具有导电率小于6.0mS/cm的50mM乙酸钠。其它实施方案利用pH约5至约6的约10至约40mM乙酸钠。
[0066]其它实施方案包括通过加入水(比如注射用水(WFI))稀释触珠蛋白负载溶液以降低离子强度。例如，用WFI进行1:4至1:5稀释，包含pH 5.3-5.7的50mM乙酸钠的触珠蛋白溶液将具有约10-13mM的最终乙酸钠浓度、pH 5.3至5.7和小于5.0mS/cm的导电率。这通常允许触珠蛋白结合阴离子交换色谱树脂。
[0067]如果需要pH调节超出触珠蛋白溶液中缓冲剂的缓冲范围，则可以向触珠蛋白溶液中加入另外的缓冲剂。另外的缓冲剂通常具有约5mM至约10mM的浓度和范围约5至约9的pH。在特定实施方案中，另外的缓冲剂应当在约1mM至约60mM的范围内，pH范围为约5至约9。另外的缓冲剂的一个实例是乙酸钠。特定实施方案利用pH范围5.0至6.0的50mM乙酸钠。在一个优选的实施方案中，缓冲剂为pH范围pH 5.3至pH 5.7的50mM乙酸钠。
[0068]适于从树脂中洗脱触珠蛋白的缓冲液也是本领域技术人员已知的。在特定实施方案中，合适的缓冲剂具有约5mM至约10mM范围内的浓度。在特定实施方案中，缓冲剂具有的浓度范围为约1mM至约60mM。一个实例包括乙酸钠。特定实施方案利用pH 5.0至6.0的50mM乙酸钠。其它实施方案利用pH约5.0至约6.0的约10至约40mM乙酸钠。在一个优选的实施方案中，缓冲剂为PH为约pH 5.3至约pH 5.7的约50mM乙酸钠。
[0069]在进一步的实施方案中，触珠蛋白是用包含约10mM至约200mMNaCl的洗脱缓冲液从阴离子交换树脂洗脱的。这等同于具有导电率范围约10mS/cm(100mM NaCl)至约18mS/cm(200mM NaCl)的洗脱缓冲液。在特定实施方案中，在约150至170mM NaCl的存在下洗脱触珠蛋白。在一个优选的实施方案中，在约160mM NaCl的存在下洗脱触珠蛋白。然而，本领域技术人员应当知道洗脱缓冲液的NaCl浓度将取决于应用于柱的蛋白质负载，为了获得从树脂洗脱的触珠蛋白的必要的回收率和纯度，可能需要超出所述限度的调节。
[0070]在一个实施方案中，回收洗脱的触珠蛋白并分别贮存备用。在另一个实施方案中，根据需要，例如通过浓缩和渗滤洗脱的触珠蛋白穿过超滤膜和/或无菌过滤浓缩的和/或渗滤的触珠蛋白来进一步纯化洗脱的触珠蛋白。
[0071]在一个实施方案中，所述方法进一步包括:
[0072](i)在使血红素结合蛋白结合树脂的条件下，使含有血红素结合蛋白的溶液穿过疏水性相互作用色谱树脂；
[0073](ii)收集来自步骤⑴的流出级分；
[0074](iii)任选地在步骤(ii)之后，冲洗所述树脂，并收集流出的冲洗级分；和
[0075](iv)在步骤(ii)之后和/或在步骤(iii)之后，从所述树脂洗脱血红素结合蛋白；和
[0076](V)回收洗脱的血红素结合蛋白。
[0077]疏水性相互作用色谱法(HIC)是一种基于固定相和待分离的蛋白质之间疏水性相互作用常常用于分离蛋白质的色谱技术。靶蛋白的疏水性水平将通常决定了使用的HIC树脂的类型。在HIC期间，通常向溶液中加入大量的盐以降低靶蛋白的溶解度，因此增加了靶蛋白与被合适的疏水基(例如苯基、丁基和十八烷基)功能化的HIC树脂的相互作用。合适的盐通常包括硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、氯化铵、氯化钠、溴化钠和硫氰酸钠。合适的疏水性相互作用色谱树脂是本领域技术人员熟知的。实例包括辛基琼脂糖和capto辛基色谱树月旨。允许血红素结合蛋白结合树脂的条件是本领域技术人员已知的，将例如由使用的树脂类型和靶蛋白(即，血红素结合蛋白)的疏水性决定。
[0078]血红素结合蛋白负载溶液含有硫酸铵，因此，用于柱平衡的合适的缓冲液包括浓度为约5mM至约10mM的缓冲剂，其保持约6至约8的pH且含有约2至2.5M硫酸铵。这些条件允许血红素结合蛋白结合疏水性相互作用色谱介质。另一个实施方案利用浓度2.2至2.5M、pH7.0至8.0的硫酸铵。在一个特定实施方案中，缓冲溶液为50mM Tris，含有2.5M硫酸铵，pH 7.4ο
[0079]血红素结合蛋白负载溶液通常含有在pH约6至约8缓冲的约2.0至约2.5M硫酸铵。这些条件允许血红素结合蛋白结合疏水性相互作用介质。在另一个实施方案中，血红素结合蛋白负载溶液含有在pH 7.0至8.0缓冲的2.2M至2.5M硫酸铵。在一个特定实施方案中，血红素结合蛋白负载溶液含有作为缓冲剂的50mM Tris和pH 7.4的2.5M硫酸铵。
[0080]一旦使含有血红素结合蛋白的溶液通过疏水性相互作用色谱(HIC)树脂，则可以收集流过级分并储存备用，如本文公开的。
[0081]结合的血红素结合蛋白可以是利用本领域技术人员已知的方式从树脂洗脱的。在从树脂洗脱血红素结合蛋白之前，可以在使结合的血红素结合蛋白保持在树脂的条件下，任选地用合适的冲洗溶液或缓冲液冲洗树脂。合适的冲洗溶液和条件是本领域技术人员已知的。冲洗溶液的浓度在某种程度上取决于柱负载，然而典型的洗涤溶液在约6至约8的pH具有缓冲效应，并且另外含有约0.8M至1.5M硫酸铵。在另一个实施方案中，洗涤溶液含有pH 7.0至8.0的0.9M至1.3M硫酸铵。在一个特定实施方案中，冲洗溶液含有作为缓冲剂的50mMTris、l.13M硫酸铵，pH 7.4。根据需要，也可以收集流过的冲洗级分并储存备用。
[0082]从树脂回收的洗脱的血红素结合蛋白可以储存备将来使用。洗脱的血红素结合蛋白也可以进行进一步纯化，以除去洗脱液中的任何杂质。因此，在一个实施方案中，所述方法进一步包括:
[0083](i)在允许血红素结合蛋白结合树脂的条件下，使洗脱的血红素结合蛋白通过金属离子亲和色谱树脂；
[0084](ii)从所述树脂洗脱血红素结合蛋白；和
[0085](iii)回收洗脱的血红素结合蛋白。
[0086]固定金属离子亲和色谱(IMAC)是基于氨基酸(例如组氨酸)共价连接金属，允许对于金属离子具有亲和性的蛋白质保留在含有固定金属离子(比如锌、钴、镍或铜)的柱中。合适的金属离子亲和色谱树脂是本领域技术人员已知的。在一个实施方案中，金属离子亲和色谱树脂为N1-琼脂糖(N1-Sepharose)。
[0087]适于平衡和结合的缓冲液目的是防止非特异性结合色谱介质，且最优地促进血红素结合蛋白的亲和性，同时使污染蛋白质的结合降至最少。用于平衡和结合的缓冲液通常具有的pH范围为约6至约9，并且包括加入约0.5M至约1.0M氯化钠连同加入少量(即，I至50mM)的组氨酸或咪唑。在一些实施方案中，缓冲液由0.5mM至10mM磷酸钠，约pH 7至约8，约0.5M至约1.0M氯化钠和约ImM至约50mM咪唑组成。在一个特定实施方案中，平衡和结合缓冲液由20mM磷酸钠、0.5MNaCl和30mM咪唑，pH 7.4组成。通过加入期望的固体赋形剂或加入浓缩溶液，可以将负载溶液(辛基洗脱液(Octyl Eluate))调节至这些浓度。
[0088]一旦血红素结合蛋白结合金属离子亲和色谱(IMAC)树脂，则可以在使结合的血红素结合蛋白保留在树脂的条件下，冲洗该树脂以除去任何残留未结合的或弱结合的杂质。适于冲洗步骤的缓冲液在6.0至9.0的pH范围之内，并且包括加入0.5M至1.0M氯化钠连同加入少量(即I至50mM)的组氨酸或咪唑。在某些实施方案中，缓冲液由约0.5mM至约10mM磷酸钠(约pH 7至约pH 8)、与约0.5M至约1.0M氯化钠、及约ImM至约80mM咪唑组成。在一个特定实施方案中，冲洗缓冲液由20mM磷酸钠、0.5M NaCl和30mM咪唑、pH7.4组成。
[0089]可以通过本领域技术人员已知的方式从树脂洗脱结合的血红素结合蛋白。适于洗脱的缓冲液具有在约6至约9的pH范围内，并且包括加入约0.5M至约1.0M氯化钠连同浓度足够高至促进洗脱的组氨酸或咪唑。在某些实施方案中，洗脱缓冲液由约0.5mM至约10mM磷酸钠(约pH 7.0至约pH 8)、与约0.5M至约1.0M氯化钠、及少于约80mM咪唑组成。在一个特定实施方案中，洗脱缓冲液由20mM磷酸钠、0.5M NaCl和10mM咪唑、pH 7.4组成。可选地，通过应用在约pH 4.0至约pH 6.0之间的低pH缓冲液，可以洗脱结合的血红素结合蛋白。某些实施方案利用在pH为约4.0至约pH 6.0的约5mM至约10mM乙酸钠缓冲液与约0.5M至约1.0M NaCl作为洗脱缓冲液。根据需要，例如通过浓缩和渗滤血红素结合蛋白穿过超滤膜和/或无菌过滤该浓缩的和/或渗滤的血红素结合蛋白，可以进一步纯化洗脱的血红素结合蛋白。
[0090]本发明人还发现在硫酸铵的存在下沉淀触珠蛋白之后，可存在于起始原料中的任何转铁蛋白保留在溶液中(即，包含血红素结合蛋白的溶液中)。因此，本文公开的本发明的方法也可以用于从同一起始原料纯化转铁蛋白。因此，提供的条件对于从同一起始原料纯化所有三种蛋白质(Hp、Hx和转铁蛋白)都是最佳的。因此，在一个实施方案中，含有触珠蛋白和血红素结合蛋白两者的溶液(例如，起始原料)进一步包括转铁蛋白。
[0091]在一个实施方案中，所述方法进一步包括:
[0092](a)在允许血红素结合蛋白结合树脂的条件下，使含有血红素结合蛋白的溶液穿过疏水性相互作用色谱树脂；
[0093](b)收集来自步骤(a)的流出级分；
[0094](c)任选地在步骤(b)之后，冲洗所述树脂，并收集流出的冲洗级分；
[0095](d)在使转铁蛋白结合树脂的条件下，使来自步骤(b)的流过级分和/或来自步骤(C)的流过级分通过阴离子交换色谱树脂；和
[0096](e)回收来自所述树脂的转铁蛋白。
[0097]在特定实施方案中，步骤(ii)阴离子交换色谱树脂为强阴离子交换色谱树脂。在其它特定实施方案中，步骤(ii)的阴离子交换色谱树脂为弱阴离子交换色谱树脂。
[0098]合适的强阴离子交换色谱树脂是本领域技术人员已知的。合适的阴离子交换树脂的实例为包含功能性季铵基团(Q)和/或二乙基氨基丙基基团(ANX)的阴离子交换树脂。在一个实施方案中，强阴离子交换色谱树脂包括功能性季铵基团(例如，Capto QImpRes?)。
[0099]合适的弱阴离子交换色谱树脂是本领域技术人员已知的。实例包括包含叔胺或仲胺官能团比如DEAE(二乙氨基乙基)的树脂。
[0100]本领域技术人员也能确定，由于HIC冲洗级分的离子强度；将需要稀释、渗滤、色谱脱盐、或缓冲液交换/离子强度降低的其它方法以允许转铁蛋白结合阴离子交换树脂。一种这样的色谱脱盐方法包括将含有约0.8M至约1.5M硫酸铵的HIC冲洗级分(转铁蛋白)直接结合在更强的疏水性配体比如苯基或丁基柱上。一旦结合，转铁蛋白可以洗脱在制备用于阴离子交换色谱的WFI或低离子强度缓冲液中。
[0101 ] 适于阴离子交换色谱平衡和结合的缓冲液允许转铁蛋白结合到阴离子交换介质，以促进色谱分离转铁蛋白与其它杂质。适于色谱介质平衡的缓冲液具有约5mM至约10mM的浓度、约6至约9的pH范围与小于约9.0mS/cm的导电率。这些条件允许转铁蛋白结合至阴离子交换介质。在特定实施方案中，缓冲剂的范围为约1mM至约60mM，pH范围为约6至约9，导电率小于约7.0mS/cm。合适的缓冲剂的实例包括Tris和磷酸钠。特定实施方案利用pH范围为约7至约9、导电率小于约6.0mS/cm的50mM Tris。其它实施方案利用pH为约7.0至约9.0、导电率小于约5.0mS/cm的约10至约4