一种纯化蛋白质的方法
【技术领域】
[0001]本发明一般涉及一种纯化蛋白质的方法。更特别地，本发明涉及一种从同一起始原料纯化触珠蛋白和血红素结合蛋白的方法，及其用途。
【背景技术】
[0002]溶血的特征在于红细胞破坏，并且是与红细胞异常相关的贫血病症的性质标志(hall-mark)，比如酶缺陷、血红蛋白病、遗传性球形红细胞增多症、阵发性夜间血红蛋白尿症和棘突红细胞(spur cell)贫血，以及外源因素比如脾肿大、自身免疫性病症(例如，新生儿溶血病)、遗传性疾病(例如，镰状细胞病或G6H)缺失症)、微血管病性溶血、革兰氏阳性细菌感染(例如，链球菌、肠道球菌和葡萄球菌)、寄生虫感染(例如，疟原虫)、毒素和创伤(例如烧伤)。溶血也是一种常见的输血病症，特别是大量输血和在使用体外心肺维持的患者中。
[0003]患有与溶血相关病症的患者中可见的副作用主要归因于从红细胞释放铁和含铁化合物，比如血红蛋白(Hb)和血红素。在生理条件下，释放的血红蛋白被可溶性蛋白质比如触珠蛋白结合，并转运到巨噬细胞和肝细胞。然而，当溶血发生率加快且事实上变成病理性时，触珠蛋白的缓冲能力被压倒。因此，血红蛋白被快速氧化成铁血红蛋白，其依次释放游离血红素(包含原卟啉IX和铁)。虽然血红素在一些生物进程中起决定作用(例如，作为必需蛋白质比如血红蛋白和肌红蛋白的一部分)，但是游离血红素是高毒性的。游离血红素是氧化还原活性铁的来源，其产生损害类脂膜、蛋白质和核苷酸的高毒性活性氧种类(ROS)。血红素的毒性由于其插入类脂膜的能力而进一步加剧，在类脂膜中血红素引起膜组分氧化且促进细胞溶解和死亡。
[0004]在生理学稳态条件下和在轻度溶血期间，连续低水平细胞外Hb/血红素暴露的进化压力导致控制游离Hb/血红素副作用的补偿机制。这些系统包括释放一组结合Hb或血红素的血浆蛋白，包括Hb清除剂触珠蛋白(Hp)和血红素清除剂蛋白质血红素结合蛋白(Hx)和α -1微小球蛋白。然而，虽然在生理学稳态条件下，内源性Hp和Hx控制游离Hb/血红素的副作用，但是它们在病理生理学条件(比如与溶血相关的那些条件)下保持稳态Hb/血红素水平的功效很小。
[0005]本发明提供一种从同一起始原料纯化Hp和Hx的方法。所述纯化的蛋白质可用于治疗与溶血和Hb/血红素水平异常相关的病症的组合物中。
[0006]发明简述
[0007]在本发明的一个方面，提供一种从含有触珠蛋白和血红素结合蛋白两种蛋白质的溶液中纯化这两种蛋白质的方法，所述方法包括:
[0008](i)提供含有触珠蛋白和血红素结合蛋白两者的溶液；
[0009](ii)通过向溶液中加入硫酸铵从所述溶液中沉淀触珠蛋白；
[0010](iii)从含有血红素结合蛋白的溶液中分离沉淀的触珠蛋白；和
[0011](iv)以一个或多个步骤分别纯化触珠蛋白和/或血红素结合蛋白。
[0012]在本发明的另一个方面，提供一种包含通过本文公开的方法回收的触珠蛋白的组合物。
[0013]在本发明的另一个方面，提供一种包含通过本文公开的方法回收的血红素结合蛋白的组合物。
[0014]在本发明的另一个方面，提供一种包含通过本文公开的方法回收的转铁蛋白的组合物。
[0015]在本发明的另一个方面，提供一种包含通过本文公开的方法回收的触珠蛋白和通过本文公开的方法回收的血红素结合蛋白的组合物。
[0016]在本发明的另一个方面，提供一种包含含量为总蛋白的至少95%的触珠蛋白的组合物。在本发明的另一个方面，提供一种包含含量为总蛋白的至少80%的血红素结合蛋白的组合物。在本发明的另一个方面，提供一种包含含量为总蛋白的至少80%的组合的血红素结合蛋白和触珠蛋白的组合物。
[0017]在本发明的另一个方面，提供一种包含如本文公开的本发明的组合物和可药用载体的制剂。
[0018]在本发明的另一个方面，提供一种治疗与溶血相关的病症的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用如本文公开的本发明的组合物或制剂。
[0019]在本发明的另一个方面，提供如本文公开的本发明的组合物或制剂在制备用于治疗与溶血相关的病症的药物中的用途。
[0020]附图简述
[0021]图1为Cohn分级过程的流程图。本领域技术人员应当认识到改变图1中描述的过程参数(例如，pH、乙醇浓度、温度等)也可以应用于产生Cohn级分。
[0022]图2显示在2.0M,2.5M、3.0M,3.5M和4.0M硫酸铵的存在下沉淀之后，剩余滤液中转铁蛋白(TRF)、白蛋白(Alb)、血红素结合蛋白(HPX)和触珠蛋白(HAP)的回收。
[0023]图3显示实验设计(DOE)的需要性图，显示从血浆级分中沉淀触珠蛋白而使血红素结合蛋白保留在溶液中所期望的条件。DOE是一组用于评价pH和硫酸铵浓度对从触珠蛋白分离血红素结合蛋白的能力的影响的控制实验。使用因子数学设计来设计和分析数据。图3中描绘的需要性图使用该数学设计来决定应当产生血红素结合蛋白和触珠蛋白两者的最佳分离和回收的最期望条件。
[0024]图4显示在本文公开的纯化方法的各种步骤之后回收的血红素结合蛋白的SDS-PAGE电泳。使用预制的10% Tris-甘氨酸凝胶(Novex, EC6075)进行SDS-PAGE分析。将所有样品都在Tri S-甘氨酸SDS样品缓冲液(LC2676)中稀释成0.lmg/mL的浓度，并且将20 μ L的每种样品装入凝胶的样品孔中。运行时间和电压设置为凝胶制造商的建议值(恒定125V)。用易于使用类型的考马斯亮蓝染色溶液(Novex，Simply BlueSafestain, LC6065)对每个凝胶染色。泳道I (LMWS)含有Novex灵敏未染色标准品(NovexSharp Unstained Protein Standards)，LC580I。
[0025]图5显示在本文公开的纯化方法的各种步骤之后回收的触珠蛋白中间体的SDS-PAGE电泳(使用图4中上述的方法)。泳道2中的触珠蛋白标准品来自Benesis(T043HPX)。
[0026]图6显示Capto Q洗脱液在10 % Tris-甘氨酸未还原SDS-PAGE电泳凝胶(使用图4中描述的方法)上的蛋白质印迹。然后，将单独的蛋白质转移到硝基纤维素膜，并阻断该膜防止任何非特异性抗体结合。然后，用含有人触珠蛋白抗体(兔子抗-人触珠蛋白Sigma H8636)的溶液培养硝基纤维素膜。然后，用硝基纤维素膜(山羊抗-兔子HRP，SigmaA6154)培养与辣根过氧化酶(HRP)连接的二级抗体。接着，用含有过氧化物的溶液展开硝基纤维素，由此仅显影特别地含有人触珠蛋白的蛋白质带。泳道含有不同浓度的CaptoQ ImpRes Eluate (T0209001)(泳道 2-1:10 稀释，0.lmg/mL，20 μ L 负载；泳道 3-1:20 ;泳道4-1:40 ;泳道 5-1:80 ;泳道 6-1:160 ;泳道 7-1:320 ;泳道 8-1:640 ;泳道 9-1:1280 ;和泳道10-1:2560)。蛋白质印迹表明Capto Q Eluate中存在大部分条带是触珠蛋白。
[0027]图7显示在本文公开的纯化方法的各种步骤之后从离子交换层析(Capto DEAE)回收的转铁蛋白的SDS-PAGE电泳(使用图4中描述的方法)。峰I (泳道4)载荷重，但是似乎是纯转铁蛋白(与泳道2，人转铁蛋白，Sigma Τ8158比较)。这表明从辛基琼脂糖冲洗物(Octyl Sepharose Wash)级分纯化转铁蛋白是可能的，其也意味着从同一起始原料纯化血红素结合蛋白、触珠蛋白和转铁蛋白是可能的。
[0028]图8显示在本文公开的纯化方法期间来自离子交换色谱柱的转铁蛋白线性梯度的色谱图。在图7中，通过SDS-PAGE分析标记I至4的峰。
[0029]图9为根据本文公开的一个实施方案的血红素结合蛋白纯化方法的流程图。
[0030]图10为根据本文公开的一个实施方案的触珠蛋白纯化方法的流程图。
[0031]图11为根据本文公开的一个实施方案的组合触珠蛋白/血红素结合蛋白/转铁蛋白纯化方法的流程图。
[0032]详细说明
[0033]在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则措辞〃包括〃或其变化比如〃包括〃或"包含"应当理解为意味着包含所述要素或整数或要素组或整数组，但不排除任何其它要素或整数或要素组或整数组。
[0034]在本说明书中参考的任何现有出版物(或来源于其的信息)或其中任何物质都是已知的，不会且不应当被视为承认或认可或以任何形式暗示该现有出版物(或来源于其的信息)或已知物质构成本说明书相关的努力领域的普通常识部分。
[0035]必须指出，除非上下文另有清楚的规定，否则如本说明书中使用的单数形式“一个”、“一种”或“所述”包括复数方面。因此，例如提及“一种树脂”包括单个树脂，以及两种或多种树脂；提及“组合物”包括单一组合物，以及两种或多种组合物；诸如此类。
[0036]在不存在任何相反指示下，在整个说明书中提及“ ％ ”含量应当视为平均％ w/w (重量/重量)。例如，包含含量为总蛋白的至少95%的触珠蛋白的溶液意味着指包含含量为总蛋白的至少95% w/w的触珠蛋白的组合物。
[0037]本发明至少部分地基于发现了可以从同一起始原料纯化触珠蛋白和血红素结合蛋白。因此，在本发明的一个方面，提供一种从含有触珠蛋白和血红素结合蛋白两种蛋白质的溶液中纯化这两种蛋白质的方法，所述方法包括:
[0038](i)提供含有触珠蛋白和血红素结合蛋白两者的溶液；
[0039](ii)通过向该溶液中加入硫酸钱从所述溶液中沉淀触珠蛋白；
[0040](iii)从含有血红素结合蛋白的该溶液中分离沉淀的触珠蛋白；和
[0041](iv)以一个或多个步骤分别纯化触珠蛋白和/或血红素结合蛋白。
[0042]触珠蛋白(Hp)是一种由成人的肝合成且分泌到血浆中四链(α2β)糖蛋白。Hp的前肽形式被蛋白酶切割成α-链和β-链。然后，Hp蛋白的两个α-亚基和两个β-亚基通过链间二硫键结合，形成成熟肽，其可以是(α β)_ 二聚体或(α β)_多聚体。血红素结合蛋白(Hx)是一个包含单一 439个氨基酸长肽链的60-kD血浆β-1B-糖蛋白，其形成由结构域间连接基结合的两个结构域。其对于任何表征的血红素-结合蛋白的血红素都具有已知最高的亲和力(KcKlpM)，并且以结构域间连接基形成的口袋内Hx的两个结构域之间的等摩尔比结合血红素。
[0043]本发明人发现浓度在约2.0M至约2.5Μ范围内，优选地在约2.2Μ至约2.5Μ范围内，更优选约2.4Μ的硫酸铵对于从同一起始原料分离两种蛋白质是最佳的。因此，在一个实施方案中，所述方法包括通过向溶液中加入约2.0M至约2.5Μ的硫酸铵从所述溶液中沉淀触珠蛋白。在另一个实施方案中，所述方法包括通过向溶液中加入约2.2Μ至约2.5Μ的硫酸铵从所述溶液中沉淀触珠蛋白。在又另一个实施方案中，所述方法包括通过向溶液中加入约2.4Μ的硫酸铵从所述溶液中沉淀触珠蛋白。在特定实施方案中，硫酸铵的浓度为2.0M或 2.1M 或 2.2Μ 或 2.3Μ 或 2.4Μ 或 2.5Μ。
[0044]本发明人还表明对于从同一起始原料分离两种蛋白质而言，维持在小于或等于约8的范围、优选约6到约8、更优选约7的pH是最佳的。因此，在一个实施方案中，所述方法包括在小于或等于8的pH从溶液中沉淀触珠蛋白。在另一个实施方案中，所述方法包括在约6至约8范围内的pH从溶液中沉淀触珠蛋白。在另一个实施方