0mM Tris缓冲液。
[0102]适于从树脂中洗脱转铁蛋白的缓冲液也是本领域技术人员已知的。在特定实施方案中，合适的缓冲液具有约5mM至约10mM范围内的浓度。在特定实施方案中，缓冲剂的范围为约1mM至约60mM。合适的缓冲剂的实例包括Tris或磷酸钠。特定实施方案利用pH范围为约7至约9的50mM Tris。其它实施方案利用pH为约7至约9的约10至约40mM乙酸钠缓冲剂。本领域技术人员应当知道洗脱缓冲剂NaCl的浓度一定程度上取决于应用于色谱树脂的蛋白质负载。洗脱方法由步骤梯度组成，其中缓冲液的NaCl浓度逐步增加以洗脱出转铁蛋白，或者通过使用线性梯度，其中缓冲液的NaCl以线性方式慢慢地增加，并且监测柱流出物以确保收集转铁蛋白。
[0103]一旦从阴离子交换色谱树脂回收转铁蛋白，则根据需要，可以将其进一步纯化，例如通过浓缩和渗滤转铁蛋白穿过超滤膜和/或无菌过滤该浓缩的和/或渗滤的转铁蛋白。
[0104]当对于临床或兽医应用(例如，用于施用于患有与溶血相关病症的受试者)使用包含触珠蛋白和/或血红素结合蛋白和/或转铁蛋白的溶液时，本领域技术人员应当理解可期望降低溶液中活性病毒含量(病毒滴度)及其它可能的传染剂(例如朊病毒)的水平。当包含触珠蛋白和/或血红素结合蛋白和/或转铁蛋白的原料(即，起始原料)源自血浆时，这可能特别需要。降低溶液中病毒滴度的方法是本领域技术人员已知的。实例包括巴氏灭菌(例如，在高浓度稳定剂比如甘氨酸(例如2.75M)和蔗糖(例如50% )和/或其它选择的赋形剂或盐的存在下，在60°C下培养溶液10小时)、干热处理、病毒过滤(使溶液通过纳米过滤器；例如20nm截留(cut-off))和/或使溶液接受用合适的有机溶剂和洗涤剂处理一段时间且处于灭活溶液中病毒的情况下。溶剂洗涤剂已经用于灭活特别是血浆来源产品中的包膜病毒20多年。因此，可以使用本领域已知的各种试剂和方法进行(参见例如，US 4540573和US4764369，将其在此并入作为参考)。合适的溶剂包括磷酸三丁酯(TnBP)和醚，优选TnBP(通常约0.3% )。合适的洗涤剂包括聚山梨酯(吐温)80、聚山梨酯(吐温)20和Triton X-100 (通常约0.3% )。包括溶剂和洗涤剂浓度的处理条件的选择部分取决于原料的特性，纯原料越少通常需要越高浓度的试剂和更苛刻的反应条件。优选的洗涤剂是聚山梨酯80，特别优选的组合是聚山梨酯80和ΤηΒΡ。可以在一定温度下搅拌原料与溶剂和洗涤剂试剂并持续足够灭活可能存在的任何包膜病毒的时间。例如，溶剂洗涤剂处理可以在25°C下进行约4小时。接着，通过例如吸附在色谱介质比如C-18疏水性树脂上或在吸附感兴趣的蛋白质的条件下，将其在离子交换树脂的滴穿(drop-through)级分中洗脱，除去溶剂洗涤剂化学品。
[0105]病毒灭活步骤可以在本文公开的方法的任何合适的步骤中进行。在一个实施方案中，在第一个描述的方面的步骤(ii)之前，使包含触珠蛋白和/或血红素结合蛋白和/或转铁蛋白的原料进行病毒灭活步骤。在另一个实施方案中，使包含从硫酸铵沉淀步骤(即，步骤(ii)和/或(iii))回收的触珠蛋白和/或血红素结合蛋白和/或转铁蛋白的溶液进行病毒灭活步骤。在其它实施方案中，在步骤iii)之后进行病毒灭活步骤。
[0106]在本文公开的一个实施方案中，病毒灭活步骤包括巴氏灭菌和/或用有机溶剂和洗涤剂处理。在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括在55°C至61°C下加热包含触珠蛋白和/或血红素结合蛋白和/或转铁蛋白的溶液约30分钟至约12小时。在一个特定实施方案中，加热该溶液约10至约10.5小时。在另一个本文公开的实施方案中，病毒灭活步骤包括病毒过滤。在一个特定实施方案中，本发明的方法进一步包括过滤包含血红素结合蛋白和/或转铁蛋白的溶液穿过具有孔径为15nm至35nm的病毒过滤器。当使用病毒过滤时，本发明人发现在过滤步骤之前加入游离氨基酸(例如，精氨酸)可以显著地提高通量率和通过过滤器回收触珠蛋白和/或血红素结合蛋白和/或转铁蛋白。这种方法的一个实例描述在US7919592中。
[0107]在本文公开的一个实施方案中，在包含触珠蛋白和/或血红素结合蛋白和/或转铁蛋白的原料或溶液通过色谱树脂之前，其进行病毒灭活步骤。在处理的溶液或原料通过色谱树脂比如阴离子交换树脂之前，使用病毒灭活步骤比如溶剂洗涤剂处理的优点是其允许利用促进触珠蛋白和/或血红素结合蛋白和/或转铁蛋白结合所述树脂和用流过(滴过)级分除去有机溶剂和洗涤剂的条件，从所述处理的溶液中除去有机溶剂和洗涤剂。
[0108]巴氏灭菌可以产生蛋白质聚集体和聚合物。因此，在某些情况下，可能需要降低巴氏杀菌溶液中聚集体/聚合物的含量。这可以通过本领域技术人员已知的任何方式实现，虽然方便地可以通过进一步色谱纯化实现。在本文公开的一个实施方案中，使巴氏杀菌溶液或原料通过相对于触珠蛋白和/或血红素结合蛋白和/或转铁蛋白的正离子模式的阴离子交换色谱树脂，使得用流过(滴过)级分除去任何聚集体或聚合物。
[0109]在特定实施方案中，除非另有明确说明，否则纯化触珠蛋白和/或血红素结合蛋白和/或转铁蛋白的方法通常在约18°C至约26°C的温度范围中进行。
[0110]在本发明的另一个方面，提供一种包含通过本文公开的方法回收的触珠蛋白的组合物。在一个实施方案中，所述组合物包含含量为总蛋白的至少80%的触珠蛋白。在另一个实施方案中，所述组合物包含含量为总蛋白的至少90 %的触珠蛋白。在另一个实施方案中，所述组合物包含含量为至少95 %的触珠蛋白。在又另一个实施方案中，所述组合物包含含量为至少98%的触珠蛋白。在一个特定实施方案中，包含触珠蛋白的组合物包含小于0.03mg的IgA/mg触珠蛋白，如通过免疫比池法测定。在特定实施方案中，当触珠蛋白浓度为26mg/mL时，包含触珠蛋白的组合物含有小于0.067mg/mL IgG、小于0.042mg/mL IgM、小于0.050mg/mL α -1-酸糖蛋白、小于0.018mg/mL前白蛋白、小于0.021mg/mL血楽铜蓝蛋白、小于0.051mg/mL血红素结合蛋白、小于0.053mg/mL载脂蛋白A-1、小于0.227载脂蛋白B、小于0.031mg/mL抗凝血酶II1、小于0.lmg/mL转铁蛋白、小于0.07mg/mL α -1-抗胰蛋白酶、小于0.lmg/mL α -2-巨球蛋白、小于0.7mg/mL IgA和小于0.15mg/mL白蛋白(如通过免疫比浊法测定)。
[0111]在本发明的另一个方面，提供一种包含通过本文公开的方法回收的血红素结合蛋白的组合物。在一个实施方案中，所述组合物包含含量为总蛋白的至少80%的血红素结合蛋白。在另一个实施方案中，所述组合物包含含量为总蛋白的至少90 %的血红素结合蛋白。在另一个实施方案中，所述组合物包含含量为至少95 %的血红素结合蛋白。在另一个实施方案中，所述组合物包含含量为至少97 %的血红素结合蛋白。在又另一个实施方案中，所述组合物包含含量为至少98%的血红素结合蛋白。
[0112]在特定实施方案中，包含血红素结合蛋白的组合物为至少98 %纯，并且包含小于
0.067mg/mL IgG、小于 0.066mg/mL IgA、小于 0.042mg/mL IgM、小于 0.048mg/mL α-1-抗膜蛋白酶、小于0.090mg/ml转铁蛋白、小于0.050mg/mL α -1-酸糖蛋白、小于0.018mg/mL前白蛋白、小于0.021mg/mL血楽铜蓝蛋白、小于0.053mg/mL载脂蛋白A-1、小于0.227mg/mL载脂蛋白B、小于0.031mg/mL抗凝血酶II1、小于0.17mg/mL结合球蛋白和小于0.045mg/mL白蛋白(如通过免疫比浊法测定)。
[0113]在特定实施方案中，包含血红素结合蛋白的组合物为至少97 %纯，并且含有小于
1.7%触珠蛋白、小于0.4%转铁蛋白、小于0.2%白蛋白、和小于0.1% α-2巨球蛋白，如通过免疫比浊法测定。
[0114]在本发明的另一个方面，提供一种包含通过本文公开的方法回收的转铁蛋白的组合物。在一个实施方案中，所述组合物包含含量为总蛋白的至少80%的转铁蛋白。在另一个实施方案中，所述组合物包含含量为总蛋白的至少90 %的转铁蛋白。在另一个实施方案中，所述组合物包含含量为至少95 %的转铁蛋白。在又另一个实施方案中，所述组合物包含含量为至少98%的转铁蛋白。
[0115]在本发明的另一个方面，提供一种包含通过本文公开的方法回收的触珠蛋白和本文公开的方法回收的血红素结合蛋白的组合物。在一个实施方案中，所述组合物包含含量为总蛋白的至少80 %的组合触珠蛋白和血红素结合蛋白。在另一个实施方案中，所述组合物包含含量为总蛋白的至少90%的组合触珠蛋白和血红素结合蛋白。在另一个实施方案中，所述组合物包含含量为总蛋白的至少95%的组合触珠蛋白和血红素结合蛋白。在又另一个实施方案中，所述组合物包含含量为总蛋白的至少98 %的组合触珠蛋白和血红素结合蛋白O
[0116]在一个实施方案中，所述组合物进一步包含通过本文公开的方法回收的转铁蛋白。在一个实施方案中，所述组合物包含含量为总蛋白的至少80 %的组合触珠蛋白、血红素结合蛋白和转铁蛋白。在另一个实施方案中，所述组合物包含含量为总蛋白的至少90 %的组合触珠蛋白、血红素结合蛋白和转铁蛋白。在另一个实施方案中，所述组合物包含含量为总蛋白的至少95%的组合触珠蛋白、血红素结合蛋白和转铁蛋白。在仍然另一实施方案中，所述组合物包含含量为总蛋白的至少98 %的组合触珠蛋白、血红素结合蛋白和转铁蛋白。
[0117]在本发明的另一个方面，提供一种包含含量为总蛋白的至少80 %、90 %、95 %或98%的触珠蛋白的组合物。在本发明的另一个方面，提供一种包含含量为总蛋白的至少80%、90%、95%或98%的血红素结合蛋白的组合物。在本发明的另一个方面，提供一种包含含量为总蛋白的至少80 %、90 %、95 %或98 %的组合血红素结合蛋白和触珠蛋白。在本发明的仍然另一个方面，提供一种包含含量为总蛋白的至少80 %、90 %、95 %或98 %的组合血红素结合蛋白、触珠蛋白和转铁蛋白的组合物。
[0118]包含通过本文公开的本发明的方法回收的触珠蛋白、血红素结合蛋白和/或转铁蛋白的组合物基本上不含它们通常结合的其它组分(例如，其它血浆衍生蛋白)。因此，在一个实施方案中，包含触珠蛋白、血红素结合蛋白和/或转铁蛋白的组合物将包含小于总蛋白的20%、优选地小于总蛋白的10%、更优选地小于总蛋白的5%的它们通常结合的其它组分(即，杂质)。本领域技术人员应当理解本发明的组合物中存在的杂质含量可取决于组合物的预期用途。例如，当将该组合物施用于需要其的人类受试者(即，用于临床用途)时，期望该组合物包含小于(总蛋白的)5%的杂质。相反，当在体外使用蛋白质时，如果组合物包含多于(总蛋白的)5%的杂质则可能是可接受的。
[0119]在本发明的另一个方面，提供一种包含如本文公开的本发明的组合物和可药用载体的制剂。
[0120]合适的可药用载体、稀释剂和/或赋形剂是本领域技术人员已知的。实例包括溶剂、分散介质、抗真菌剂和抗菌剂、表面活性剂、等渗剂和吸收剂等。
[0121]药物制剂也可以通过加入合适的稳定剂例如氨基酸、碳水化合物、盐和洗涤剂(或其组合)来配制。在特定实施方案中，稳定剂包含糖醇和氨基酸的混合物。稳定剂可以包括糖(例如蔗糖或海藻糖)、糖醇(例如甘露醇或山梨醇)、和氨基酸(例如脯氨酸、甘氨酸和精氨酸)的混合物。在一个优选的实施方案中，制剂包含氨基酸比如精氨酸。在其它实施方案中，所述制剂包含浓度至多10mM的二价金属离子和如US7045