脂酶（AP)标记的羊抗鼠IgG二抗（Sigma)，IOOuL/孔，37°C温育Ih ;
[0059] 5)显色：弃二抗后用0. 01m〇l/L PBST洗涤5次，拍干后每孔加入显色底物 IOOuL (显色底物：PH9. 8的10%乙二醇胺底物缓冲液和PNPP按ImL : Img比例配制），置 室温下待其显色；
[0060] 6)检测：大约30min待其显色完全（用肉眼观察，阳性孔底物颜色变成黄绿色）， 用2mol/L氢氧化钠终止反应后，在酶联免疫检测仪上检测测0D405值，以P/N > 2. 1作为 阳性判断标准。
[0061] ACP-ELISA方法的检测灵敏度
[0062] 单抗腹水工作浓度为5000倍稀释，对WYMV病叶从I : 10至10240作倍比稀释，以 相应稀释度的健叶汁液作阴性对照，进行上述ACP-ELISA方法的检测。结果表明ACP-ELISA 方法对I : 10~5120倍稀释的病叶汁液呈阳性反应，即对检测病叶的灵敏度可达到 1 : 20480,表明ACP-ELISA方法具有高度的灵敏性和可靠性。
[0063] 3.检测WYMV的TAS-ELISA检测方法
[0064] TAS-ELISA方法的操作流程：
[0065] 1) 5000倍稀释的抗WYMV的兔抗血清（自提纯的WYMV病毒粒子免疫兔子制 备）IOOuL/孔包被聚苯乙烯板，37°C 2-4h或4°C过夜；
[0066] 2)0.01111〇1/1?851'洗涤3次，每次静置31^11，然后加5-10%的脱脂奶粉或1-3% BSA 封闭，200ul/孔，37°C封闭 30-60min ;
[0067] 3)加入检测样品IOOuL/孔，同时以WYMV病叶为阳性对照，以健康小麦为阴性对 照，37°C l_2h;
[0068] 4)0.0 lmol/LPBST洗涤3次后，加入封闭液稀释5000倍的单抗腹水，IOOuL/孔， 37〇C 1-2h ；
[0069] 5)0. 01mol/L PBST洗涤3次后，加入10000倍稀释的AP标记兔抗鼠IgG二抗 (Sigma)，IOOuL/ 孔，37°C l_2h ;
[0070] 6)0. 01mol/L PBST洗涤5次，拍干后每孔加入显色底物IOOuL (显色底物：ΡΗ9· 8 的10%乙二醇胺底物缓冲液和PNPP按ImL : Img比例配制），室温显色30min，肉眼观察阳 性孔底物颜色变成黄绿色，2mol/L氢氧化钠终止反应后，用酶联免疫检测仪测405nm的OD 值，以P/N > 2. 1作为阳性判断标准。
[0071] TAS-ELISA检测方法最适条件的确定：
[0072] 采用TAS-ELISA方阵试验进行，即横向分别加用包被缓冲液从1 : 100至 1 : 102400倍比稀释的兔抗WYMV血清；加入WYMV病汁液；纵向分别加用封闭液在从1 : 5 至1 : 20480倍比稀释单抗腹水；AP标记的兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）按1 : 10000倍 稀释；按TAS-ELISA方法流程进行操作。结果表明WYMV的兔抗血清及单抗的最适稀释度分 别为 1 : 10000 和 1 : 5000。
[0073] TAS-ELISA方法检测灵敏度的确定
[0074] 在兔抗血清和单抗腹水最适工作浓度下，将WYMV病叶汁液用0.0 lmol/L PBS液 进行倍比稀释后进行TAS-ELISA测定，测定结果为：TAS-ELISA检测病叶的灵敏度达到 1 : 20480倍稀释（w/v，g/mL)，说明本方法具有很好的灵敏度。
[0075] 三、小麦黄花叶病毒dot-ELISA检测试剂盒
[0076] 1)试剂盒主要成分：
[0077]
[0078] 以上试剂均保存于4°C下
[0079] 硝酸纤维素膜（NC) 10张
[0080] 2)检测小麦样品的操作步骤：
[0081] A.将小麦叶片称重后用液氮研磨成粉末，按I : 10~30(w/v，g/mL)加入 0· 01mol/L PBS(pH7. 4)后研磨；
[0082] Β·病汁液 5000rpm 离心 3min ;
[0083] C.取3 μ L上清点到NC上，同时设置健康和感病小麦叶汁分别作为阴性和阳性对 照，室温干燥10-20min ;
[0084] D. NC 膜浸入到含 5 % 脱脂奶粉的 0· 01mol/L PBST (含 0· 05 % Tween-20 的 0· Olmol/L PBS)封闭液中室温封闭30min ;
[0085] E. NC膜浸入用抗体稀释液以3000倍稀释的单抗中，室温孵育60~90min ;
[0086] F. NC膜用0· 01m〇l/L PBST洗涤3次，每次静置3min ;NC膜放入用抗体稀释液以 8000倍稀释的AP酶标记羊抗鼠 IgG二抗中，室温孵育60~90min ;
[0087] G. 0· 01mol/L PBST 洗膜 4 ~5 次，每次 3min ;66 μ LNBT 和 33 μ LBCIP 底物加入到 IOmL 底物缓冲液（0.1mol/L Tris Cl、0.1mol/L NaCl、0.025mol/L MgCl、pH9.5)混匀，膜 放入底物液中反应，肉眼观察结果；
[0088] H.待阳性对照显色明显（紫色），而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍 照记录结果。
[0089] 3)保存及有效期
[0090] 于2~8°C避光保存，有效期12个月。
[0091] 4)缓冲液配方：
[0092] 磷酸缓冲液（PBS，0. 01mol/L ρΗ7· 4):
[0094] 加蒸馏水950mL溶解后调pH至7· 4,定容至1000 mL
[0095] ELISA 洗涤液（0· Olmol/L PBST):
[0096] 10OOmT, 0· Olmol/L PBS 中加入 0· 5mT,Tween-20
[0097] ELISA 封闭液：
[0098] 0· Olmol/L PBST中加入脱脂奶粉至终浓度5% (W/V)。
【主权项】
1. 一种分泌抗小麦黄花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株6F4,其特征在于能分泌小 麦黄花叶病毒的特异性单克隆抗体，杂交瘤细胞株6F4于2014年12月25日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMMCNo. 10296。2. -种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株6F4分泌的抗小麦黄花叶病毒的单克隆抗 体，其特征在于所述的单克隆抗体腹水ELISA效价达10 7,抗体类型及亚类为IgG2b、kappa 链，该单克隆抗体能与小麦黄花叶病毒的衣壳蛋白有特异性免疫结合反应，该单抗检测病 叶的灵敏度达到1 : 20480倍稀释。3. -种如权利要求2所述的杂交瘤细胞株6F4分泌的抗小麦黄花叶病毒的单克降抗 体，其特征在于所述的单克隆抗体能与小麦黄花叶病毒有特异性反应，而不与中国小麦花 叶病毒、大麦黄花叶病毒、小麦矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒、水稻条纹病毒、南方水稻黑条 矮缩病毒、黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、芜青花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、西瓜花叶病 毒、小西萌芦黄花叶病毒、马铃薯X病毒反应。4. 一种如权利要求2所述的抗小麦黄花叶病毒的单克隆抗体在该病毒检测上的应用， 其特征在于应用于以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。
【专利摘要】本发明公开了一种分泌抗小麦黄花叶病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。用不连续密度梯度离心法提纯的小麦黄花叶病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗小麦黄花叶病毒特异、灵敏的单克隆抗体的杂交瘤细胞株6F4，其保藏号为CGMMC？No.10296。该杂交瘤细胞分泌的单抗腹水ELISA效价10-7。抗体类型及亚类为IgG2b，kappa链。6F4分泌的单抗与小麦黄花叶病毒有特异性反应，而不与中国小麦花叶病毒、大麦黄花叶病毒、小麦矮缩病毒、黄瓜花叶病毒等反应。该杂交瘤细胞株及其分泌的单抗为小麦病毒病的诊断、检测及科学防控提供技术和物质支撑。CGMCC No.1029620141225
【IPC分类】G01N33/577, C07K16/10, C12R1/91, C12N5/20, G01N33/569
【公开号】CN105018432
【申请号】CN201510504174
【发明人】任春梅, 程兆榜, 杨柳, 繆倩, 周益军
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年8月14日