基于内吗啡肽2和npff受体拮抗剂rf9的分叉型杂交肽及其合成方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生化技术领域，涉及一类基于内源阿片肽一一内吗啡肽2和NPFF受体 拮抗剂RF9的分叉型杂交肽及其合成方法。本发明同时还涉及上述分叉型杂交肽EKR和 RKE在受体激动、痛觉调节、耐受和成瘾、便秘等方面的药理学活性。
【背景技术】
[0002] 疼痛在临床医学治疗和病人生活质量提尚等方面都具有重要意义。目如，临床最 广泛应用的阿片类镇痛药物常伴随一些副作用，如镇痛耐受、便秘和成瘾等，从而大大限制 了其临床应用。因此，研宄和开发低副作用的高效镇痛新药具有广阔的应用前景。
[0003] 研宄表明，在保持阿片药物镇痛活性的同时有效减少其副作用的策略主要有以下 三种：一、以其母体为模板，通过化学修饰来筛选出受体选择性较高和具有优势构象的类 似物，从而达到保持较高生物活性并降低其副作用目的，如高选择性阿片类配体的筛选。 二、通过阿片类物质与其它药物的联合使用，使它们发挥镇痛增效作用，从而降低阿片药 物的给药剂量来减少其副作用，如大麻和阿片的联合注射2003，303:308)。三、 基于阿片肽与其它系统的配体而构建全新的多靶标药物，使其同时作用于多个作用位点， 在发挥阿片镇痛活性的同时通过其他系统的调节作用来降低其副作用。目前，人们在阿 片类嵌合肽研宄方面已取得了一定的进展，如内吗啡肽2 (EM-2)和速激肽P物质构成的 杂合肽ESP7 (/￥oc. JcatZ5bi.K5：冼 2000，97:7621)、基于EM-2 和NPFF的 嵌合肽EN-9 (ZL201110097843. 4)和基于阿片肽Biphalin和神经肽FF的嵌合肽BN-9 (ZL201210098832. 2)。
[0004] 众所周知，EM-2是从哺乳动物脑内提取到的内源性阿片肽之一，其对Mu阿片受体 具有极高的选择性和亲和性，同时又能激活Kappa阿片受体（他tore，1997，499:502)。 而神经肽FF被认为是内源的阿片调节肽（Ci/rr.Tb/7. 泛￡竭2005，5:341hNPFF在 不同水平的注射表现出或原阿片或抗阿片的活性1998，167:172)。 尤其是NPFF系统在阿片的耐受和成瘾方面具有显著的调节作用，如NPFF系统的选择性拮 抗剂RF9能完全抑制长期使用阿片类引起的痛觉过敏和阻止伴随的镇痛耐受的产生 K5：A2006，466:471 和 2012，165:424)。在以上 研宄基础上，本实验室基于EM-2与RF9而构建全新的分叉型杂交肽，以期同时具有阿片受 体激动剂和NPFF拮抗剂的药理学功能，这样可能在保持EM-2镇痛活性的同时尽量减少其 阿片耐受等副作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的主要目的是针对现有镇痛药物中存在的问题，提供一种副作用低、镇痛 效果好的基于内源阿片肽EM-2和NPFF受体拮抗剂RF9的分叉型杂交肽EKR和RKE; 本发明的另一目的是提供上述分叉型杂交肽EKR和RKE的合成方法。
[0006] 本发明还有一个目的，就是提供上述分叉型杂交肽EKR和RKE在受体激动、痛觉调 节、耐受和成瘾、便秘等方面的药理学活性，以期在制备镇痛药物中得到应用。
[0007](-）基于内源阿片肽EM-2和NPFF受体拮抗剂RF9的分叉型杂交肽 本发明基于内源阿片肽EM-2和NPFF受体拮抗剂RF9的分叉型杂交肽EKR和RKE，是以 内源阿片肽EM-2和神经肽NPFF系统的拮抗剂RF9为化学模板，以Lys作为化学连接子而 构建的分叉型杂交肽。其结构为下式结构之一：
【主权项】
1. 基于内源阿片肽内吗啡肽2和NPFF受体拮抗剂RF9的分叉型杂交肽，其化学结构式 为下式之一：
2. 如权利要求1所述基于内源阿片肽内吗啡肽_2和NPFF受体拮抗剂RF9的分叉型杂 交肽的合成方法，包括以下工艺步骤： i.EKR、RKE的合成 i.i树脂预处理：Rink-Amide-MBHA树脂在二氯甲烷中搅拌，使树脂充分溶胀后减压抽 干溶剂； I.ii脱除Fmoc基团保护：在溶胀、抽干溶剂的树脂中，加入六氢P比啶、1,8-二氮杂二环i^一碳-7-烯、DMF的混合溶液，搅拌反应5min后抽干，重复3次；最后加入DMF洗涤，茚 检，得到脱除Fmoc基团保护的树脂； !.出连接子Lys的缩合：依次将N-(9-芴甲氧羰酰基）-N'_甲基三苯甲基-L-赖氨 酸Fmoc-Lys(Mtt) -〇H、N-羟基苯并三氮唑、0-苯并三氮唑-N，N，N'，N' -四甲基脲-六氟磷 酸盐完全溶解于DMF中，再加入二异丙基乙胺后混匀得混合溶液；然后加至步骤i.ii所得脱 除Fmoc基团保护的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60min，抽干溶剂；用DMF重复洗绦、抽 干，茚检后按步骤^ .ii的工艺脱除Fmoc基团保护，得到脱除Fmoc保护基团的肽树脂； 1 .iv主链延长 ERK的主链延长：将步骤i.iii所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤i.ii、步骤i ? iii的工艺依次完成Fmoc-Phe-〇H、Fmoc-Phe-〇H、Fmoc-Pr〇-〇H和Boc-Tyr(tBu)-OH的缩合 和脱Fmoc基团保护，并保留Boc-Tyr(tBu)-OH的Boc保护基团，得到肽树脂Boc-Tyr(tBu) -Pro-Phe-Phe-Lys(Mtt)-Resin； RKE的主链延长：将步骤I.iH所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤：.it、步骤t ? iii的工艺依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OHU-金刚烷酸的缩合和脱Fmoc基团 保护，得到肽树脂卜金刚烧酰基化-Phe-Arg(Pbf)-Lys(Mtt)-Resin; i.VLys侧链Mtt保护基团的脱除：将步骤i.iv得到的肽树 脂Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-Lys(Mtt)-Resin或 1-金刚烧酰基 化-Phe-Arg(Pbf)-Lys(Mtt)-Resin抽干溶剂后，加入体积浓度 1%~1. 5% 的TFA/DCM溶液，搅拌90~120s后抽干，重复50次；最后加入DMF冲洗，得到脱除Lys侧 链Mtt基团保护的肽树脂Boc-Tyr(tBu) -Pro-Phe-Phe-Lys-Resin或1-金刚烧酰基 化-Phe-Arg(Pbf)-Lys-Resin; I.vi侧链延长 EKR侧链延长：将步骤1?V所得肽树脂Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-Lys-Resin按步骤 ! ?H、步骤！ ?iii的工艺依次完成Fmoc-Phe-〇H、Fmoc-Arg(Pbf)-〇H、l-金刚烷酸的缩合和脱 Fmoc基团保护，得到的肽树脂为Lys侧链连有1-金刚烧酰基化-Phe-Arg(Pbf)-结构的Bo c-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-Lys-Resin; RKE侧链延长：将步骤i.1?所得肽树脂1-金刚烧酰基化-Phe-Arg(Pbf)-Lys-Resin按步骤i?ii、步骤1?iii的工艺依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH 和Boc-Tyr(tBu) -OH的缩合和脱Fmoc基团保护，得到的肽树脂为Lys侧链连有 Boc-Tyr(tBu) -Pro-Phe-Phe-结构的 1-金刚烧酰基化-Phe-Arg(Pbf) -Lys-Resin; d.EKR和RKE的肽链从树脂上的切割：将步骤！ .w所得肽树脂用DCM、MeOH交替洗， 充分抽干溶剂后，加入切割剂，于室温下切割反应2~3小时；过滤，滤液在不高于37°C的条 件下充分减压旋干，然后用不高于-l〇°C的乙醚析出沉淀；吸出上清液弃之，加水充分溶解 沉淀后将乙醚从水相中分离除去，水相通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末； iii.EKR和RKE的脱盐和纯化：以体积浓度15~20%乙酸溶液为流动相，过S印hadex G25交联葡聚糖凝胶柱；利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得脱盐的肽化合物；再用反 相高效液相色谱柱对脱盐的肽化合物进行分离纯化，经分离后收集样品主峰。
3. 如权利要求1所述基于内源阿片肽内吗啡肽_2和NPFF受体拮抗剂RF9的分叉型杂 交肽的合成方法，其特征在于：步骤i.ii所述混合溶液中，六氢吡啶、1，8_二氮杂二环十一 碳-7-烯、DMF的体积比为1:1:98。
4. 如权利要求1所述基于内源阿片肽内吗啡肽_2和NPFF受体拮抗剂RF9的分叉型杂 交肽的合成方法，其特征在于：步骤s.iii中，Fmoc-Lys(Mtt)-〇H、N-羟基苯并三氮挫、0-苯 并三氮唑-N，N，N'，N' -四甲基脲-六氟磷酸盐以等摩尔完全溶解于DMF中。
5. 如权利要求1所述基于内源阿片肽内吗啡肽_2和NPFF受体拮抗剂RF9的分叉型 杂交肽的合成方法，其特征在于：步骤I.ni中，二异丙基乙胺的摩尔量为N-(9-芴甲氧羰酰 基）-N' -甲基三苯甲基-L-赖氨酸量的2倍。
6. 如权利要求1所述基于内源阿片肽内吗啡肽_2和NPFF受体拮抗剂RF9的分叉 型杂交肽的合成方法，其特征在于：步骤：.班中，N-(9-芴甲氧羰酰基）-N'_甲基三苯甲 基-L-赖氨酸量为脱除Fmoc基团保护的树脂摩尔量的2~4倍。
7. 如权利要求1所述基于内源阿片肽内吗啡肽_2和NPFF受体拮抗剂RF9的分叉型杂 交肽的合成方法，其特征在于：步骤U中采用的切割剂是由三氟乙酸、三异丙基硅烷、水以 95:2. 5:2. 5的体积比混合形成的溶液。
8. 如权利要求7所述基于内源阿片肽内吗啡肽-2和NPFF受体拮抗剂RF9的分叉型杂 交肽的合成方法，其特征在于：切割剂的加入量为每克肽树脂加入l〇~25ml的切割剂。
9.如权利要求1所述基于内源阿片肽内吗啡肽-2和NPFF受体拮抗剂RF9的分叉型杂 交肽在制备镇痛药物中的应用。
【专利摘要】本发明提供了基于内源阿片肽内吗啡肽2和神经肽FF受体拮抗剂RF9通过Lys化学连接而构建的分叉型杂交肽EKR和RKE。体外功能性检测表明：EKR和RKE都能激活Mu阿片受体，均为阿片类激动剂；体内活性检测发现，侧脑室注射EKR和RKE都能引起显著的中枢镇痛活性，其镇痛作用的EC50值分别为6.127(5.372，6.989)nmol和4.523(4.043，5.058)nmol，并且在有效镇痛剂量范围内(5，10，20nmol)，侧脑室注射EKR和RKE都不引起阿片类镇痛药物常见的便秘副作用。因此，EKR和RKE能介导低副作用的镇痛活性，具有用于临床疼痛治疗的潜在应用价值。
【IPC分类】C07K1-06, A61K38-08, A61P25-04, C07K1-04, C07K7-02
【公开号】CN104710508
【申请号】CN201510123629
【发明人】王锐, 方泉, 李宁, 韩政岚, 王子龙
【申请人】兰州大学
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年3月20日