ilent technologies, Santa Clara, CA, US)进 扫描，用 Feature Extraction software 10. 7 (Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)读取数据，软件设置 Scan resolution = 5μηι，ΡΜΤ 100 % ,5% 最后米用 Gene Spring Software 11.0 (Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)进行归一化处理，所用的算法为 Quantile。
[0083] 结果如附图2所示。
[0084] 实施例4 :
[0085] 芯片实验质控情况
[0086] 所有27张芯片的技术重复的变异系数（CV值）均〈10,说明该芯片检测体系稳定； 各芯片检出率范围为20%-40%，符合正常检出率要求；各芯片杂交数据的箱线图分析说 明分布和分散程度较好。以上各质控标准说明芯片结果稳定性好，灵敏度高，结果可靠。
[0087] 实施例5 :
[0088] 1)不同病理分期远端正常组织之间的差异表达microRNA
[0089] 比较IaN，IlaN，IIIaN 3组之间的差异表达microRNA，发现IaN和IIaN之间未 发现差异表达microRNA ;IaN+IIaN组和IIIaN组之间有11个差异表达的microRNA，包括 hsa-miR-205, hsa_miR-34b，hsa_miR-34b*，hsa-miR-34c_3p，hsa_miR-376a，hsa-miR-429， hsa_miR-449a，hsa_miR-449b，hsa-miR-495, hsa_miR-500a，hsa-miR-650。初步研宄说明 Ia和IIa期病人的远端正常组织未出现显著的microRNA变化，但是IIIa期病人的远端正 常组织已经开始出现microRNA表达量的改变。
[0090] 结果如附图3所示。
[0091] 2)不同病理分期癌旁组织之间的差异表达microRNA
[0092] 比较IaP，IlaP，IIIaP 3组之间的差异表达microRNA，发现IIaP和IIIaP之间有 3个microRNA差异表达；但是IaP和IIaP之间有9个microRNA差异表达，与IIIaP之间 有23个microRNA差异表达；初步研宄说明与Ia期病人相比，IIa期和IIIa病人的癌旁组 织已经开始出现microRNA表达量的改变。
[0093] 结果如附图4所示。
[0094] 3)不同病理分期癌组织之间的差异表达microRNA
[0095] IaC，IlaC，IIIaC 3组之间的差异表达microRNA并不比远端正常组织和癌旁组 织组间差异表达的microRNA多，其中IIaC和IIIaC之间仅hsv2-miR-H7-3p表达有差异； hsa_miR-23a*在IIaC和IIIaC中的表达量远高于IaC。
[0096] 结果如附图5所示。
[0097] 4)远端正常组织，癌旁组织和癌组织之间的差异表达microRNA
[0098] 远端正常组织和癌旁组织之间几乎没有出现microRNA表达量的改变，仅发现 hsa-miR-338-5p在癌旁组织的表达量显著低于远端正常组织；但是癌旁组织和癌组织之 间有36个microRNA的表达量发生了显著变化；远端正常组织和癌组织之间的差异表达的 microRNA有55个，说明癌组织与远端正常组织相比microRNA的表达量发生了广泛的变化。 以上述筛选出的55个microRNA为对象，对27个样本进行聚类分析，结果显示根据该差异 表达的microRNA表达谱可以将27个样本很好地分为癌组织和非癌组织两大类。
[0099] 结果如附图6，附图7所示。
[0100] 特别地，筛选到一种与非小细胞肺癌非常相关的hsa-miR-1280基因。
[0101] 所述hsa-miR-1280基因的序列为：5' -UCCCACCGCUGCCACCC-3'，其在癌组织和远 端正常组织有极为显著的表达量差别。
[0102] 5)淋巴结转移组和非淋巴结转移组之间的差异表达microRNA
[0103] 发现在淋巴结转移组中表达量发生显著变化的micr〇RNA3个，包括 hsa_miR-1260b，hsa-miR-423_3p，hsa-miR23a_5p，如附图 8 所不。
[0104] 以上述筛选出的3个microRNA为对象，对9个癌组织样本进行聚类分析，结果显 示根据该差异表达的microRNA表达谱可以将9个样本很好地分为淋巴结转移组和非淋巴 结转移组两大类。
[0105] 实施例6:
[0106] 扩大肿瘤样本验证microRNA芯片实验结果
[0107] (I)RNA抽提及质量控制
[0108] 选择 78 例 NSCLC 患者组织标本对 hsa-miR-145, hsa-miR-182 和 hsa-miR-213 进 行microRNA芯片的验证工作，RNA抽提及质量控制方法同上。
[0109] (2)反转录和 Real-PCR
[0110] 使用 ReverAid First cDNA strand kit (Fermentas)进行反转录。取 lug total RNA，加入Iul random hexamer primer，补水到12ul，在65°C水浴5min后，立即放于冰 上。加入 4ul 5*reaction buffer, RiboLock Rnase inhibitor Iul，IOmM dNTP Mix 2ul， ReverAid M-MuLV Reverse Transcriptase lul〇 25°C 5min 后，42°C 60min，7CTC 5min 后 结束反应，反转录反应在ABI 9700 PCR仪上进行。产物放于-20°C短期保存或_70°C长期 保存。使用时，将cDNA产物稀释20倍。microRNA引物由ABI公司合成。系统反应体系： 2ul cDNA，10ul SYBR ? Premix Ex TaqTM II(2X)，0.4ul IOuM 上下游引物，0.4ulR0X II，加水至20ul。在ABI 7900荧光定量PCR仪上进行扩增反应，95°C IOsec后40个循环 的 95°C 5s, 60°C 34sec〇
[0111] (3)实验结果
[0112] 分别定量分析3个microRNA在78例NSCLC患者的远端正常组织、癌旁组织和癌组 织中的表达量；研宄发现hsa-miR-21在66例远端正常组织和癌旁组织中的表达量显著低 于癌组织中的表达量，hsa-miR-145在75例远端正常组织和癌旁组织中的表达量显著高于 癌组织中的表达量，该研宄结果与芯片结果基本相符，因此我们计划选择这2个microRNA 进行后续研宄。
[0113] 实施例7:
[0114] hsa-miR-1280在肺癌组织和远端正常组织中的表达差异
[0115] 在72对非小细胞癌组织和其远端正常组织中进行q-PCR验证，结果显示miR-1280 在非小细胞肺癌组织中的表达量显著高于远端正常组织。这证明可通过检测组织中 hsa-miR-1280的表达量来检测非小细胞肺癌。
[0116] 结果如表1所示。
[0117] 表 1
[0118]
【主权项】
1. 一种与非小细胞肺癌相关的hsa-miR-1280基因，所述hsa-miR-1280基因的序列为： 5' -UCCCACCGCUGCCACCC-3'。
2. 权利要求1所述的hsa-miR-1280基因在制备非小细胞肺癌诊断试剂盒中的应用。
3. -种非小细胞肺癌诊断试剂盒，所述试剂盒中包含权利要求1所述的hsa-miR-1280 基因。
【专利摘要】本发明公开了一种hsa-miR-1280在非小细胞肺癌诊断中的作用及其应用。本发明旨在利用hsa-miR-1280在肺癌组织和远端正常组织中的显著性表达差异对非小细胞肺癌进行早期的诊断。对miRNA1280在癌组织和远端正常组织敏感性和特异性方面进行比较，AUC=0.772，最佳临界点时的敏感度为46.4%，特异性为95.7%，因此具有很强的可行性。
【IPC分类】C12N15-113, C12Q1-68
【公开号】CN104726454
【申请号】CN201510055487
【发明人】戴利成, 许丽敏, 李丽琴
【申请人】湖州市中心医院
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年2月3日