一种牛血清白蛋白纳米微球的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医用高分子材料领域，具体涉及一种基于蛋白二聚作用制备牛血清白蛋白纳米微球的方法。
【背景技术】
[0002]基于天然高分子的纳米微球材料具有优异的生物相容性和可调的生物降解性，可用于药物、蛋白或基因的包埋和释放，目前已广泛用于药物控释、组织工程和再生医学等领域的研究。通常，药物在体内代谢较快，而频繁注射给药则会给病人带来极大的痛苦。选择合适的纳米载药体系，可实现药物在体内的缓慢释放，达到理想的治疗效果。在组织工程和再生医学领域，纳米微球常用于包埋细胞生长因子和基因，以提高细胞支架的生物活性，增加支架在体内的组织诱导能力。常用来制备纳米微球的天然高分子包括:牛血清白蛋白、明胶、壳聚糖、淀粉及纤维素等。
[0003]基于天然高分子材料的纳米微球在制备工程中必须添加化学交联剂处理，其结构才能稳定。这些化学交联剂主要有多聚甲醛、戊二醛、水溶性碳化二亚胺和京尼平等，其作用是将天然高分子中的活性基团(如氨基、羧基和羟基等)经过缩合而达到交联的目的。虽然化学交联剂能使纳米微球在物理结构上比较稳定，但会导致包埋的活性蛋白类药物(如细胞生长因子等)变性而失活，不适合用于活性蛋白的传递；同时，化学交联剂具有细胞毒性，容易残留在材料中。如能避免使用有毒的化学交联剂，则有望得到高生物活性的纳米微球材料，这是降低材料毒性及提高药物输送效率的有效途径。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种制备牛血清白蛋白纳米微球的方法，避免使用有毒的化学交联剂，能保证材料的使用安全性和被包埋药物的生物活性。
[0005]实现本发明目的的技术解决方案为:
一种牛血清白蛋白纳米微球的制备方法，采用双端马来酰亚胺化聚乙二醇为交联分子，通过蛋白二聚作用及反相溶液法交联制备牛血清白蛋白，包括以下步骤:
步骤1、室温下将牛血清白蛋白溶于氯化钠溶液中；
步骤2、氩气保护下加入双端马来酰亚胺化聚乙二醇溶液；
步骤3、室温搅拌下滴加氢氧化钠溶液，调节pH ；
步骤4、室温搅拌下滴加反相溶剂，至溶液混浊后停止搅拌；
步骤5、高速离心得到纳米微球，洗涤、冷冻、干燥后得到牛血清白蛋白纳米微球。
[0006]其中，步骤I中所述牛血清白蛋白在氯化钠溶液中的质量浓度为2?5%。
[0007]步骤2中所述双端马来酰亚胺化聚乙二醇溶液的质量浓度为0.4?1%。
[0008]步骤3中加入双端马来酰亚胺化聚乙二醇后，混合溶液pH值调节至7?9。
[0009]步骤4中加入滴加的反相溶剂为丙酮或无水乙醇，滴加量为混合溶液体积的6?8倍。
[0010]步骤5中先后用蒸馏水、无水乙醇洗涤。
[0011]本发明采用双端马来酰亚胺化聚乙二醇为交联分子，在一定条件下能使牛血清白蛋白发生二聚作用产生交联而得到稳定的纳米微球。双端马来酰亚胺化聚乙二醇分子结构中含有马来酰亚胺基，它能与牛血清白蛋白分子中的巯基发生迈克尔加成反应，同理含有马来酰亚胺基的其它水溶性聚合物材料亦可作为交联分子。
[0012]本发明制备的牛血清白蛋白纳米微球分布均匀，平均直径可控制在27?88纳米。纳米微球的直径随着牛血清白蛋白溶液的浓度的增加而变大，而乙二醇浓度对纳米微球的尺寸影响不大。本发明所制备的多聚糖纳米微球结构稳定，在磷酸盐缓冲溶液中培养24小时后直径变化很小，适用于体内药物治疗。
[0013]原料和试剂:牛血清白蛋白，购于南京生兴生物技术有限公司；双端马来酰亚胺化聚乙二醇，购于上海西宝生物科技有限公司；丙酮，分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司；磷酸氢二钠、无水乙醇，分析纯，成都科龙化工试剂厂。氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、氢氧化钠，分析纯，南京化学试剂有限公司。磷酸盐缓冲溶液的配制:称取分析纯氯化钠8克、氯化钾0.2克、磷酸氢二钠2.9克、磷酸二氢钾0.2克，溶于1000毫升蒸馏水中。
[0014]纳米微球的粒径检测:纳米微球的直径通过纳米粒度分析仪(Malvern ZetasizerNano ZS)测算。
[0015]纳米微球的形貌检测:将干燥后的纳米微球喷金(Cressington 108 Auto),在扫描电子显微镜(JSM-6330F，JEOL)上观察微观形貌。
[0016]本发明采用ANOVA方差分析法，显著差异值/7设为< 0.05。
[0017]本发明与现有技术相比，其显著优点是:I)避免使用了有毒化学交联剂，所制备的纳米微球中不存在毒性残留，保证了纳米微球的安全性；2)所涉及的蛋白二聚作用基于牛血清白蛋白与聚乙二醇分子之间，不与被包埋活性药物发生化学反应，能有效保护药物的生物活性，特别适用于基因、活性蛋白类药物的包埋与传递；3)本发明工艺和设备简单、易行、操作安全，同时具有制备温度低、处理周期短等优点，适合商业化生产。
[0018]下面结合附图对本发明做进一步详细的描述。
【附图说明】
[0019]图1本发明制备纳米微球的示意图。
图2为本发明实施例1纳米微球的直径与牛血清白蛋白浓度的关系。
[0020]图3为本发明实施例1纳米微球的直径与聚乙二醇浓度的关系。
[0021]图4为本发明实施例1纳米微球的直径与pH值的关系。
[0022]图5为本发明实施例1纳米微球的直径分布在37°C磷酸盐缓冲溶液中孵育24小时后的变化(实线为孵育前，虚线为孵育后)。
【具体实施方式】
[0023]本发明提供的一种制备牛血清白蛋白纳米微球的方法，其步骤包括:
步骤1、配制浓度为1mM的氯化钠水溶液，将10(T250mg牛血清白蛋白溶解于5ml氯化钠溶液；
步骤2、将r1mg双端马来酰亚胺化聚乙二醇溶解于Iml氯化钠溶液中，氩气保护下滴加到牛血清白蛋白溶液中，室温下搅拌2?4小时；
步骤3、室温搅拌下滴加浓度为IN的氢氧化钠溶液，调节混合溶液pH值为7、；
步骤4、室温搅拌下滴加61倍体积的丙酮或乙醇，至溶液混浊；
步骤5、高速离心得到纳米微球，随后分别用蒸馏水、无水乙醇清洗，最后冷冻干燥。
[0024]实施例1:
(1)配制浓度为1mM的氯化钠水溶液，将100牛血清白蛋白溶解于5ml氯化钠溶液，制备示意图见图1，牛血清白蛋白浓度与纳米微球直径的