表达载体系统/反义寡核苷酸抑制micorRNA表达 实验及NSCLC细胞试验
[0033] A构建microRNA的Lentivirus过表达载体，其中设计有报告基因。
[0034] B采用稳转技术将microRNA过表达载体转染入NSCLC细胞。transwell技术监 控各细胞株的表型变化；Real-timePCR技术分析microRNA和对应靶基因的表达量情况； Western实验考察靶基因的蛋白表达变化；
[0035] C修饰后的反义寡核苷酸使用Lipofectamine转染NSCLC细胞，transwell技术 监控各细胞株的表型变化；Real-timePCR技术分析microRNA和对应靶基因的表达量情况； Western实验考察靶基因的蛋白表达变化。
[0036] (6)动物模型实验
[0037] A Lentivirus过表达的microRNA载体转染后的NSCLC细胞皮下接种裸小鼠；
[0038] B观察接种细胞后的小鼠体内细胞成瘤情况及肿瘤转移情况。
[0039] (7) microRNA的血清检验，评估差异microRNA作为NSCLC早期血清标志物的可能 性
[0040] A收集病人相应术前、术后和复发后外周血样本；
[0041] B -小时内分离出血清；
[0042] C Real-timePCR技术检测血清中游离microRNA的表达量；
[0043] D对血清microRNA变化情况与相应病理随访资料进行关联分析，考察患者在不同 的病理阶段，血清内相应的microRNA的表达量变化情况。确认候选microRNA作为NSCLC 早期血清标志物的可能性，及应用于临床NSCLC监控的实用性。
[0044] 本发明的有益之处在于：
[0045] 1.对hsa-miR-1280在癌组织和远端正常组织敏感性和特异性方面进行比较，AUC =0. 772,最佳临界点时的敏感度为46. 4%，特异性为95. 7%，因此具有很强的可行性，较 好的应用前景和推广价值。
[0046] 2. hsa-miR-1280可以作为一种有效的肿瘤标志物用于癌症的早期诊断，甚至可以 作为肿瘤治疗的靶点，指导临床用药。
[0047] 3.预测hsa-miR-1280可以用于血清检测，虽然肿瘤组织microRNA表达谱与肿瘤 发病及预后相关，但是检测技术复杂、创伤大，难以真正用于临床诊断，而外周血血清较易 获得和检测，临床应用便捷，利于推广，并且microRNA在血清中能够长期稳定存在，不易被 RNA酶降解，煮沸、反复冻融、酸碱环境、长期保存等极端条件均不会造成血清microRNA的 损失。
【附图说明】
[0048] 图1为NSCLC患者RNA质量检测电泳图。
[0049] 图2为microRNA芯片扫描图。
[0050] 图3为不同病理分期远端正常组织之间的差异表达microRNA。
[0051] A :1a期和IIa期的比较；B :IIa期和IIIa期的比较；C :1a期和IIIa期的比较。
[0052] 图4为不同病理分期癌旁组织之间的差异表达microRNA。
[0053] A :Ia期和IIa期的比较；B :IIa期和IIIa期的比较；C :Ia期和IIIa期的比较
[0054] 图5为不同病理分期癌组织之间的差异表达microRNA。
[0055] A :1a期和IIa期的比较；B :IIa期和IIIa期的比较；C :1a期和IIIa期的比较。
[0056] 图6为远端正常组织，癌旁组织和癌组织之间的差异表达microRNA。
[0057] A :远端正常组织和癌旁组织的比较；B :癌旁组织和癌组织的比较；C :远端正常组 织和癌组织的比较。
[0058] 图7为远端正常组织，癌旁组织和癌组织之间的差异表达microRNA的聚类分析。
[0059] 图8为淋巴结转移组和非淋巴结转移组之间的差异表达microRNA的聚类分析图。
[0060] 图9为hsa-miR-1280在肺癌组织和远端正常组织中的表达差异。
[0061] 图10为hsa-miR-1280在癌组织和远端正常组织敏感性和特异性方面进行比较。
【具体实施方式】 [0062] 实施例1 :
[0063] 完善NSCLC组织样本和血浆标本库，收集和整理病人病理资料和术后随访资料；
[0064] (1)建立了 120例NSCLC患者的临床病理资料和部分患者的术后随访资料数据 库；
[0065] (2)建立了 120例NSCLC患者的组织样本库；
[0066] (3)建立了 NSCLC患者及部分复发患者的外周血浆样本库30例。
[0067] 实施例2 :
[0068] NSCLC组织样本的microRNA芯片实验
[0069] (l)microRNA芯片实验用样本的筛选
[0070] 为保证芯片筛选用样本的组织病理资料的均一性，从已经建立的NSCLC组织样本 库中选择满足以下入选标准的病例9例：男性；50岁-70岁；腺癌；每例病例均包括远端正 常组织，癌旁组织和癌组织。其中临床分期分别为Ia期3例（样本编号分别是511587， 541056,492827)，IIa 期 3 例（样本编号分别是 435942,575901，473871)和 IIIa 期 3 例 (样本编号分别是399409, 399514, 509185)。每例病例分别取其远端正常组织，癌旁组织和 癌组织进行microRNA芯片检测，分别标记为N，P，C。同时，该9例病例包括4例非淋巴结 转移标本（样本编号435942,492827, 511587, 541056)和5例淋巴结转移标本（样本编号 399409,473871，509185, 399514, 575901)。
[0071] (2)样本 total RNA 抽提
[0072] 米用 mirVana? miRNA Isolation Kit (Cat#AM1560, Ambion，Austin, TX，US)，根据 生产厂商提供的标准操作流程进行样品的total RNA抽提，抽提所得total RNA经Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent technologies, Santa Clara，CA，US)电泳质检，其中 A260/ A280>1.8，RIN值>5. 0,28S/18S> = 0. 7的RNA样本方可进入下一轮实验。经检测，本研宄 所需的27例RNA样本均满足后续实验要求。
[0073] 结果如附图1所示。
[0074] 实施例3 :
[0075] 芯片实验
[0076] 项目所用芯片为 Agilent human miRNA(8*60K)V16.0 芯片（design ID :31181)， 共有27个标本，需要完成27张上述芯片，委托生物芯片上海国家工程研宄中心完成。具体 步骤包括：
[0077] 1)样品RNA的标记
[0078] 实验样品 RNA 采用 Agilent miRNA 芯片配套的试剂盒，miRNA Complete Labeling and Hyb Kit (Cat#519〇-〇456, Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)，按照标准操作 流程的标记部分对样品中的miRNA分子进行焚光标记。
[0079] 2)芯片杂交
[0080] 按照Agilent miRNA芯片配套提供的标准操作流程和配套试剂盒，miRNA Complete Labeling and Hyb Kit(Cat#5190-0456,Agilent technologies,Santa Clara, CA, US)的杂交部分，进行样品的杂交实验。在滚动杂交炉中，Hybridization Oven (Cat#G2545A, Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)，55°C，20rpm，滚动杂交 20 小时。杂交完成后在洗缸 staining dishes (Cat#121, Thermo Shandon, Waltham, MA, US) 中洗片，洗片所用的试剂为 Gene Expression Wash Buffer Kit (Cat#5188_5327, Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)〇
[0081] 3)结果扫描
[0082] 芯片结果米用 Agilent Microarray Scanner(Cat#G2565BA，Ag