chp/pGEM-T easy为模板，以ChpBac F ChpBac R为引物扩增对虾素基因。引物序列为ChpBac F 5’GCGC GGA TCC AAG GGT GGT TAC ACA CGC 3’ChpBac R 5’GCGCCTC GAG ACT TAC ATC CCA CAT GCA C3’，引物两端加Bam H I和Xho I酶切位点。
回收扩增产物，亚克隆到pFastBac质粒，得到pFastBac/Chp重组质粒，转化DH10Bac细胞，在辅助质粒(Helper)产生的转座酶的作用下，将m-Chp基因片段转座到穿梭载体Bacmid上，利用蓝白斑筛选重组Bacmid。验证后转染昆虫细胞，收集并裂解转染的细胞，离心收集上清液，柱层析纯化表达产物。实施例5.实施例1、2和3的表达产物用做饲料添加剂，如对虾饲料添加剂，鱼类饲料添加剂，禽类饲料添加剂和畜类饲料添加剂。实施例6.实施例1、2和3的表达产物用做保鲜剂，如肉类食品保鲜、水果保鲜等。实施例7.实施例1、2和3的表达产物用于化妆品，如护肤霜。实施例8.实施例1、2和3的表达产物用于医药产品，如抗细菌、真菌和病毒药物。
权利要求
1.中国对虾抗菌肽基因的重组表达方法，包括重组载体构建、转化与筛选和表达产物鉴定、纯化和抗菌谱测定其特征在于，所述的重组载体构建是根据已克隆到的对虾素成熟肽的cDNA序列，利用特异引物在其两端引入两个不同的限制性内切酶位点，亚克隆到表达载体，载体包括pET系列、pGEX-4T系列、pPIC系列、pAO815和杆状病毒表达载体；所述的转化与筛选是将构建得到的载体分别转化大肠杆菌和酵母菌及转染昆虫细胞，筛选工程菌株或细胞并诱导表达；所述的表达产物鉴定、纯化和抗菌谱测定是采用诱导剂诱导表达的工程菌，破细胞收集上清液，分泌型表达的细胞直接收集上清液，采用层析的方法纯化抗菌肽，并测定抗菌谱。
2.如权利要求
1所述的中国对虾抗菌肽基因的重组表达方法，其特征在于，所述的诱导剂是原核表达的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，酵母表达的诱导剂是甲醇。
3.如权利要求
1所述的中国对虾抗菌肽基因的重组表达方法，其特征在于，所述特异性引物是下列之一(1)以重组质粒chp/pUCM-T为模板，引物chppGEXF/chppGEXR，引物两端加EcoRI和Xho I酶切位点，扩增虾防御素成熟肽基因chp，引物序列为ChppGEX F 5’GCGCGAA TTC AAG GGT GGT TAC ACA CGC 3’，ChppGEX R 5’GCGC CTC GAG ACT TAC ATC CCACAT GCA C3’；(2)以对虾Chp/pGEM T-easy质粒为模板进行PCR扩增，两条引物分别为F 5’CTGGGAA TTC ATG AAG GGT GGT TAC ACA CGC 3’加EcoR I位点，R 5’TCGG GCG GCC GC ACTTAC ATC CCA CATG 3’加Not I位点；(3)以chp/pGEM-T easy为模板，以ChpBac F ChpBac R为引物扩增对虾素基因，引物序列为ChpBac F 5’GCGC GGA TCC AAG GGT GGT TAC ACA CGC 3’，ChpBac R5’GCGC CTC GAG ACT TAC ATC CCA CAT GCA C3’，引物两端加Bam H I和Xho I酶切位点。
4.权利要求
1所述的中国对虾抗菌肽基因的重组表达方法，其特征在于，表达产物可用于制作饲料添加剂、保鲜剂、化妆品和医药产品。
专利摘要
中国对虾抗菌肽基因的重组表达与应用，属于分子生物学技术领域：
。重组表达方法包括重组载体构建、转化与筛选和表达产物鉴定、纯化和抗菌谱测定，其中重组载体构建是根据已克隆到的对虾素成熟肽的cDNA序列，利用特异引物在其两端引入两个不同的限制性内切酶位点，亚克隆到表达载体，载体包括pET系列、pGEX－4T系列、pPIC系列、pAO815和杆状病毒表达载体；再将构建得到的载体分别转化大肠杆菌和酵母菌及转染昆虫细胞，筛选工程菌株或细胞并诱导表达。表达产物可用于制作饲料添加剂、保鲜剂、化妆品和医药产品。
文档编号C12N15/63GKCN1459506SQ03112294
公开日2003年12月3日 申请日期2003年5月30日
发明者王金星, 赵小凡, 相建海, 李富花 申请人:山东大学, 中国科学院海洋研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan