高效分泌抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞a135株的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高效分泌抗犬细小病毒(CPV)单克隆抗体杂交瘤细胞，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]犬细小病毒病(Canineparvovirus disease，CPVD)是一种由犬细小病毒(Canineparvovirus, CPV)引起的以出血性肠炎或非化脓性心肌炎为主要特征的犬病毒性传染病，该病传染性强，死亡率高，各种年龄犬均可感染，幼犬的死亡率高达70%，由该病导致的经济损失巨大。尽管对易感犬广泛采取了 CPVD疫苗接种，但由于CPV对外界的抵抗力强、易变异，目前仍是危害我国养犬业最为严重的传染病之一。
[0003]CPV (又称CPV-2)是1977年由美国学者从患出血性肠炎的犬腹泻粪便中分离得到的一种新型细小病毒，为了与1967年Binn从健康犬分离的非致病性犬极小病毒(minutevirus of canine, MVC，又称CPV-1)相区别而被命名为CPV-2。CPV-2与MCV在致病性上显著不同，抗原性上也有明显差异。目前公认CPV只有I个抗原型，即CPV-2，但CPV-2在其出现后的几年时间内已发生了抗原漂移，在抗原性、宿主范围和血凝性上都发生了变化，其变异速度之快，在DNA病毒中是很少见的。现在CPV已出现了多个亚型，即CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c (a)和CPV-2c (b)，对动物的感染宿主谱(如:狐、貉等)也在扩大，严重威胁着家养和野生犬科及猫科动物的生存。
[0004]由于CPV的变异速度快，现有CPV疫苗的免疫效果有所下降。对临床发病犬追溯调查发现，免疫犬感染不同抗原型病毒的病例屡见不鲜，CPV-2免疫犬对同型病毒(CPV-2)中和抗体(SNAb)水平明显高于异型，较多研宄者认为低水平的SNAb可能无法提供免疫犬对异型病毒的完全保护。此外，免疫犬感染发病的其他原因也不容忽视:①疫苗首次接种时幼犬体内残余的母源抗体限制了疫苗弱毒在其体内的复制。②疫苗接种后犬在“感染窗口期”内(约1-2周免疫产生期)遭受强毒的侵袭而感染。③某些品种、日龄的犬对强毒易感程度更高。
[0005]犬细小病毒病(CPVD)是一种由犬细小病毒(CPV)引起的以出血性肠炎或非化脓性心肌炎为主要特征的犬病毒性传染病，由该病导致的经济损失巨大。用抗CPV免疫血清或抗CPV单克隆抗体对患病犬进行治疗，可降低死亡率，减少经济损失。预防CPVD的主要手段是接种疫苗，对患病犬的治疗方法为给发病早期犬注射抗CPV血清或抗CPV单克隆抗体，同时辅助输液、输血、静脉注射犬免疫球蛋白或血白蛋白等，可以有效降低病死率。目前，市场上用本动物或异源动物制备的抗CPV免疫血清，质量不稳定、质控难、生产成本高，而且存在着外源病毒传入、感染患病犬的巨大风险，产生严重的生物安全问题；应用单克隆抗体治疗，可以降低上述风险，提高疗效，但现有的抗CPV单克隆抗体不仅中和效价(抗病毒活性)低，且对不同CPV亚型毒株的中和能力差异很大，对某些CPV亚型毒株没有中和活性。因此，在CPVD临床治疗上，亟需研制具有中和活性高、并且对不同的CPV亚型毒株都具有高中和能力的单克隆抗体。
【发明内容】
[0006]技术问题
本发明的目的是提供一种高效分泌抗CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其分泌的单克隆抗体不仅中和活性高，而且对不同的CPV亚型病毒株都具有高中和能力。
[0007]技术方案
一种高效分泌抗CPV单克隆抗体杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞A135株于2015年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C201556，分类命名:杂交瘤细胞。
[0008]所述一种高效分泌抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞A135株可以在制备犬细小病毒单克隆抗体治疗剂中得到应用
用所述杂交瘤细胞A135株制备的犬细小病毒单克隆抗体，再用所述的单克隆抗体制备犬细小病毒单克隆抗体治疗剂。
[0009]有益效果
本发明的特点和优点如下:
1.本发明使用的BALB/C小鼠免疫原是用CPVD免疫发病犬体内分离的CPV当前流行强毒株(CPV-JS12株)制备。
[0010]2.本发明从建立的178株分泌抗CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞库中筛选出一株杂交瘤细胞A135株，用其诱生的BALB/c小鼠腹水单克隆抗体对犬细小病毒的中和效价高达101(1，抗CPV的生物学活性十分优良。
[0011]3.本发明的杂交瘤细胞A135株分泌的单克隆抗体对CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c(a)、CPV-2c (b)等多个CPV亚型病毒株以及狐、貉源CPV毒株均表现高中和活性，抗CPV毒株范围广。
[0012]4.本发明的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体治疗剂，用于CPV感染发病犬的临床治疗，治愈率达100%，安全无不良副反应。
【具体实施方式】
[0013](一)单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
1.CPV抗原的制备将从CPVD免疫发病犬体内分离的犬细小病毒强毒株CPV-JS12毒株(李月华，等.犬细小病毒JS12株VP2基因的分子特征及其在大肠杆菌中的表达.中国兽医科学，2013，43(10): 991-998)接种于FK81细胞(购自南京天邦生物科技有限公司)，将病变的细胞培养物冻融3次，离心去除细胞碎片，取上清液，采用PEG沉淀和不连续蔗糖密度梯度方法进行纯化，紫外分光光度计测定病毒浓度，制成CPV免疫抗原，-20°C保存备用。
[0014]动物免疫用纯化的CPV免疫抗原经腹腔注射免疫6?8周龄雌性BALB/c小鼠(购自扬州大学比较医学实验中心)，50 μ g/只。首免用等体积弗氏完全佐剂(Sigma公司产品)乳化抗原，以后每隔14d用弗氏不完全佐剂(Sigma公司广品)乳化抗原，再免疫2次。3免后第7d断尾采血，用间接ELISA方法测定血清抗体效价，选取血清抗体ELISA效价> 16的小鼠，在融合前3d用不加佐剂的CPV抗原经腹腔注射加强免疫。
[0015]细胞融合采用PEG细胞融合方法。取SP2/0骨髓瘤细胞与免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1:5?1:10的比例，充分混匀，100rpm离心lOmin，弃上清，用手掌轻击管底，使细胞松散均匀，置40°C水浴预热，用ImL吸管在45s内加完预热至40°C的50% PEG4000(Sigma公司产品)lmL，边加边轻轻振荡，然后在90s内加入15mL预热至37°C的无胎牛血清的RPM1-1640培养基，室温静置lOmin，100rpm离心lOmin，弃上清，加入含15%胎牛血清(FCS)(兰州民海公司产品)和HAT (Sigma公司产品)的RPM1-1640培养基重悬，分装到已有饲养细胞的96孔板上，于5% CO2培养箱培养。3d后补加含HAT (Sigma公司产品)和15% FCS (兰州民海公司产品)的RPM1-1640培养基，5d后改用含HT (Sigma公司产品)和15% FCS (兰州民海公司产品)的RPM1-1640培养基，1d后换成含15% FCS (兰州民海公司产品)的RPM1-1640培养基培养，当融合的细胞生长至96孔板孔底面积的1/5时，取上清进行抗体检测。
[0016]杂交瘤细胞的筛选按方阵法确定纯化CPV抗原的包被浓度，用包被液为0.05mo I/L pH 9.6碳酸盐缓冲液对纯化的CPV抗原进行倍比稀释，用稀释至400倍的CPV抗原量包被ELISA板，100 μ L/孔，置4°C包被过夜，PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；以含10%小牛血清的PBST封闭每孔，200 μ L/孔，37°C放置2h，PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；将融合后12d的细胞上清、1:1600稀释的免疫小鼠阳性血清和1:1600稀释的小鼠阴性血清，加入相应孔内，100 μ L/孔，37°C作用lh，PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入1:2000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG，100 μ L/孔，37°C放置lh，PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入TMB底物，100 μ L/孔，室温避光显色5?1min ;每孔加入50 μ L 2mol/L硫酸终止反应。经酶标仪测定OD45tol值，以空白对照调零，P为各检测孔的值，N为阴性参考血清的OD45tol值，当阴性参考血清的OD 45_值5 0.1，阳性参考血清的OD45tlnm值与阴性参考血清的OD45tol值的比值会2.1，即阴、阳性对照成立的前提下，P/N ^ 2.1的检测孔判为阳性，隔2?3d后再检测一次，对两次检测结果均为阳性的杂交瘤细胞进行克隆化。
[0017]杂交瘤细胞的克隆化首先将阳性孔活细胞用台盼兰进行染色和计数，用含15%FCS (兰州民海公司产品)的RPM1-1640培养