ora capsici Leon)已成为我国辣椒生产上的最重要病害，分布极为广泛，危害 十分严重。
[0025] 由于辣椒疫病发生的普遍性和所引起病害的严重性，而且传播途径多样，病害发 生常呈现暴发性，导致生产上还没有出现有效防治疫病的方法。为了有效的防治辣椒疫病 的发生，选择抗病品种是一种最经济、安全、可靠的方法。但采用传统育种手段进行优良辣 椒抗病品种的选育，存在工作量大、育种周期长、选择效率较低等缺点，而随着农业生物技 术的快速发展，借助分子标记辅助选择技术可以大大提高育种效率。我们应用本发明的方 法，结合辣椒转录组和全基因组测序数据库可以高效的获得辣椒疫病抗性候选基因，利用 生物信息学软件开发SNP分子标记，获得的辣椒疫病抗性候选基因分子标记能有效地用于 辣椒疫病抗性育种。
[0026] 本实例以辣椒高抗疫病材料CM334、K01、K43和K44以及高感疫病材料G29、G34和 G35作为研宄试材，采用本发明方法可以高效的获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记。实 施过程如下：
[0027] 1)辣椒转录组测序：利用辣椒高抗疫病材料（K43)和高感疫病材料（G29)杂交获 得F 1, F1自交获得F 2，对F2群体进行辣椒疫霉菌接种，分别采集F 2群体接种0天和5天后 的样品备用。接种辣椒疫霉菌10天后，调查F2群体发病情况（图1)，分别选取15株辣椒 高抗和高感疫病单株构建辣椒疫病抗、感基因池，命名为KCO (抗池对照）、KC5 (接种5天后 的抗池）、GC0 (感池对照）和GC5 (接种5天后的感池），利用Illumina HiSeq?2000对抗、 感池分别进行转录组测序。
[0028] 2)差异基因表达分析：利用生物信息学软件对4个基因池的测序数据进行合并 组装，首先将各样品数据进行低质量过滤，使Q20达到99%以上，再将过滤后各样品数据 合并在一起根据相似度进行聚类，在聚类单元中选取最长的序列作为Unigene序列，完成 Unigene库的构建，利用RPKM值反映对应Unigenes的表达丰度，再利用生物信息学软件 EBSeq筛选出在辣椒疫病抗、感基因池之间差异表达的基因，共获得了 476个差异表达基 因。
[0029] 3)差异基因功能注释：在NCBI网站上使用BlastruBlastp和InterProscan软件 对筛选到的差异表达基因进行数据库比对，获得差异表达基因的注释信息和蛋白质功能预 测结果（图2)，根据注释信息和蛋白质功能预测结果进一步筛选出与辣椒疫病抗性相关的 差异表达基因及辣椒疫病抗性相关基因46个。然后利用上述46基因片段，在辣椒全基因 组数据库(http: "DeDDergenome. snu. ac. kr和 http: "DeDDerseauence. genomics, cn)中 进行Blastn比对，获得辣椒疫病抗性相关基因完整的开放阅读框（ORF)，表1为部分辣椒疫 病抗性相关基因的序列分析结果。
[0030] 4)SNP位点的鉴定：针对所获得的抗性相关基因 ORF的序列特征，利用生物信息 学软件设计特异引物。对具有不同疫病抗性能力的辣椒材料（CM334、KOI、K43、K44、G29、 G34和G35)进行扩增，扩增产物经琼脂糖电泳后，回收、克隆并测序。利用生物信息学软 件DNAman对具有不同疫病抗性能力的辣椒材料的扩增产物进行序列比对，找出在高抗和 高感疫病辣椒材料中的SNP位点。最后，在5个疫病抗性相关基因中找出了理想的SNP位 点（图3)，5个抗性相关基因分别命名为CARpi-1，CARpi-2, CARpi-3, CARpi-I，CARpi-4和 CARpi-5。5个抗性相关基因在2个辣椒全基因组数据库中对应的ID号分别为CA05g05500、 CAllg04330、 CAllg04340、 CAllgl4390、 CA04gl7640(http://peppergenom e.snu. ac.kr)和 Capana03g001869、Capanallg001783、Capanallg001784、Capana03g003521 和 Capana04g000689(http://peppersequence. genomics, cn)〇
[0031] 5)辣椒疫病抗病分子标记的开发及应用：针对上述5个基因在具有不同疫病抗性 能力的辣椒材料中所鉴定到的SNP位点特征，利用生物信息学软件设计特异SNP引物对高 抗和高感辣椒疫病材料以及高抗疫病材料K43和高感疫病材料G29杂交自交获得的&群 体进行扩增，同时对高抗、高感以及F 2群体进行辣椒疫霉菌接种，10天后调查发病情况。最 后，SNP标记扩增结果结合上述材料的疫霉菌接种鉴定结果，筛选到只在高抗材料中扩增出 条带，而在感病材料中无扩增条带的引物（图4)，此类引物对应的基因即为辣椒疫病抗性 候选基因。
[0032] 表1 20个辣椒疫病抗性相关基因的序列分析
[0033]
【主权项】
1. 一种获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记的方法，该方法包括： 1) 辣椒转录组测序：利用辣椒高抗和高感疫病材料杂交获得F1, F1自交获得F 2，对&群 体进行辣椒疫霉菌接种，分别采集&群体接种O天和5天后的样品备用；接种辣椒疫霉菌 10天后，调查F 2群体发病情况，分别选取15株辣椒高抗和高感疫病单株构建辣椒疫病抗、 感基因池，命名为KCO (抗池对照)、KC5 (接种5天后的抗池)、GCO (感池对照）和GC5 (接 种5天后的感池)，利用测序仪器对抗、感池分别进行转录组测序； 2) 差异基因表达分析：利用生物信息学软件对4个辣椒疫病抗、感基因池的测序数据 进行合并组装，首先将各样品数据进行低质量过滤，使Q20达到99%以上，再将过滤后各样 品数据合并在一起根据相似度进行聚类，在聚类单元中选取最长的序列作为Unigene序 列，完成Unigene库的构建，利用RPKM值反映对应Unigenes的表达丰度，再利用生物信息 学软件EBSeq筛选出在辣椒疫病抗、感基因池之间差异表达的基因； 3) 差异基因功能注释：在NCBI网站上使用BlastruBlastp和InterProscan软件对筛 选到的差异表达基因进行数据库比对，获得差异表达基因的注释信息和蛋白质功能预测结 果，根据注释信息和蛋白质功能预测结果进一步筛选出与辣椒疫霉病抗性相关的差异表达 基因；然后利用上述差异表达基因片段，在辣椒全基因组数据库（http://p印pergenome. snu.ac.kr 和 http:// peppersequence.genomics.cn)中进行 Blastn 比对，获得差异表达 基因即辣椒疫病抗性相关基因完整的开放阅读框（ORF); 4. SNP位点的鉴定：针对所获得的辣椒疫病抗性相关基因 ORF的序列特征，利用生物信 息学软件设计特异引物；对辣椒高抗疫病和高感疫病材料进行扩增，扩增产物经琼脂糖电 泳后，回收、克隆并测序；利用生物信息学软件DNAman对高抗和高感疫病辣椒材料的扩增 产物进行序列比对，找出辣椒疫病抗性相关基因序列在高抗和高感疫病辣椒材料中存在的 SNP位点； 5) 辣椒疫病抗性候选基因的获得：针对辣椒疫病抗性相关基因序列在辣椒高抗和高感 疫病材料中所鉴定到的SNP位点特征，利用生物信息学软件设计特异SNP引物对高抗和高 感辣椒疫病材料以及高抗和高感疫病材料杂交、自交获得的F 2群体进行扩增，同时对高抗、 高感以及F2群体进行辣椒疫霉菌接种，10天后调查发病情况；最后，SNP标记扩增结果结合 上述材料的疫霉菌接种鉴定结果，筛选到只在高抗材料中扩增出条带，而在感病材料中无 扩增条带的引物，此类引物对应的基因即为辣椒疫病抗性候选基因。
2. 权利要求1所述的一种获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记的方法的应用，其特 征在于包括： 1)辣椒疫病抗性候选基因及分子标记的方法为先进行辣椒疫病转录组测序找到差异 表达 基因，再进行差异表达基因的功能注释以及蛋白质功能预测，找到与其他作物疫病抗 性基因 同源性较高的辣椒疫病抗性相关基因，再根据抗性相关基因设计引物，在不同辣椒抗、 感疫 病材料中扩增，比对序列差异，发现存在与抗、感辣椒疫病材料中的SNP位点，再根据 SNP 位点特征设计特异进行引物的有效性验证，最后获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标 记； 2) 用于辣椒转录组测序样品为高抗和高感辣椒疫病材料杂交、自交获得的&群体经接 种辣椒疫霉菌0-5天抗之内的抗、感基因池； 3) 获得的5个辣椒疫病抗性候选基因分别为6?你 i-1，6?你 i-2, 6?你 i-3, 6?你 i-1， 6?你 i-4和6?你 i-5,5个基因对应的在2个辣椒全基因组数据库中对应的ID号分别为 CA00g85670、CAllgl4390、CA03g00800、CA10gl2800 和 CAllg04330 (http:/A^ppergenom e. snu. ac. kr)和 Capana02g001506、Capanallg000418、Capana03g004163、Capanal0g001567 和 Capanallg001783 (http://peppersequence. genomics, cn)； 4) 利用辣椒疫病抗性候选基因开发的SNP分子标记用于辣椒疫病抗性育种材料的选 育。
【专利摘要】一种获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记的方法及应用，该方法是一种利用辣椒疫病转录组和全基因组测序数据信息、差异表达基因鉴定、生物信息学分析、分子标记开发以及疫霉菌接种鉴定来获得辣椒疫病抗病候选基因，属于辣椒生物技术领域。该方法包括辣椒高抗、高感疫病材料构建的F2群体接种疫霉菌后获得的疫病抗、感基因池转录组测序、差异基因表达分析和功能注释、辣椒疫病高抗、高感材料基因组DNA提取、引物设计和PCR扩增、序列差异分析和SNP位点鉴定、SNP特异引物设计及有效性验证等步骤，高效的获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记。该发明可以精准地鉴定出辣椒疫病抗性候选基因及开发有效的分子标记。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104560973
【申请号】CN201410811975
【发明人】刁卫平, 王述彬, 刘金兵, 潘宝贵, 戈伟, 郭广君, 高长洲
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月24日