/ml~30ng/ml，优选地，20ng/ml ; 所述重组人碱性成纤维生长因子的浓度为l〇ng/ml~30ng/ml，优选地，20ng/ml ;以及 所述重组人血管内皮生长因子的浓度为40ng/ml~60ng/ml，优选地，50ng/ml， 任选地，所述第二培养基进一步添加了 1-硫代甘油、维生素C磷酸酯、谷氨酰胺、重组 人干细胞因子、重组人白介素3、人FMS样酪氨酸激酶3配体和CHIR99021， 任选地，，在所述第二培养基中： 所述1-硫代甘油的浓度为3 X KT4M~5 X KT4M,优选地，4 X KT4M ; 所述维生素C磷酸醋的浓度为40 y g/ml~60 y g/ml，优选地，50 y g/ml ; 所述谷氨酰胺的浓度为ImM~3mM，优选地，2mM ; 所述重组人干细胞因子的浓度为40ng/ml~60ng/ml，优选地，50ng/ml ; 所述重组人白介素3的浓度为40ng/ml~60ng/ml，优选地，50ng/ml ; 所述人FMS样酪氨酸激酶3配体的浓度为40ng/ml~60ng/ml，优选地，50ng/ml ;以及 所述CHIR99021的浓度为2 y M~4 y M，优选地，3 y M。
5. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括：第三培养基和第四培养 基， 其中， 所述第三培养基为添加了 1-硫代甘油、维生素C磷酸酯、谷氨酰胺的Advanced RPMI1640培养基， 所述第四培养基为添加了 1-硫代甘油、维生素C磷酸酯、谷氨酰胺、重组激活素A、重组 人骨形成蛋白4、重组人碱性成纤维生长因子和CHIR990213 yM的Advanced RPMI 1640培 养基， 任选地，在所述第三培养基中： 所述1-硫代甘油的浓度为3 X KT4M~5 X KT4M,优选地，4 X KT4M ; 所述维生素C磷酸醋的浓度为40 y g/ml~60 y g/ml，优选地，50 y g/ml ; 所述谷氨酰胺的浓度为ImM~3mM，优选地，2mM ; 任选地，在所述第四培养基中： 所述1-硫代甘油的浓度为3 X KT4M~5 X KT4M,优选地，4 X KT4M ; 所述维生素C磷酸醋的浓度为40 y g/ml~60 y g/ml，优选地，50 y g/ml ; 所述谷氨酰胺的浓度为ImM~3mM，优选地，2mM ; 所述重组激活素A的浓度为15ng/ml~35ng/ml，优选地，25ng/ml ; 所述重组人骨形成蛋白4的浓度为10ng/ml~30ng/ml，优选地，25ng/ml ; 所述重组人碱性成纤维生长因子的浓度为l〇ng/ml~30ng/ml，优选地，25ng/ml ;以及 所述CHIR99021的浓度为2 y M~4 y M，优选地，3 y M。
6. -种利用权利要求2-5所述的试剂盒制备造血干/祖细胞的方法，其特征在于，包 括： 利用所述第一培养基对预处理的胚胎干细胞进行培养，以便得到生血内皮细胞；和 利用所述第二培养基对所述生血内皮细胞进行培养，以便获得造血干/祖细胞。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述预处理包括： 利用所述第三培养基对胚胎干细胞进行培养，以便得到失去部分全能性的胚胎干细 胞；和 利用所述第四培养基对所述失去部分全能性的胚胎干细胞进行培养，以便得到中胚层 祖细胞， 任选地，利用所述第一培养基对所述预处理的胚胎干细胞培养84~108小时， 利用所述第二培养基对所述生血内皮细胞培养84~108小时， 利用所述第三培养基对胚胎干细胞培养12~26小时， 利用所述第四培养基对所述失去部分全能性的胚胎干细胞培养36~60小时。
8. -种制备造血干/祖细胞的系统，其特征在于，包括： 第一培养装置，所述第一培养装置利用第一培养基对预处理的胚胎干细胞进行培养， 以便得到生血内皮细胞；和 第二培养装置，所述第二培养装置与第一培养装置相连，所述第二培养装置利用第二 培养基对所述生血内皮细胞进行培养，以便获得造血干/祖细胞。
9. 根据权利要求8所述的系统，其特征在于，进一步包括： 预处理装置，所述预处理装置与所述第一培养装置相连，用于对所述胚胎干细胞进行 预处理，所述预处理装置包括： 第三培养单元，所述第三培养单元利用第三培养基对胚胎干细胞进行培养，以便得到 失去部分全能性的胚胎干细胞；和 第四培养单元，所述第四培养单元利用第四培养基对所述失去部分全能性的胚胎干细 胞进行培养，以便得到中胚层祖细胞， 任选地，利用所述第一培养基对所述胚胎干细胞培养84~108小时， 利用所述第二培养基对所述生血内皮细胞培养84~108小时， 利用所述第三培养基对所述胚胎干细胞培养12~26小时， 利用所述第四培养基对所述失去部分全能性的胚胎干细胞培养36~60小时。
10. 根据权利要求8所述的系统，其特征在于，所述第一培养基为添加了瘦素的 AdvancedRPMI 1640培养基，所述第二培养基为添加了瘦素的Stempro 34培养基， 任选地，所述瘦素的浓度为l〇ng/ml~300ng/ml，优选地，50ng/ml~150ng/ml， 任选地，所述第一培养基进一步添加了 1-硫代甘油、维生素C磷酸酯、谷氨酰胺、重组 人骨形成蛋白4、重组人碱性成纤维生长因子和重组人血管内皮生长因子， 任选地，在所述第一培养基中： 所述1-硫代甘油的浓度为3 X KT4M~5 X KT4M,优选地，4 X KT4M ; 所述维生素C磷酸醋的浓度为40 y g/ml~60 y g/ml，优选地，50 y g/ml ; 所述谷氨酰胺的浓度为ImM~3mM，优选地，2mM ; 所述重组人骨形成蛋白4的浓度为10ng/ml~30ng/ml，优选地，20ng/ml ; 所述重组人碱性成纤维生长因子的浓度为l〇ng/ml~30ng/ml，优选地，20ng/ml;以及 所述重组人血管内皮生长因子的浓度为40ng/ml~60ng/ml，优选地，50ng/ml， 任选地，所述第二培养基进一步添加了 1-硫代甘油、维生素C磷酸酯、谷氨酰胺、重组 人干细胞因子、重组人白介素3、人FMS样酪氨酸激酶3配体和CHIR99021， 任选地，在所述第二培养基中： 所述1-硫代甘油的浓度为3 X KT4M~5 X KT4M,优选地，4 X KT4M ; 所述维生素C磷酸醋的浓度为40 y g/ml~60 y g/ml，优选地，50 y g/ml ; 所述谷氨酰胺的浓度为ImM~3mM，优选地，2mM ; 所述重组人干细胞因子的浓度为40ng/ml~60ng/ml，优选地，50ng/ml ; 所述重组人白介素3的浓度为40ng/ml~60ng/ml，优选地，50ng/ml ; 所述人FMS样酪氨酸激酶3配体的浓度为40ng/ml~60ng/ml，优选地，50ng/ml ;以及 所述CHIR99021的浓度为2 y M~4 y M，优选地，3 y M， 任选地，所述第三培养基为添加了1-硫代甘油、维生素C磷酸酯、谷氨酰胺的AdvancedRPMI 1640培养基， 任选地，所述第四培养基为添加了 1-硫代甘油、维生素C磷酸酯、谷氨酰胺、重组激活 素A、重组人骨形成蛋白4、重组人碱性成纤维生长因子和CHIR990213 yM的Advanced RPMI 1640培养基， 任选地，在所述第三培养基中： 所述1-硫代甘油的浓度为3 X KT4M~5 X KT4M,优选地，4 X KT4M ; 所述维生素C磷酸醋的浓度为40 y g/ml~60 y g/ml，优选地，50 y g/ml ; 所述谷氨酰胺的浓度为ImM~3mM，优选地，2mM ; 任选地，在所述第四培养基中： 所述1-硫代甘油的浓度为3 X KT4M~5 X KT4M,优选地，4 X KT4M ; 所述维生素C磷酸醋的浓度为40 y g/ml~60 y g/ml，优选地，50 y g/ml ; 所述谷氨酰胺的浓度为ImM~3mM，优选地，2mM ; 所述重组激活素A的浓度为15ng/ml~35ng/ml，优选地，25ng/ml ; 所述重组人骨形成蛋白4的浓度为10ng/ml~30ng/ml，优选地，25ng/ml ; 所述重组人碱性成纤维生长因子的浓度为l〇ng/ml~30ng/ml，优选地，25ng/ml;以及 所述CHIR99021的浓度为2 y M~4 y M，优选地，3 y M。
【专利摘要】本发明公开了瘦素在诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞中的用途及其应用，包括：用于诱导胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞的试剂盒、利用前述的试剂盒制备造血干/祖细胞的方法和制备造血干/祖细胞的系统。实验发现，瘦素可以显著提高胚胎干细胞向造血干/祖细胞分化的效率，提高分化细胞的造血集落形成能力，诱导效果好且稳定。
【IPC分类】C12M3-00, C12N5-0789
【公开号】CN104745529
【申请号】CN201510112487
【发明人】裴雪涛, 李艳华, 张博文, 何丽娟, 张亚, 岳 文
【申请人】军事医学科学院华南干细胞与再生医学研究中心
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年3月13日