评价用靶向ret受体酪氨酸激酶的药物治疗的患者的方法

专利名称：:评价用靶向ret受体酪氨酸激酶的药物治疗的患者的方法评价用靶向RET受体酪氨酸激酶的药物治疗的患者的方法本发明涉及选择患者的方法，所述患者是采用RET药物治疗的l，者，由此预澳树RET药物反应的增加的可能性。本发明提供了一种测定RET序列的方法。该方法提供了最优化用于测定RET序列的ARMS引物。本发明还提供了包含ARMS引物的诊断试剂盒。蛋白在酪氨酸残基上的磷酸化是细胞内信号转导的关键因素。能催化这种反应的酶称作酪氨酸激酶。许多跨膜受体含有具有酪氨酸激酶活性的结构域，并被归类为受体酪氨酸激H(RTK)。RTK转导多种多样过程的胞外信号，所述过程如细胞生长、分化、存活和程序性细胞死亡。响应胞外配体的结合，RTK通常二聚化，从而导致自身磷酸化以及M识别RTK的磷酸化形式并与之相互作用的效应物的胞内信号转导。RTK家族有几个成员，其中之一为RET原癌基因，其编码120kDa的蛋白RET(在转染过程中重排)。RET是胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)家族的生长因子受体。巳鉴定了2个RET的配体GDNF和neutunn(NTN)。当RET的配体结合共同受体且该复合物与RET相互作用时，RET被活化(Eng，1999JournalClinicalOncology.17(1)380-393)。活化使得RET在酪氨^^基上磷酸化，从而导致细胞生长和分化的信号通过RAS-RAF和PI3激酶途径和其他可能的途^ii行转导。已知活化RET的点突变弓胞3种相关的显性遗传的癌症综合征多发性内分泌腺瘤2A型和2B型(MEN2A和MEN2B)以及家族性甲状腺髓样癌(FMTC)(Santoro等.2004Endocrinology:145,5448-5451)。在几乎所有的MEN2A病例和一些FTMC病例中，在胞外的近膜半胱氨酸富集结构域具有半胱氨酸的置换，而95%的MEN2B病例是在激酶结构域的密码子918的单个点突变(M918T)造成的。密码子918被认为位于催化核心的底物识别口袋中。该位点的突变被认为改变了RET催化结构域活化环的结构，进而组成型激活RET。M918T突变同样发现于偶发性髓样癌中，其中它与侵袭性疾病表型相关。体外研究已表明，所述突变影响底物特异性，从而RETtti^通过非受体酪氮酸激酶诸如c-src和c-abl识别和磷酸化底物(Eng等1996JAMA:276,1575-1579;Ponder等1999CancerResearch:59,1736-1741;Schilling等.2001InternationalJournalofCancer:95,62-66;Santoro等.1995Science:267,381-383;Zhou等1995Nature:273,536-539)。因为RET基因中的突变在大多数MEN2家族中已得到鉴定，所以分子诊断观赋是可能的，且可用于证实临床诊断。RET突变的观!l试可采用基于聚合髒连反应的规程进行，其中扩增靶外显子序列用于直接测序或限制性内切核酸酶消化(Zhong等.2006ClinicaChimicaActa:364,205-208)。RTK家族的另一个成员是血管内皮生长因子受体2(VEGFR2(含激酶插入结构域受体，KDR(也称FIk-l)))。VEGFR2是血管内皮生长因子(VEGF)的受体。VEGF被认为是正常和疾病相关的血管发生(Jakeman,等1993Endocrinology:133,848-859;Kolch,等.1995BreastCancerResearchandTreatment:36,139-155)和血管鹏性(Connolly,等1989J.Biol.Chem:264,20017-20024)的重要刺激物。通过用抗体螯合VEGF拮抗VEGF作用可导致抑制肿瘤生长(Kim,等.1993Nature:362,841-844)。VEGF基因的杂合破坏导致血管形成的致命缺陷(Carmeliet,等1996Nature380:435439;Fe订叫等.1996Nature380:439442)。VEGF与VEGFR2的结合导致了受体的二聚化作用，弓胞VEGFR2特定胞内酪氨酸残基的自身磷酸化。自身磷酸化增加了所述酪氨酸激酶的催化活性，并为胞质信号转导分子例如磷脂酶Oy提供了可能的对接位点。这些蛋白相互作用介导了对诱导针对VEGFR2的细胞应答必需的胞内信号传导，例如内皮细胞增殖、存活和迁移(Ryan等2005BritishJournalCancer:92(增刊1)S6-S13)。病理血管发生中VEGF介导的VEGFR2信号传导的关键作用的认识已导致了各种抑制VEGFR2活化的选择性方法的开发。这些包括小^fATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂，其在防止ATP结合中阻止自身磷酸化，进而阻止细胞内信号转导(Ryan,2005)。喹唑啉衍生物是VEGF受体酪氨酸激酶的抑制剂，其描述于国际专利申请公开号WO98/13354和WO01/32651中。在WO98/13354和WO01/32651中描述了具有对抗VEGF受体酪氨酸激酶活性的化合物，其同时具有一些对抗表皮生长因子受^(EGHl)酪氨酸激酶的活性。已公开了化合物4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(l-甲基哌啶-4-基甲氧蜀喹唑啉是VEGFR2酪氨酸激酶抑制剂(Wedge等.2002CancerResearch:62,546454655)。该化合物也称作ZactimaTM(注册商标)，商品名为凡德他尼(vandetanib)，编号为ZD6474。该化合物在下文中称为凡德他尼。凡德他尼是作为ATP与VEGFR2酪氨酸激酶结合的有效且可逆抑制剂被开发的。此外，凡德他尼同样抑制EGFR酪氨酸激酶活性。EGFR信号传导途径对于癌症进展也是关键的，其中异常的EGFR活性增加了肿瘤细胞的增殖、存活和侵袭力以及VEGF的超表达。已显示EGER信号传导的抑制诱导肿瘤内皮细胞的选择性凋亡。2002年，有报道称凡德他尼已显示有效抑审'廊体^#、的RET酪氨酸激酶活性，从而抑制RET的信号传导和转化能力。而且，凡德他尼体外显示对RET依赖的甲状腺肿瘤细胞生长具有强生长抑制作用(Carbmagno等.2002CancerResearch.62,7284-7290)。凡德他尼抑制RET的多数突变、活化形式以及野生型受体。因此除抑制VEGFR2和EGFR酪氨酸激酶外，认为通过凡德他尼对RET酪氨酸激酶的抑制可能在治疗具有导致RET依赖的肿瘤细胞生长的RET基因突变的肿瘤中贡献额外的抗肿瘤作用(Ryan,2005)。本发明允许选择患者以预测对RET药物反应的增加的可能性，所述患者是用RET药物治疗的候选者。由于已知组成型'i^活RET的突变导致几种RET信号传导依赖的癌症综合征，所以在患者中测定这些突变可用于评价患者对于采用RET药物治疗的适合性。根据本发明的一个方面，提供了一种预测作为用RET药物治疗的候选者的患割每对所述治疗反应的可能性的方法，包括测定来自于该患者的样品中RET的序列在下述如SEQIDNO:l中定义的位置105位不为胸腺嘧啶。在一个实施方案中，所述方纟跑括测定来自于患者的的样品中RET的序列在如SEQIDNO:l中所定义的105位是否不为胸腺嘧啶，由此预测对RET药物反应增加的可能性。在一个实施方案中，所述方法包括测定来自于患者的的样品中RET的序列在下述如SEQIDNO:l中定义的位置105位为胞嘧啶。在一个实施方案中，所述方、跑括测定来自于患者的的样品中RET的序列在如SEQIDN0:1中所定义的105位是否为胞嘧啶，由此预测对RET药物反应增加的可能性。根据本发明的另一个方面，提供了预测作为用RET药物治疗的fl魏者的患者将对所述治疗反应的可能性的方法，包括测定来自于该患者的样品中RET的序列在下述如SEQIDNO:2中定义的位置918位不为甲硫氨酸。在一个实施6方案中，所述方纟跑括测定来自于患者的样品中RET的序列在如SEQIDNO:2中所定义的918位是否不为甲硫氨酸，由此预测对RET药物反应增加的可能性。在一个实施方案中，所述方法包括测定来自于患者的样品中RET的序歹赃下述如SEQIDNO:2中定义的位置918位为苏氨酸。在一个实施方案中，所述方法包括测定来自于患者的的样品中RET的序列在如SEQIDNO:2中所定义的918位是否为苏氨酸，由此预测对RET药物反应增加的可能性。在一个实施方案中，提供了一种预测作为用RET药物治疗的候选者的患者将对所述治疗反应的可能性的方法，包括测定来自于患者的样品中RET的序列在下述如SEQIDNO:l中定义的位置105位是否为胞嘧啶，^*自于该患者的样品中RET的序列在下述如SEQIDNO:2中定义的位置918位是否为苏氨酸，由此预测对RET药物反应增加的可能性。在一个实施方案中，本发明特别适用于在患有斜虫或部分依赖于RET的肿瘤的患者中预测作为用RET药物治疗的候选者的患者对RET药物的反应。在一个实施方案中，本发明特别适用于在患有斜虫或部分依赖于突变RET的肿瘤的患者中预测对RET药物的反应。此种肿瘤包括例如甲状腺癌。在另一个实施方案中，本发明尤其适用于在患有肿瘤的患者中预观树RET药物的反应，所述肿瘤选自甲状腺髓样癌、肾上腺肿瘤(诸如嗜铬细胞瘤)、肺癌(尤其是小细胞肺癌)、乳头状甲状腺癌、间皮瘤和结肠直肠癌。在另一个实施方案中，本发明尤其适用于在患有肿瘤的患者中预测对RET药物的反应，所述肿瘤选自甲状腺髓样癌、肾上腺肿瘤(例如嗜铬细胞瘤)和肺癌(尤其是小细鹏市癌)。在另一个实施方案中，本发明特别适用于在患有制虫或部分依赖于RET的肿瘤患者中预观怖为用RET药物治疗的候选者的患者将对所述治疗反应的可能性。在一个实施方案中，本发明特别适用于在患有单独或部分繊于突变RET的肿瘤的患者中预测作为用RET药物治疗的，魏者的患者将对所述治疗反应的可能性。此种肿瘤包括，例如甲状腺癌。在另一个实施方案中，本发明特别适用于在患有肿瘤的患者中预测作为用RET药物治疗的候选者的患者将对所述治疗反应的可能性，所述肿瘤选自甲状腺髓样癌、肾上腺肿瘤(诸如嗜铬细胞瘤)、肺癌(尤其是小细鹏市癌)、乳头状甲状腺癌、间皮瘤和结肠直肠癌。在另一个实施方案中，本发明特别适用于在患有肿瘤的患者中预领舴为用RET药物治疗的候选者的患者将对所述治疗反应的可能性，所述肿瘤选自甲状腺髓样癌、7肾上腺肿瘤(例如嗜铬细胞瘤)和肺癌(尤其是小细鹏市癌)。在本发明的一个实施方案中提供了一种上文中所述的方法，其中检测RET中核酸突变并由此测定RET序列的方法选自测序、WAVE分析、扩增受阻突变系统(ARMS)和限制性片段长度多态性(RFLP)。ARMS描述于欧洲专利公开号0332435，该内容引入本文作为参考，其公开并要求保护一种选择性扩增差异低达1个m的模版序列的方法，该方法现通常称为ARMS。RFLP见Zhong所述(Zhong等2006ClinicaChimicaActa:364,205-208)。在本发明的一个实施方案中，提供了一种上述的方法，其中测定来自于患者的样品中RET序列的方法选自扩增受阻突变系统、限制性片段长度多态性或WAVE分析中的任何一种。本发明的一个实施方案中，提供了一种上述的方法，其中测定来自于患者的样品中RET序列的方法为扩增受阻突变系统。在一个实施方案中，ARMS可包括使用琼脂糖凝胶、测序凝胶或实时PCR。在一个实施方案中，ARMS包括使用实时PCR。ARMS测定可以与检测反应物中DNA存在第二PCR反应复合(multiplex)，由此表明成功的PCR。TaqManTM技术可采用由不同荧光标记进行标记的TaqManTM探针检测两个反应的PCR产物。采用ARMS而非测序或RFLP来检测突变的优势在于ARMS是较快的单步骤分析，其需要更少的处理和数据分析，并且ARMS可在野生型多核苷酸背景下检测样品中的突变。在一个实施方案中，本发明提供了一种在来自患者的样品中测定RET序列的方法，包括使用能在如SEQIDNO:1所示的105位识别RET序列的ARMS突变正向引物。在本发明的一个实施方案中，提供了一种在来自患者的样品中测定RET序列的方法，包括使用最优化以扩增包括如SEQIDNO:l所示的105位在内的RET序列区域的ARMS突变正向弓卿和ARMS反向弓l物用。本领域技术人员应当理解'最优化以扩增"包括确定正向引物和反向弓l物最合适的长度和位置。在一个实施方案中，最优化所述ARMS突变正向引物和ARMS反向弓l物以扩增少于500个碱基的区域。在一个实施方案中，最优化所述ARMS突变正向引物和ARMS反向引物以扩增少于250个碱基的区域。在一个实施方案中，最优化所述ARMS突变正向引物和ARMS反向引物以扩增少于200个碱基的区域。在一个实施方案中，最优化所述ARMS突变正向弓l物和ARMS反向弓嫩以扩增多于100个iS的区域。在一个实施方案中，所述ARMS突变正向引物能在如SEQIDNO:1中所定义的位置105上识别RET序歹U。在一个实施方案中，所述ARMS突变正向引物包括与SEQIDNO:3中公幵序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。在另一个实施方案中，所述ARMS突变正向弓卿包含SEQIDNO:3。在另一个实施方案中，所述ARMS突变正向引物由SEQEDNO:3组成。在一个实施方案中，所述ARMS反向引物包括与SEQIDNO:4中公开序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序歹)J。在一个实施方案中，所述ARMS反向引物包含SEQDDNO:4。在一个实施方案中，所述ARMS反向引物由SEQIDNO:4组成。锁定核酸(LNA)寡核苷酸含有连接核糖的2'氧禾卩4'碳的亚甲桥。该桥导致锁定的3'内向构象，降低了核糖的构象柔性，瓶高了磷te链的局部组织。Braasch和Corey综述了LNA/DNA杂禾中的性质(Braasch和Corey,2001,Chemistry&Biology8,1-7)。几项研究己表明,包含LNA的弓l物具有改善的对互补DNA序列的亲和力。与相同长度和序列的DNA:DNA复合物相比，掺入单个LNADtt可允许解链温度(Tm)上升最高4rC，且其同样使Tm值升高多达9.6匸。Braasch禾BCorey提出包括LNA碱基对于短于10个碱基的寡核苷酸将具有最大作用。LNA在设计PCR弓卿中的用途的暗示己被综述CLatoira,Arar和Hurley,2003,MolecularandCellularProbes17,253-259)。注意到明确的引物设计规则并没有确立，但PCR引物中LNA置换的最优化是复杂的，且取决于数目、位置和序列背景。Ugozolli^(Ugozolli,Lato呵PucketArar和Hamby,2004,AnalyticalBiochemistry324,143-152)描述了LNA探针在应用5'核酸酶测定的实时PCR中检测SNP的用途。Latorra,ato叫Campbell,Wolter和Hurley,2003，HumanMutation22，79-85)合成了一系列在3'末端和3'末端邻近位置含有LNA碱基的引物，其用作等位基因特异性引物。尽管相对于DNA引物来自错配的LNA序列的弓l发已得到降低，但个别反应的最优化仍是需要的。在一个实施方案中，所述ARMS突变正向引物包含其中一个或多个标准的DNA碱基已被LNA碱基置换的序列。在一个实施方案中，所述ARMS突变正向引物包含与SEQIDNO:9中公开序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。在另一个实施方案中，所述ARMS突9变正向弓嫩包含SEQIDNO:9。在另一个实施方案中，所述ARMS突变正向引物由SEQIDNO:9组成。在一个实施方案中提供了一种能在ARMS测定中与使用上述ARMS突变正向引物和ARMS反向引物所得扩增产物结合的ARMS探针。在一个实施方案中，所述ARMS探针包含与SEQIDNO:5中公开序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。在另一个实施方案中，所述ARMS探针包含SEQIDNO:5。在另一个实施方案中，所述ARMS探针由SEQEDNO:5组成。在一个实施方案中，所述ARMS探针包含其中一个或多个标准DNA碱基已被LNAltt置换的序列。在一个实施方案中，所述ARMS探针包含与SEQIDNO:10中公开序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序歹1」。在另一个实施方案中，所述ARMS探针包含SEQIDNO:10。在另一个实施方案中，所述ARMS探针由SEQIDNO:10组成。在--个实施方案中，所述ARMS探针在5'末端包含YakimaYellowTM荧光标记。在一个实施方案中，所述ARMS探針在3'末端包含BHQtm猝灭剂。本领域技术人员可认识到，探针与扩增产物(且因此探针的序列与其互补)结合的位置仅被确定扩增产物的正向和反向弓l物所安放的边界限定。采用对照探针以证实ARMS测定照预想进行，以及证实在ARMS测定中使用的样品中存在DNA。本领域技术人员可了解，对照探针可耙向任何选择的基因。在一个实施方案中，对照正向引物包含与SEQIDNO:6中公开序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97°/。、98%或99%同一性的序列。在另一个实施方案中，所述对照正向引物弓l物包含SEQIDNO:6。在另一个实施方案中，所述对照正向弓胸引物由SEQIDNO:6组成。在一个实施方案中，对照反向引物包含与SEQIDNO:7中公开的序列具有至少75y。、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。在另一个实施方案中，所述对照反向引物引物包含SEQIDNO:7。在另一个实施方案中，所，照反向引物引物由SEQIDNO:7组成。在一个实施方案中，对照探针包含与SEQIDNO:8中公开的序列具有至少75。/。、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序歹1」。在另一个实施方案中，所述对照探针包含SEQIDNO:8。在另--个实施方案中，所述对照探针由SEQDDNO:8组成。在一个实施方案中，所述对照探针包含其中一个或多个标准DNA碱基已被LNA自置换的序列。在一个实施方案中，所述对照探针包含与SEQIDNO:11中公开序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。在另一个实施方案中，所述对照探针包含SEQEDNO.'ll。在另一个实施方案中，所舰照探针由SEQIDNO:ll组成。在一个实施方案中，所舰照探针在5'末端包含Cy-5荧光标记。在一个实施方案中，所述对照探针在3'末端包含ElleQuencher猝灭剂。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表1ARMS测定引物和探针对照基因为a1抗胰蛋白酶，YakimaYellow和Cy-5是荧光标记，且BHQ(BlackHoleQuencher"禾口ElleQuencher是猝灭剂。粗体下划线的碱基表示错配位置。LNA位置用'+表示，例如+C、+A、+T和+G。在本发明的另一方面，提供了前文中所述的方法，其中该用于测定RET序列的方法包括测定从档案肿瘤切片或其他临床材料中提取的RETmRNA逆转录生成的cDNA的序列。来自福尔马林固定的组织的RNA的提取已描述于Bock等,2001AnalyticalBiochemistiy:295116-117，从非固定组织中提取RNA的禾聘；以及通，转录生成cDNA、PCR扩增和测序的规程描述于SambroobJ.和Russell,D.W.,針克隆实验手册(MolecularCloning:ALaboratoryManual)，第三版，冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，冷泉港(ColdSpringHarbor)，纽约，2001。在本发明的另一个方面中，提供了一种前述的方法，其中所述测定RET序列的方法包括扩增RET基因的个别外显子，个另拼显子的双链体退火，并随后用CelI消化(见Crepin等，2006Endocrinology:36，369-376;和Marsh等,2001Neoplasia:3,236-244所述)。在另一方面，本发明提供了一种突变人RET多核苷酸，其在如SEQEDNO:1中所定义下述位置含有以下核酸碱基105位的胞嘧啶；或其包含至少20个核酸碱基的片段，前体是该片段包含位置105。在另一个方面，本发明提供了一种突变人RET多肽，絲如SEQIDNO:2中所定义的下述位置含有以下氨基酸残基918位的苏氨酸；或其包含至少10个氨基酸残基的片段，前体是该片段包含位置918。在另一方面，提供了在由突变RET基因编码的mRNA中测定RET序列的方法。在本发明的另一方面，提供了本文中所述的方法，其中该用于测定RET序列的方法选自，例如可采用来自单个患者的载玻片的基于免疫组织化学的测定，或组织微阵列(Mayr等,2006AmericanJournalofClinicalPathology:126,101-109;Zheng等，2006AnticancerResearch:26,2353-2360)或备选的蛋白质组方法学的12应用，其可包括裂解细胞、消化蛋白、于凝胶上分离蛋白片段、获得含突变氨基酸的肽并Mil质谱分析法分析i刻太。在另一方面，本发明提供了对，突变人RET多肽特异性的抗体。本发明的另一方面提供了一种诊断试剂盒，包含能检测如SEQIDNO:l中所定义的105位的RET中突变的ARMS突变正向引物，以及任选ARMS反向引物，和任选的使用说明书。在本发明的一个实施方案中，提供了诊断试剂盒，其包含ARMS突变正向引物，所述ARMS突变正向引物包含一个或多个LNA碱基并能识别如SEQIDNO:1中所定义的105位的RET序列，以及任选ARMS反向引物，和任选的使用说明书。在一个实施方案中，所述诊断试剂盒可用于预测作为用RET药物治疗的候选者的患者将对所述治疗反应的可能性的方法中。在备选的实施方案中，所述诊断试剂盒可用于选择作为用RET药物治疗的候选者的患者进行所述治疗。在备选的实施方案中，所述诊断试剂盒可用于评价患者对所述治疗的适合性，所述患者是用RET药物治疗的候选者。本发明的另一方面提供了一种诊断试剂盒，包含对上述定义的突变人RET多肽特异性的抗体，以及任选的使用说明书。在一个实施方案中，所述诊断试剂盒可用于预测作为用RET药物治疗的候选者的患者将对所述治疗反应的可能性的方法中。在备选的实施方案中，所述诊断试剂盒可用于选择作为用RET药物治疗的候选者的患者进行所述治疗。在备选的实施方案中，所述诊断试剂盒可用于评价患者对所述治疗的适合性，所述患者是用RET药物治疗的f魏者。在本发明的另一方面，前述的ARMS弓卿和探针可用于在一组表达野生型或突变RET的细胞系中测定RET的序列。关于细胞系是否表达野生型或突变RET的知识可用于筛选程序中，以鉴定具有对突变RET表型的特异性的新RET抑制剂或具有针对与野生型受体相关的表型的活性的新抑制剂。表达突变RET的细胞系组的可用性将有助于限定通过RET活化的信号传导途径，且可能导致其他治疗介入耙的鉴定。在另一方面，本发明提供了一种制备患者个人化(personalized)基因组概况的方法，包括在下述如SEQIDNO:l中定义的位置105位和/或下述如SEQIDNO:2中定义的位置918位测定来自该患者的样品中RET的序列，并生成捐诚从所述分析中获得的数据的报告。在具体的实施方案中，J:述方法可用于评价RET药物的药物遗传学。药物遗传学是对导舰药物不同反应的遗传变异的研究。通过测定来自患者的样品中的RET序列并分析该患者对RET药物的反应，该RET药物的药物遗传学可得以阐明。在一个实施方案中，所述预测作为用RET药物治疗的候选者的患者将对所述治疗反应的可能性的方法可用于选择用RET药物治疗的肿瘤患者或患者人群。在一个实施方案中，所述预测作为用RET药物治疗的候选者的患割各对所述治疗反应的可能性的方法可用于预测用RET药物治疗的肿瘤患者或患者人群的反应性。来自患者的样品可以是任何肿瘤组织或任何含有源于肿瘤的材料的生物样品，例如含有循环肿瘤细胞或DNA的血液样品。在一个实施方案中，所ML液样品可以是全血、血浆、血清或血小板。在一个实施方案中，肿瘤样品是肿瘤组织样品。所述肿瘤组织样品可以是固定或未固定的样品。在另一个实施方案中，可应用最低侵入性技术获得肿瘤或疑似肿瘤小样品而获得生物样品，从其测定RET序列。在另一个实施方案中，所述生物样品包括单样品，其可被用于测试任何J^的突变，或多样品，其可被用于检测任何Jl^的突变。根据本发明的另一方面，提供了应用i^方法的结果确定RET药物适当剂量的方法。例如预测患者具有对RET药物的反应增加的可能性的知识可用于确定所述RET药物的适当剂量。计算治疗性药物的剂量是一项复杂的工作，需要考虑药物、药物代谢动力学和药物遗传学。给定患者的治疗药物剂量将由其主治医师确定，其中考虑各种已知改变药物作用的因素，包括疾病严重性和，、体重、性别、饮食、施用时间和途径、其他药疗法和其他相关临床因素。治疗有效剂量可Mil体外或体内方法确定。RET药物是RET抑制剂。RET抑制剂是抑制RET活性的试剂。所述试剂可以是抗体或小M。在一个实施方案中，RET抑制剂是RET酪氨^^敫酶抑制剂。RET抑制剂可具有针对其他蛋白的活性，诸如抑制其他酪氨酸激酶例如VEGFR2和/或EGFR的活性。在一个实施方案中，RET抑制剂同样抑制EGFR酪氮酸激酶活性。在一个实施方案中，RET抑制剂同样抑制VEGFR2酪氨酸激酶活性。在一个实施方案中，RET抑制剂同样抑制VEGFR2和EGFR酪氨酸激酶活性。RET、EGFR或VEGFR2酪氨酸激酶抑制剂包括凡德他尼、塞地兰尼(cediranib)(AZD2171,Recentin,(Wedge等，2005CancerResearch:65,43894400))、吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、舒尼替尼(sunitinib)(SU11248,Sutent,Pfizer)、SU14813(Pfizer)、瓦他拉尼(vatalanib)(Novartis)、索拉非尼(sorafenib)(BAY43-9006，Nexavar,Bayer)、XL-647(Exelixis)、XL~999(Exelixis)、AG-013736(Pfizer)、莫替沙尼(motesanib)(AMG706，Amgen)、BIBF1120(Boehringer)、TSU68(Taiho)、GW786034、AEE788(Novartis)、CP-547632(Pfizer)、KRN951(Kirin)、CHTR258(Chiron)、CEP-7055(Cephalon)、OSI-930(OSIPh羅aceuticals)、ABT-869(Abbott)、E7080(Eisai)、ZK-304709(Schenng)、BAY57-9352(Bayer)、L-21649(Merck)、BMS582664(BMS)、XL-880(Exelixis)、XL-184(Exelixis)或XL-820(Exelixis)。在一个实施方案中，RET抑制剂选自凡德他尼、塞地兰尼、舒尼替尼、莫替沙尼或抗体。在一个实施方案中，RET抑制剂为凡德他尼。在一个实施方案中，RET抑制剂为塞地兰尼。在一个实施方案中，RET抑制剂为莫替沙尼。在一个实施方案中，RET抑制剂为舒尼替尼。在一个实施方案中，RET抑制剂为抗体。RET药物的有效量将例如取决于治疗目的、施用途径以及患者的状况。因此，医生,滴定剂量并且如所要需要的那样修^M用途径以获得最佳治疗效果。通常的每日或断续剂量，例如每周、每两周或每月齐糧范围为约0.5mg至最高300mg、500mg、1000mg或1200mg或更高，这依赖于上述提到的因素。我们预期RET药物可用作单一疗法或与其他药物联合。本发明还可用于辅助治疗或用作第一线(first-line)治疗。在一个实施方案中，本发明的方法还包括根据上述方法向选择或预测对用RET药物治疗反应的患者施用RET药物。在本发明的一个实施方案中，提供了RET药物在制备治疗患者或患者群的药物中的用途，所述患者或患者群根据上述方法选择或预测对用RET药物治疗反应。在本发明的一个实施方案中，提供了一种治疗患者或患者群的方法，所述患者或患者群根据前述方法选择或预测具有对RET药物反应的增加的可能性，该方法包括向所述患者施用RET药物。15在本发明的一个实施方案中，提供了治疗作为采用RET药物治疗的候选者的患者的方法，包括(i)确定来自患者的样品中的RET序列在如SEQIDNO:1中定义的下列位置105位是否不为胸腺嘧啶；或(ii)确定来自患者的样品中的RET序列在如SEQIDNO:2中定义的下列位置918位是否不为甲硫氨酸；以及施用有效量的RET药物。在本发明的一个实施方案中，提供了治疗作为采用RET药物治疗的候选者的患者的方法，包括①确定来自患者的样品中的RET序列在如SEQIDNO:l中定义的位置105是否不为胸腺嘧啶；或(ii)确定来自患者的样品中的RET序列在如SEQIDNO:2中定义的位置918是否不为甲硫氮酸；以及施用有效量的RET药物。在本发明的一个实施方案中，提供了一种治疗作为采用RET药物治疗的候选者的患者的方法，包括确定来自患者的样品中的RET序列在如SEQIDNO:1中定义的下列位置105位是否为胞嘧啶；或(ii)确定来自患者的样品中的RET序列在如SEQIDNO:2中定义的下列位置918位是否为苏氨酸；以及施用有效量的RET药物。在本发明的一个实施方案中，提供了一种治疗作为采用RET药物治疗的候选者的患者的方法，包括(i)确定来自患者的样品中的RET序列在如SEQIDNO:1中定义的位置105是否为胞嘧啶；或(ii)确定来自患者的样品中的RET序列在如SEQIDNO:2中定义的位置918是否为苏氨酸；以及施用有效量的RET药物。实施例本发明通过下述非限制性实施例得以阐明，其中图l.显示采用常规DNAAMRS弓I物检测M918TRET突变。空心菱形表示来自IOOO个拷贝的突变DNA的信号，黑色正方形表示来自10000个拷贝的野生型DNA的信号，以及黑色菱形表示来自1000个拷贝的野生型DNA的信16号。图2.显示采用LNA修饰的ARMS弓卿检测M918TRET突变。黑色三角形表示来自1000个拷贝的突变DNA的信号，黑色正方形表示来自1000个拷贝的野生型DNA的信号，且黑色圆圈表示来自10000个拷贝的野生型DNA的信号。常规分子生物学技术描述于"CuirentProtocolsinMolecularBiology"巻1-3，FMAsubel,RBrent和REKingston编辑；JohnWiley出版，1998以及SambrooKJ.和Russell,D.W.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，2001。微靜微麟辦縱俠鄉鉴定肿瘤切片在诊断或外科手术时取自患者。切片用福尔马林固定，且用石蜡包埋。将制备的样品切成切片，其厚度在5-20不等。含有肿瘤的切片区域通过主载玻片的组织病理学鉴定，并从相同肿瘤样品中切下的相邻载玻片的相关区域回收肿瘤材料，见Lynch等，2004NewEnglandJournalofMedicine:3502129-2139所述。其他类型的肿瘤样品可包括例如新鲜或冷冻的组织或循环肿瘤细胞。采用这种样品的技术细节可参见SambroolU.和Russell，D.W.,舒克隆实验手册，第三版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，2001。鄉胁賴载齢縱游腦微给定提取1个切片的体积。通过将来自切片的相关区域刮至eppendorf管中从而从相邻的切片分离在一个切片上经组织病理学鉴定的肿瘤区域。将来自20微米切片的材料重悬浮于0.5Q/。吐温-20(SigmaAldrich)中，加热至9(TC10射中，随后冷却至55。C。向悬浮液中加入蛋白酶K(2Ml，10mg/ml)，混合溶液，且在55。C下温育3小时，伴有偶尔混合。加入Chelex-100TM(C7901,Sigma)(100mJ,溶于TnsEDTA中的5o/。(w/v))，且悬浮液在99。C温育10分钟。通过在10500xg离心15射中回收提取的DNA，将所形成的蜡层下的溶液转移至干净的管中。加热溶液至45。C，然后添加氯仿(100nl)。混合悬浮液后在10500xg再次离心15併中，然后ffiM乙醇沉淀从上层水性层回收DNA。用70X的乙醇冲洗DNA沉淀，通过离心脉冲回收，风干并用水(50ita)溶解。歹/激微/朋r麵e頻77r,f,殿鹏l緣可采用扩增受阻突变系统测定(ARMS)检测与正常DNA背景相比较的RET基因中核苷酸碱基改变的存在。ARMS测定都是对给定突变特异性的，例如经设计以在给定的位置检测一个碱基到另一个碱基的改变。该测定与检测反应物中DNA的存在的第二PCR反应复合，由it據明成功的PCR。TaqMan技术采用由不同荧光标iaiS行标记的TaqManTM探针检测两个反应的PCR产物。在含有不同比例的突变和野生型DNA以及不同浓度的输入DNA的基因组DNA上进行PCR。^PCR使用的总反应体积为25Ml。每个反应中采用1单位的Amplitaq金DNA聚合,80080246,ABI)，以及最终浓度为在缓冲液(最终缓冲组成15mMTns-HClPh8.3,50mMKC1)中的3.5mM的氯化镁，200^MdNTP(脱氧核糖核苷酸三磷酸)和1.0mM的各ARMS突变正向引物和ARMS反向引物短(参见表l)。向各反应中加入终浓度0.5^M的TaqManTM探针(Eurogentech)。循环条件如下在实时PCR仪(例如StratageneMx4000或ABI7900)中95°C，10射中，随后为40个如下循环94°C45秒，60°C45秒，72°C1力H中。在1000个拷贝的野生型DNA背景中可检测到10个拷贝的突变体。实盧斷-鄉^MS翩凿繊賴//線存，脏柳她頻》,殿超效凝福尔马林固定的组织样品来自参加临床试验以评价凡德他尼对偶发性甲状腺髓样癌的活性的患者。如实施例2中所述提取DNA。19例样品可用于进行分析，包括来自单个患者的两个样品。所有的样品一式三份进行分析，且由2名独立的操作者评分。采用扩增受阻突变系统测定(ARMS)检测与正常DNA背景相比较的RET基因中核苷酸碱基改变的存在。该测定与检测反应物中DNA的存在的第二PCR反应复合，由此表明成功的PCR。TaqManTM技术采用由不同荧光标记进行标记的TaqManTM探针检测两个反应的PCR产物。在含有不同比例的突变和野生型DNA以及不同浓度的输入DNA的基因组DNA上进行PCR。每个PCR使用的总反应体积为25nl。^反应中采用1单位的Amplitaq金DNA聚合酶，以及最终浓度为在缓冲液(最终缓冲组成15mMTris-HClPh8.3,50mMKC1)中的3.5mM的氯化镁，200一dNTP禾口1.0mM的各ARMSLNA突变正向引物和ARMS反向引物短(参见表l)。向各反应中加入终浓度0.5^iM的TaqManTM探针。循环条件如下在实时PCR仪(例如StratageneMx4000或ABI7900)中95°C10分钟，随后为40个如下循环94°C45秒，在6(TC1分钟，72。C45秒。有6个样品由于低DNA浓度无法评分。可评价样品的8/13中检测到突变，从而给出突变频率为61.5%。对所有的样品进行测序，以确认突变状态，但序列数据仅能从DNA浓度〉50个拷贝的样品中获得，且因此只有4个样品给出了在密码子918可读的序列。测序获得的结果与ARMS观啶获得的娜完f致。样品标识符DNA拷贝突变状态序列确认E2802001<5测定失败E1701004<5测定失败E170廳<5测定失败E匪OOl<5测定失败E0002001-a<5测定失败E0002004<5测定失败E280腿<5突变E0002005170突变是E2002002240突变是E2002001<5突变E1001002<5突变E1001004<5突变E0002001-b<5突变E0002002430突变E0011003410對生型是E1707002120野生型是E300100190野生型E1201證<5野生型E000200310野生型表2临床样品中的突变賴邻!l两个样品(A-b)来自患者E000200119、微廳盯脏效^4^,/辨微扁微与扁进行试验以确定经设计以检测M918TRET突变的ARMS引物可从野生型DNA产生信号的阈。在代表不同浓度输入DNA的5^1突变^If生型基因组DNA上迸行PCR，每个PCR使用的总反应体积为25|il。每个反应采用1单位的Amplitaq金DNA聚合酶，以及最终浓度为在缓冲液(最终缓冲组成15mMTris-HClPh8.3,50mMKC1)中的3.5mM的氯化镁，200岸dNTP禾口1.0|tiM的各ARMS突变正向弓l物和ARMS反向弓卿短(参见表l)。向各反应中加入终浓度0.5^M的TaqManTM探针。循环条件如下在实时PCR仪(例如StratageneMx4000或ABI7900)中95。C10射中，随后为45个如下循环94°C45秒，在6(TC45秒，72。Cl併中。采用常规DNAARMS引物在29个循环产生了来自于IOOO个拷贝的突变DNA的信号(图l)。然而，在含有1000或10000个拷贝的野生型DNA样品中同样产生信号。尽管来自野生型DNA的信号通常分别在35和32个循环产生，但从野生型DNA获得信号的可能性限制了常规DNAARMS引物在含有正常和肿瘤组织混合物对于固定的肿瘤样品常见临床环境中的使用。采用LNA修饰的弓I物进行了类似的试验。在该试验中，从含有1000个拷贝突变DNA的样品在31个循环产生了信号，但是从含有1000或10000个拷贝的野生型DNA的样品甚至在分析扩展至45个循环时也均无信号产生(图2)。实施例6-用于治疗的患者选择肿瘤样品中RET基因中突变的检观何用于改进对作为用凡德他尼或其他RET酪氨酸激酶抑制剂治疗(作为单一治疗或联合治疗)的fl魏者的患者的选择，从而预测对凡德他尼或其他RET酪氮酸激SW制剂反应的增加的可能性。权利要求1.一种预测作为用RET药物治疗候选者的患者将对所述治疗反应的可能性的方法，包括确定来自患者的样品中的RET序列在如SEQIDNO1中定义的105位是否不为胸腺嘧啶；或在如SEQIDNO2中定义的918位是否不为甲硫氨酸，由此预测对RET药物的反应增加的可能性。2.权利要求l的方法，其中105位为胞嘧啶，或918位为苏氨酸。3.权利要求1或2的方法，其中105位为胞嘧啶。4.权利要求1-3的方法在评价RET药物的药物遗传学中的用途。5.治疗作为采用RET药物治疗的fl魏者的患者的方法，包括(i)确定来自患者的样品中的RET序列在如SEQIDNO:1中定义的105位是否不为胸腺嘧啶；或(ii)确定来自患者的样品中的RET序列在如SEQIDNO:2中定义的918位是否不为甲硫氨酸，以及施用有效量的RET药物。6.权利要求5的方法，其中105位为胞嘧啶，或918位为苏氨酸，以及施用有效量的RET药物。7.权利要求5或6的方法，其中105位为胞嘧啶。8.权禾頓求3或7的方法，其中测定来自患者的样品中RET序列的方法选自扩增受阻突变系统、限制性片段长度多态性或WAVE分析的任一种。9.权禾腰求8的方法，其中测定来自患者的样品中RET序列的方法为扩增受阻突变系统。10.权利要求3、7、8或9的方法，包括使用能在如SEQIDNO:l所定义的105位识别RET序列的ARMS突变正向弓卿。11.权利要求3、7、8、9或10的方法，包括^[顿最优化以扩增包含如SEQIDNO:1所定义的105位的RET序列区域的ARMS突变正向引物和ARMS反向引物。12.权利要求10或11的方法，其中所述ARMS突变正向弓卿包含SEQIDNO:9。13.前述任一权利要求的方法，其中所述RET药物为RET酪氨酸激酶抑制剂。14.权利要求13的方法，其中所述RET药物为凡德他尼。15.权禾腰求13的方法，其中所述RET药物为塞地兰尼。16.能在如SEQIDNO:1所定义的105位识别RET序列的ARMS突^IE向引物。17.权利要求16所述的ARMS突变正向引物，包含SEQIDNO:9。18.包含权利要求16或17的ARMS突变正向弓l物诊断试剂盒。专利摘要本发明提供了一种选择患者的方法，所述患者是采用RET药物治疗的候选者，由此预测对RET药物反应的增加的可能性。本发明提供了一种测定RET序列的方法。所述方法提供了最优化用于测定RET序列的ARMS引物。本发明同样提供了包含ARMS引物的诊断试剂盒。文档编号C12Q1/68GKCN101512017SQ200780033035公开日2009年8月19日申请日期2007年9月6日发明者A·J·瑞安,A·伍基,J·舍伍德申请人:阿斯利康(瑞典)有限公司导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan