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[0022] 性能测试 0、药物准备 空白聚合物胶束：将IOmg实施例IPEG-PCL-PEI溶解在2mL由甲醇与乙腈以体积比 1:1组成的混合溶剂中；然后，在超声搅拌下，将混合液滴加到20mL的PBS(pH7. 2)中，通 过旋转蒸发设备真空蒸馏除去有机溶剂，再通过超滤离心过滤装置(截留分子量：100, 〇〇〇 Da)重复洗涤浓缩3次，进一步过滤除去大的聚合物，得空白聚合物胶束。
[0023]FDA聚合物胶束及FDA聚合物胶束滴眼液：将IOmg实施例IPEG-PCL-PEI与0? 5mg FDA(焚光素二乙酸酯Fluoresceindiacetate)溶解在2mL由甲醇与乙腈以体积比1:1组 成的混合溶剂中；然后，在超声搅拌下，将混合液滴加到20mL的PBS(pH7. 2)中，通过旋转 蒸发设备真空蒸馏除去有机溶剂，再通过超滤离心过滤装置(截留分子量：100, 〇〇〇Da)重 复洗涤浓缩3次以除去游离的FDA，进一步过滤除去大的聚合物或FDA聚集体，得负载FDA 的聚合物胶束；该聚合物胶束和生理盐水以1:9的体积比混合，即制成FDA聚合物胶束滴眼 液。
[0024] 环孢素A聚合物胶束及环孢素A聚合物胶束滴眼液：制备方法基本同负载FDA的 聚合物胶束及FDA聚合物胶束滴眼液，只需用环孢素A替换FDA即可。
[0025]FDA纳米颗粒或微米颗粒滴眼液：将0.5mgFDA纳米颗粒或微米颗粒(现有技术制 备）溶解在2mL由甲醇与乙腈以体积比1:1组成的混合溶剂中；然后，在超声搅拌下，将混 合液滴加到20mL的PBS(pH7. 2)中，通过旋转蒸发设备真空蒸馏除去有机溶剂，再通过超 滤离心过滤装置(截留分子量：100, 〇〇〇Da)重复洗涤浓缩3次以除去游离的FDA，进一步 过滤除去大的FDA聚集体，得FDA纳米颗粒或微米颗粒滴眼液。
[0026]1、聚合物胶束的粒径和表面电位测定 用Zeta-Plus电位粒径仪（BrookenHaven)测定空白聚合物胶束的粒径，入射激光波 长入= 532nm，入射角0 =90°，温度为25°C;取三次测量值的平均值。G表面电位使 用Brookhaven专用的微量检测样品池，以增加检测数据的准确性；每组样品，均取5次测 量的平均值。
[0027] 测量结果表明：本发明聚合物胶束具有相对小的粒径(为27. 74nm)和12. 12mv的 表面正电位。正电聚合物胶束可以负载疏水性药物，如图3所示。
[0028] 聚合物胶束的形态通过扫描电镜测定，结果见图4a，为均匀的球形结构。
[0029] 2、载药聚合物胶束载药量的测定 载药聚合物胶束中药物环孢素A的载药量被定义为药物在胶束中的重量百分比。为了 确定载药量，预称重冻干胶束，重新溶解在乙腈/甲醇（1/1，体积比)。用HPLC检测样品的 浓度。其中HPLC所用的色谱柱型号为Waters2695公司，配有X-BridgeTMC18column (3.5Mm, 3.0mmX150mm,Waters,USA)andUV/vis检测器，流动相为乙臆和水（V:V =79:21 )，流速为0.8mL/min，柱温为50°C，注射样品量为20yL。根据事先做好的环孢 素A标准曲线来计算。载药量（DLC，重量％)和载药效率（DLE，重量％)根据下列公式计算： DLC=(所负载的药物质量/聚合物胶束质量）X100% ; DLE=(所负载的药物质量/药物原始投料质量）X100%。
[0030] 结果表明：本发明环孢素A聚合物胶束的载药量（DLC)为3. 47 %和载药效率 (DLE)为 75. 37%。
[0031] 3、体外药物释放行为研究 利用本体平衡反向透析技术研究载药聚合物胶束的体外药物释放行为。具体过程如 下：将环孢素A聚合物胶束分别加入到预定数目的Iml的透析袋中，然后将透析袋浸泡到 200ml磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液的PBS(pH7. 2)中，在35°C的培养箱摇床（中国上海亿恒 科技公司)震荡。在预定的时间点，取出透析袋，高效液相色谱测量药物环孢素A的含量，计 算出不同时间点的累积释放量。在分析环孢素A释放形为时，以时间对环孢素A累积释放 量作图，得到体外环孢素A从聚合物胶束中释放的曲线。
[0032] 载药聚合物胶束的体外释放曲线见图4b，可知：释放曲线具有典型的双相释放模 式：初始快速释放，随后持续缓慢释放可延长时间长达数小时。药物释放，在12小时内达到 44. 8%，在2小时药物释放可以达到31. 7%。
[0033] 4、动物准备和体内双光子显微镜成像 通过腹膜内注射戊巴比妥钠（85毫克/公斤体重）（Sigma-Aldrich公司，美国）将C57BL/6小鼠麻醉。利用塑料眼杯罩在小鼠的眼睛上，利用凡士林进行密封。接着将FDA 聚合物胶束滴眼液滴入眼杯，静置半小时，然后用〇. 9%的食盐水漂洗三次角膜，将小鼠放 置在一个塑料板上，用胶带将头部和四肢固定，眼杯用0. 9%盐水溶液浸泡然后进行体内双 光子3D成像。使用蔡司LSM780NLO荧光成像系统（CarlZeissMicroimagingGmbH, Jena,Germany)，该系统利用蔡司操作系统（Zen2010;CarlZeissMicroimagingGmbH)。
[0034]所有的成像均是使用X20 (Plan-Apochromat,NA=I. 0;CarlZeiss)在水膜浸 泡下进行。采用二重反射光非退探测器分别检测到双光子成像信号。所用的激光功率为最 大激光功率的24~28%。利用小孔为该应用程序设置最大的开放的环境，并且将样品用2毫 米z轴的步长，以产生从角膜内皮到上皮表面延伸的三维数据集进行扫描。图像序列分别 记为12位，512X512像素的图像。研究中使用的扫描速率为每帧968. 14毫秒。角膜三维 数据被从中心收集到旁区域。
[0035] 以FDA纳米颗粒和FDA微米颗粒滴眼液作为对照药物，局部点眼后，药物在老鼠 的眼内分布双光子显微镜检测图见图5。当滴加过FDA聚合物胶束滴眼液后，可以观察到荧 光药物的深角膜渗透行为，并且具有时间依赖性，点药后15分钟时，荧光仅仅存在于角膜 上皮层，而在30分钟时荧光从上皮向角膜的基质层扩散；在60分钟时，基质层的荧光强度 比上皮层强。而对照组滴眼液（FDA纳米颗粒和FDA微米颗粒）的荧光仅仅存在于角膜上 皮层，并且随着时间的延长没有改变。对照结果表明：聚合物胶束能有效克服角膜障碍，释 放模型药物到角膜深层。
【主权项】
1. 一种三元嵌段共聚物，其特征在于分子式为：PEG-PCL-PEI，结构式为：，其中，m、n、x、y 为正整数。2. -种制备如权利要求1所述的三元嵌段共聚物的方法，其特征在于包括以下步骤：51. 合成PEG-PCL-OH:以PEG-OH为引发剂，Sn(0ct)2S催化剂，催化引发e-己内酯 开环聚合；反应结束后，后处理得PEG-PCL-OH;52. 合成PEG-PCL-COOH:PEG-PCL-〇H与琥珀酸酐，于惰性气氛下，羟基酯化反应；反应 结束后，后处理得PEG-PCL-COOH;53. 合成PEG-PCL-PEI:PEG-PCL-COOH、NHS、DCC和PEI在氯仿中，于惰性气氛下，室温 搅拌反应；反应结束后，后处理得PEG-PCL-PEI; S1-S3 中，PEG-PCL-OH、PEG-PCL-COOH、PEG-PCL-PEI的结构式分别为：3. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于具体步骤为：51. 合成PEG-PCL-0H:首先，将PEG-0H和e-己内酯放入烧瓶中，减压干燥；接 着，在惰性气氛下向烧瓶中加入Sn(0ct)2，然后密封烧瓶并浸渍在油浴中，110~120°C开 环聚合20~28h;分离反应液，将固体物溶解在THF中，加入乙醚，收集沉淀，干燥后即得 PEG-PCL-0H；52. 合成PEG-PCL-COOH:将PEG-PCL-0H和马来酸酐溶解在事先干燥好的氯仿中，在惰 性气氛下，60~80°C搅拌回流反应60~84h;分离反应液，固体物经乙醚沉淀纯化得到粗品， 重新溶解在DCM中；将DCM溶液先用盐酸洗涤，再用饱和NaCl溶液洗涤；然后，分离出有机 相，用硫酸镁干燥，并过滤，加入乙醚，收集沉淀，干燥后即得PEG-PCL-COOH; S3.合成PEG-PCLPEG-PCL-PEI:将PEG-PCL-COOH和NHS溶解在氯仿中，并放置在配有 磁力搅拌棒的烧瓶中，烧瓶置于冰水浴中，加入DCC，然后将烧瓶在惰性气氛下密封后，搅拌 均匀，加入PEI的氯仿溶液，继续搅拌均匀，再在室温下搅拌20~28h;过滤，将滤液加入到过 量的乙醚中，收集沉淀物，干燥后即得PEG-PCL-PEI。4.利用如权利要求1所述的三元嵌段共聚物制成的滴眼液，其特征在于按下法制备： 将10~20mg的PEG-PCL-PEI与0. 5~lmg的治疗眼科疾病常用药物溶解在l~2mL由甲醇与 乙腈以体积比1:1~3组成的混合溶剂中；然后，在超声搅拌下，将混合液滴加到20~30mL的 PBS中，真空蒸馏除去有机溶剂，重复洗涤浓缩除去游离的药物，过滤得载药聚合物胶束； 该载药聚合物胶束和生理盐水以1:9~11的体积比混合，即制成滴眼液。
【专利摘要】本发明属于高分子化学与生物医学工程技术领域，具体涉及一种三元嵌段共聚物及其制备方法和利用其制成的滴眼液。分子式为：PEG-PCL-PEI。制备步骤：先合成PEG-PCL-OH，再合成PEG-PCL-COOH，最终合成PEG-PCL-PEI。本发明三元嵌段共聚物可以自组装形成胶束体系进而制成滴眼液，克服了角膜障碍传送药物，具有较高的角膜渗透性，延长了药物在眼部的停留时间。
【IPC分类】C08G65/48, A61P27/02, C08G63/91, C08G73/04, C08G81/00, A61K9/10, A61K47/34, C08G63/08
【公开号】CN105085927
【申请号】CN201510510461
【发明人】李景果, 张俊杰, 王丽娅, 周天洋, 夏慧芸, 何继军, 李恒, 栗占荣, 贺司宇
【申请人】河南省眼科研究所
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月19日