0032] 9)沉淀继续用悬浮缓冲液悬浮，12000rpm离心10min，取上清。
[0033] 10)进一步纯化采用鹿糖硫酸铯不连续密度梯度离心法，用Beckman Optima L-100XP SW32 型转头 22000rpm，离心 3h ;
[0034] 11)取离心管上端1/3处为病毒层，用样品缓冲液稀释，用Beckman Optima L-100XP Type 70Ti 型转头 40000rpm，离心 Ih ;
[0035] 12)沉淀用0· 5mL样品缓冲液（0· 05M磷酸盐缓冲液）悬浮，即为所提纯病毒溶液。
[0036] 2.免疫动物
[0037] 用提纯的小麦黄花叶病毒的病毒粒子免疫4-5周龄体重18_20g BALB/c雌性 小鼠。初次免疫：提纯的WYMV病毒粒子用生理盐水加以稀释，与等体积弗氏完全佐剂 (Freund' s complete adjuvant，FC)混合，充分乳化后经背腹部皮下多点注射；3周后再 次免疫：免疫原仍用生理盐水稀释，再与等体积的弗氏不完全佐剂（Freund' s incomplete adjuvant，FIA)充分乳化后，进行腹腔注射；之后每隔3周进行2次加强免疫：取2倍剂量 的抗原进行腹腔注射。第四次免疫3天后取脾细胞进行融合。
[0038] 3.细胞融合
[0039] 取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0)按10 : 1的比例，在无血清 的RPMI-1640培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50% PEG(Sigma，分子量 1500)作为融合剂，在37°C下水浴下加入lmL，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养 基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细 胞板中，37°C，5% 0)2的细胞培养箱中培养。
[0040] 4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆
[0041] 细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等 到融合细胞覆盖孔底5% -50%时，以感染WYMV的小麦叶片和提纯病毒为检测抗原包被，用 常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获42个阳性孔。选择7个呈强阳性反应的细胞孔，进 行有限稀释法克隆，获得1株能分泌抗WYMV的特异性单抗的杂交瘤细胞株6F4。经6个月 以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后， 用于腹水制备和液氮保存。
[0042] 5.单克隆抗体的特异性检测
[0043] 用感染小麦黄花叶病毒、中国小麦花叶病毒、大麦黄花叶病毒、小麦矮缩病毒、水 稻黑条矮缩病毒、水稻条纹病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、宪 青花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、西瓜花叶病毒、小西萌芦黄花叶病毒、马铃薯X病毒的 病叶汁包被ELISA板，以相应的健叶提取液作阴性对照，以小麦黄花叶病毒（WYMV)为阳性 对照，用ACP-ELISA法测定单抗的特异性反应。ACP-ELJSA方法具体为上述病毒感染的病叶 用液氮研磨成粉末，按1 : 30 (w/v，g/mL)加入ELISA包被液研磨后IOOuL/孔包被ELISA 板，4°C过夜或37°C 2小时使其吸附于ELISA板孔；PBST洗涤3次后用3%的脱脂奶粉或1 % BSA封闭30-60min :加入适当稀释的单抗IOOuL/孔，37°C 1. 5-2小时；PBST洗涤3次后加 入稀释10000倍的碱性磷酸脂酶（AP)标记的兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）IOOuL/孔，37°C 1. 5-2小时；PBST洗涤4次后，用PNPP底物显色，2mol/L氢氧化钠终止反应，最后用酶标仪 读取0D405的值，以与阴性OD值比值大于2. 1为阳性。结果发现，6F4单抗对小麦黄花叶病 毒（WYMV)的病叶有特异性反应，而与中国小麦花叶病毒、大麦黄花叶病毒、小麦矮缩病毒、 水稻黑条矮缩病毒、水稻条纹病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、 芜青花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、西瓜花叶病毒、小西萌芦黄花叶病毒、马铃薯X病毒 及健康植物的样品均无免疫反应。
[0044] 6.单克隆抗体腹水的制备及纯化
[0045] 取对数生长期的杂交瘤细胞，1500rpm离心lmin，细胞沉淀悬浮于加适量链霉素 和青霉素生理盐水中，悬浮细胞浓度约为IO 6个/mL。取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注 射0. 3-0. 5mL阵植烷（Sigma)，7-10天后腹腔注入0. 2mL杂交瘤细胞悬浮液，注射后7-10 天可见小鼠腹部明显膨大，针头刺入小鼠腹部采取腹水，3000rpm离心3min，收集上清液， 即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0. 06M PH4. 8醋酸缓冲液稀释，加辛酸 (30ul/mL腹水），室温下边加边搅拌，4°C澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清液，再 用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4°(：放置2小时，3000印111离心201^11，沉淀用2倍体积 的PBS溶液溶解，在4°C流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70°C保存。
[0046] 7.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定
[0047] 将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C小鼠IgGl、IgG2a.，IgG2b，IgG3、 IgM抗体作双向琼脂扩散试验，结果6F4单抗亚类为IgG2b、kappa链。用间接ELISA方法 检测单抗腹水的效价，检测结果表明上述单抗腹水的效价在10 7。
[0048] 二、病毒免疫学检测方法
[0049] I. dot-ELISA方法的建立及其检测应用
[0050] 将小麦病叶片称重后用液氮研磨成粉末，按I : 10-30 (w/v，g/mL)加入0.0 lmol/L PBS (pH7. 4)的后研磨；病汁液5000rpm离心3min ;取3 μ 1上清点到硝酸纤维素膜（NC)上， 同时设置健康和感病小麦叶汁分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10_20min ;NC膜浸入到 含5%脱脂奶粉的0.01111〇1/1?851'(含0.05%了￥6611-20)封闭液中，37°(：封闭301^11 ;从：膜 放入适度稀释的单抗中，37°C孵育60-90min ;用PBST洗膜3-4次，每次3min ;NC膜放入适度 稀释的AP标记羊抗鼠IgG二抗中，37°C孵育60-90min ;PBST洗膜4-5次，每次3min ;66yL NBT 和 33yL BCIP 底物（Promega)加入到 IOmL 底物缓冲液（0· lmol/L TrisCl、0. lmol/L NaCl、0. 025mol/L MgCl、pH9. 5)混匀，膜放入底物液中室温反应5-10min，肉眼观察结果。 待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时用自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。
[0051] 用方阵试验确定检测小麦病叶的dot-ELISA单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试 验表明6F4单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1 : 5000和1 : 10000倍稀释。以上 述抗体的最适工作浓度建立检测WYMV病叶的dot-ELISA方法。灵敏度分析表明，当小麦叶 片稀释到1 : 10240倍（w/v，g/mL)时，以6F4单抗建立的dot-ELISA检测仍呈现紫色的阳 性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1 : 10240倍稀释（图1)。
[0052] 用建立的dot-ELISA方法对2014-2015年来自田间小麦样品进行检测，结果发现， 70个样品中有38个样品产生紫色的阳性斑点（图2)。阳性样品进一步用RT-PCR分析，结 果表明所有的dot-ELISA阳性样品均检测到WYMV特异性的PCR产物，PCR产物核酸测序表 明阳性样品感染WYMV。说明dot-ELISA方法能准确、可靠地用于小麦样品中WYMV的检测。
[0053] 2.以单抗为核心建立的抗原包被ELISA (ACP-ELISA)方法检测病毒
[0054] ACP-ELISA方法的操作步骤：
[0055] 1)包被：用0. 05M碳酸盐缓冲液（pH9. 6)按1 : 30 (w/v，g/mL)倍稀释的病叶汁液 IOOuL/孔加入到ELISA板中，以WYMV小麦病叶为阳性对照，以健康小麦为阴性对照，37°C 2h或4°C过夜；
[0056] 2)封闭：0. 01m〇l/L PBST洗涤3次，每次静置3min，然后用3 %脱脂奶粉封闭 30min ；
[0057] 3) -抗：封闭完后，用0. 01m〇l/L PBST洗涤3次，单抗腹水用3%脱脂奶粉以5000 倍稀释后，每孔加入1〇〇此，37°(：温育111;
[0058] 4)二抗：弃一抗后用0. 01mol/L PBST洗涤3次，再加入10000倍稀释的碱性磷酸