4M~5X1(T4M，优选地，4X1(T4M;所述维生素C磷酸酯的浓度为40yg/ ml~60yg/ml，优选地，50yg/ml;所述谷氨酰胺的浓度为ImM~3mM，优选地，2mM。
[0050] 根据本发明的一些具体实施例，所述第四培养基为添加了 1-硫代甘油、维生素C 磷酸酯、谷氨酰胺、ActivinA、BMP4、bFGF和CHIR990213yM的AdvancedRPMI1640 培养 基。根据本发明的具体实施例，其中，所述1-硫代甘油的浓度为3X1(T4M~5X1(T4M，优选 地，4X1(T4M;所述维生素C磷酸醋的浓度为40yg/ml~60yg/ml，优选地，50yg/ml;所述 谷氨酰胺的浓度为ImM~3mM，优选地，2mM;所述ActivinA的浓度为15ng/ml~35ng/ml， 优选地，25ng/ml;所述BMP4的浓度为10ng/ml~30ng/ml，优选地，25ng/ml;所述bFGF的 浓度为l〇ng/ml~30ng/ml，优选地，25ng/ml;以及所述CHIR99021的浓度为2yM-4yM，优 选地，3yM。由此，培养基无需牛血清等异源组分，并且胚胎干细胞向造血干/祖细胞分化 的诱导效率显著提高，诱导效果稳定性好。
[0051] 下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明 性的，而不能理解为对本发明的限制。
[0052] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的 实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条 件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪 器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Gibco公司。
[0053] 实施例1
[0054] -、细胞的诱导分化培养
[0055] 1.人胚胎干细胞的培养
[0056] 发明人对MA01和MA09系人胚胎干细胞（来自美国Wicell研宄中心）进行培养。 具体地，将MA01和MA09系人胚胎干细胞分别培养在含mTeSR培养基（2. 5ml/孔）并包被基 质胶的六孔板中，每天更换新鲜的培养基。待克隆生长至70-80%汇合度后，用分散酶处理 细胞，待克隆边缘卷起后，吸弃消化酶，并用培养基润洗细胞以充分终止消化酶的作用。将 克隆吹成小细胞团块，按1:4的传代比例将其接种到新的培养孔中继续培养，传代周期为 4-6天，获得大量扩增后的人胚胎干细胞，利用显微镜（OLYMPUS，CKX31)观察细胞的形态， 如图1A所示，细胞呈克隆状生长，细胞排列紧密，细胞内核质比高，该胚胎干细胞可冻存于 液氮中保存备用。
[0057] 2.人胚胎干细胞向造血干/祖细胞诱导分化
[0058] 将步骤1获得的扩增后的人胚胎干细胞进行诱导分化，主要包括以下4个诱导分 化阶段：
[0059] 第一阶段：吸弃人胚胎干细胞的培养基，以便促进人胚胎干细胞向造血干/祖细 胞分化，24小时后，用DF12培养基（购自Thermo公司，HyCloneSH30023.01B)润洗细胞， 然后，加入培养基1，处理细胞24小时，使胚胎干细胞失去部分全能性。
[0060] 其中，培养基1组分为：
[0061] Advanced RPMI1640 培养基
[0062] 1-硫代甘油 4X1(T4M
[0063] 维生素C磷酸酯50 y g/ml
[0064] 谷氨酰胺2mM
[0065] 第二阶段：吸弃第一阶段处理后的细胞的培养基，更换培养基2诱导培养48小时， 利用显微镜（OLYMPUS，CKX31)观察诱导培养后细胞的形态，如图1B所示，细胞排列逐渐 疏松，克隆中央出现半凸起细胞团，克隆边缘细胞向克隆外伸展，细胞由上皮状向间质样转 变，细胞核质比降低。其中，培养基2组分为：
[0066] Advanced RPMI1640 培养基
[0067] 1-硫代甘油 4X10_4M
[0068] 维生素C磷酸酯50μg/ml
[0069] 谷氨酰胺2mM
[0070] Activin A 25ng/ml
[0071] BMP4 25ng/ml
[0072] bFGF25ng/ml
[0073]CHIR99021 3yM
[0074] 第三阶段：吸弃第二阶段处理后的细胞的培养基，并用培养基1润洗1-2次。然 后，更换培养基3进行诱导培养96小时，期间换液一次，利用显微镜（OLYMPUS，CKX31)观察 诱导培养后细胞的形态，如图1C所示，间质样细胞进一步增多，细胞排列疏松，出现一部分 铺路石样形态的内皮细胞。
[0075] 其中培养基3组分为：
[0076]Advanced RPMI1640 培养基
[0077] 1-硫代甘油 4X10_4M
[0078] 维生素C磷酸酯50μg/ml
[0079] 谷氨酰胺2mM
[0080]BMP4 20ng/ml
[0081]bFGF20ng/ml
[0082] VEGF50ng/ml
[0083]LeptinlOOng/ml
[0084] 第四阶段：吸弃第三阶段处理后的细胞的培养基，将细胞用培养基1润洗1-2 次后，换入培养基4 (培养基4组分：Stempro34培养基+1-硫代甘油4X1(T4M+维 生素C磷酸酯 50yg/ml+ 谷氨酰胺 2mM+SCF50ng/ml+IL-3 50ng/ml+FLT-3L50ng/ml+CHIR990213yM+L印tinlOOng/ml)进行诱导培养，诱导96小时，获得造血干/祖细胞， 设置该细胞为实验组，利用显微镜（OLYMPUS，CKX31)观察诱导培养获得的造血干/祖细胞 的形态，如图1D所示，在贴壁细胞中出现大量悬浮细胞。
[0085] 设置不含瘦素的培养基3和4,获得的造血干/祖细胞为对照组。
[0086] 二、细胞的鉴定和检测
[0087] 1、细胞RNA提取、反转录及实时定量PCR检测目的基因的表达
[0088] 利用实时定量PCR检测实验组的人胚胎干细胞向造血干/祖细胞诱导分化过程 中，胚胎干细胞各个诱导分化阶段的目的基因的表达情况，具体如下：
[0089] 1. 1实验方法
[0090] 1. 1. 1收集细胞
[0091] (1)用不含Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲液（PBS)润洗细胞后，用Accutase消化酶将 诱导细胞消化成单细胞。
[0092] (2)将细胞离心后吸弃上清。
[0093] 1. 1. 2 提取RNA
[0094](1)向上述收集的细胞中加入裂解液（RLT，QIAGEN，74104)，高速震荡充分裂解细 胞。
[0095] (2)用试剂盒（RNeasyMiniKit，QIAGEN，74104)，按说明书的步骤对裂解后的细 胞进行分离纯化，提取细胞中总RNA。
[0096] 1. 1. 3检测RNA溶液浓度和纯度
[0097] RNA浓度及纯度数据通过紫外分光光度计（eppendorf，biophotometer plus)260nm/280nm吸光值（A260/280)检测获得，纯度要求A260/280比值介于1.8-2. 0之 间。
[0098] LL4反转录
[0099]精确吸取含1yg总RNA的溶液，用反转录试剂盒（T0Y0B0,FSQ-201)，按说明书的 步骤将RNA反转录为cDNA，由此，获得样品的cDNA，并于-20°C下保存，备用。
[0100] 1. 1.5 实时定量PCR
[0101] 实时定量反应体系如下表所示。将试剂混匀后加至PCR管中，并用实时定量PCR 仪（BIO-RAD，iQ5)检测目的基因的表达情况。
【主权项】
1. 瘦素在诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞中的用途。
2. -种用于诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞的试剂盒，其特征在于，包括： 第一培养基，所述第一培养基为添加了瘦素的AdvancedRPMI 1640培养基；以及 第二培养基，所述第二培养基为添加了瘦素的Stempro 34培养基。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，在所述第一培养基和所述第二培养基 中，所述瘦素的浓度为10-300ng/ml，优选地，50-150ng/ml。
4. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述第一培养基进一步添加了 1-硫代 甘油、维生素C磷酸酯、谷氨酰胺、重组人骨形成蛋白4、重组人碱性成纤维生长因子和重组 人血管内皮生长因子， 任选地，在所述第一培养基中： 所述1-硫代甘油的浓度为3 X KT4M~5 X KT4M,优选地，4 X KT4M ; 所述维生素C磷酸醋的浓度为40 y g/ml~60 y g/ml，优选地，50 y g/ml ; 所述谷氨酰胺的浓度为ImM~3mM，优选地，2mM ; 所述重组人骨形成蛋白4的浓度为10ng