\?0?10乂(￥&271116公司）10^1，上下游引物（1〇1111)各1^1，冊1(293细胞0嫩模板 Iy1 (约50ng)，用灭菌水补足20y1体系。反应条件为：95°C5min预变性，循环内95°C30s 变性，60°C30s退火，72°C延伸40s，共35个循环，PCR反应循环后72°C继续延伸7min，然 后20°C保存。第一轮PCR反应完取每个片段的PCR产物Iy1进行第二轮重叠PCR扩增反 应，具体反应体系是50y1 :具体是2XPCRMIX(Vazyme公司）25yI，Up-F和Down-R引物 (IOmM)各2. 5y1，第一轮PCR产物各段产物Iy1 (共3y1)，用灭菌水补足50y1体系。反 应条件为：95°C5min预变性，循环内95°C30s变性，60°C30s退火，72°C延伸lmin，共40个 循环，PCR反应循环后72°C继续延伸7min，然后20°C保存。
[0059] PCR完成后取3ylPCR产物进行1%琼脂糖电泳结果参见图2。其中，M为DNA Marker2000，右边箭头所指为本发明的环状RNA人工过表达框架目标条带。
[0060] 将PCR产物切胶回收，使用胶回收试剂盒回收纯化，然后用Nhel、XhoI酶切后，将 此框架构建到真核表达载体pcDNA3. 1 (+)中，构建得到含有环状RNA过表达框架的载体，其 模式图谱参见图3。
[0061 ] 测试例：本发明的环状RNA人工过表达框架过表达环状RNA测试
[0062] 根据环状RNA-MET基因，（circbae数据库登录号：hsa_circ_0082002,全长为 1214bp)序列设计PCR扩增引物，扩增此环状RNA的线性序列，环状RNA-MET基因核苷酸序 列由1214bp组成；然后通过KpnI和BamHI酶切位点将目标核苷酸序列连接到本发明的环 状RNA人工过表达框架中，构建过表达载体，然后将此载体转染到HEK293细胞中。
[0063] 通过荧光定量PCR检测，构建的环状RNA人工过表达框架成功地过表达目标环状 RNA。其具体检测步骤如下：
[0064] 1、环状RNA-MET基因PCR扩增引物设计
[0065] 引物设计好后，需在正向引物5'端加入KpnI酶切位点序列，反向引物5'端加入 BamHI酶切位点序列，引物序列如下：
[0066] RNA-MET-F: 5 'GGGGTACCAGATAAACCTCTCATAATGAAGG3 '
[0067] RNA-MET-R: 5 'CGGGATCCACCCTATTAAAGCAGTGCTCATGATT3 '
[0068] 2、PCR扩增目标环状RNA序列
[0069] 用上述引物配合如下反应体系：PCR为30y1总体系，具体是2XPCRMIX(Vazyme 公司）15y1，上下游引物（IOmM)各2yI，HEK293细胞DNA模板Iy1 (约50ng)，用灭菌水补 足30yl体系。反应条件为：95°C5min预变性，循环内95°C15s变性，62°C30s退火，72°C 延伸lmin，共30个循环，PCR反应循环后72°C继续延伸7min，然后16°C保存。PCR扩增产 物通过割胶回收、酶切后连接到含有本发明的环状RNA人工过表达框架的载体中，构建人 工过表达MET基因环状RNA载体，命名为PCD-ciR-Met。
[0070] 3、细胞转染
[0071] 将上述过表达载体用lip〇2000转染试剂转染到HEK293细胞中，载体转染浓度 Iyg/ml，转然后培养48小时，检测环状RNA的表达情况。
[0072] 4、荧光定量PCR检测环状RNA的表达
[0073] 根据环状RNA-MET基因（登录号：hsa_circ_0082002)序列设计PCR扩增引物，特 异性检测环状RNA-MET引物序列为：
[0074] MET-F:5'CCAGATTCTGCCGAACCAATG 3'
[0075] MET-R:5'GCTCCTCTGCACCAAGGTAA 3'
[0076] 选取P-actin基因为内参基因，作为荧光定量结果数据的矫正基因，序列如下：
[0077] 0 -actin F:5, GCATGGGTCAGAAGGATTCCT3'
[0078] 0-actin R:5，TCGTCCCAGTTGGTGACGAT3，；
[0079] 具体检测方法如下：
[0080] (1)将转染过表达载体PCD-ciR-Met的细胞严格按照TRIzol? Reagent (Life technologies公司）试剂操作说明书提取细胞中的总RNA;
[0081] 提取详细步骤为：
[0082] ①细胞取100万个左右的细胞，加入1ml trizol。
[0083] ②加入200 y 1氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置15min ;
[0084] ③4°C下，12,OOOg离心15min，溶液分为三层，RNA溶解在水相中，转移水相至另一 个新的RNase free EP管；
[0085] ④加入1倍体积异丙醇，涡旋充分混匀；
[0086] ⑤4°C下，12, OOOg离心lOmin，离心后管底出现RNA沉淀，弃去上清；
[0087] ⑥加入Iml75%乙醇，用手轻轻颠倒，12,OOOg离心5min，弃去上清；
[0088] ⑦室温晾干，加入20ylDEPC水溶解沉淀。
[0089] (2)除去提取的RNA中残留的基因组DNA
[0090] 使用RNase-free的DNaseI(全式金公司），按照说明书配置反应液，37°C消化 30min，加入 0.5ylEDTA，65°C灭活lOmin。
[0091]
[0092] (3)将RNA逆转录成cDNA
[0093] 严格按照逆转录试剂盒（Vazyme公司）操作说明书在PCR管中加入模板RNA、随机 逆转录引物等，总量l〇ul。
[0094]
[0095] 反应条件：25°C5min，42°C20min，85°C5min，4°C2min。
[0096] (4)荧光定量检测环状RNA-MET
[0097] 按照焚光定量反应试剂盒Real-timePCR试剂盒（Vazyme公司）的说明书配置反 应体系；具体检测反应体系如下：
[0098]
[0099] 其中，荧光定量PCR反应条件为：95°C5分钟变性；95°C10秒，60°C35秒（此步骤 收集荧光信号）；40个循环，然后进行融解曲线分析：温度60°C_95°C收集荧光信号。
[0100] 荧光定量结果显示，转染细胞过表达框架载体后，目标环状RNA-MET分子成功检 测出来高表达，相对于未转染组，高表达30多倍（参见图4)。实验证明本发明构建的环状 RNA表达框架可以有效过表达环状RNA。
【主权项】
1. 一种环状RNA人工过表达框架，其具有如SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列。2. 根据权利要求1所述的环状RNA人工过表达框架，其特征在于，包括上游框架序列、 填充序列、下游框架序列、以及环状RNA插入酶切位点。3. 根据权利要求2所述的环状RNA人工过表达框架，其特征在于，所述环状RNA插入酶 切位点包括 NheI、KpnI、BamHI 和 XhoI。4. 根据权利要求2所述的环状RNA人工过表达框架，其特征在于，该环状RNA人工过表 达框架的碱基序列中，第1~492bp为上游框架序列，第493~635bp为填充序列，第636~ 1017bp为下游框架序列，其中，第1~6bp、487~492bp、636~641bp、1012~1017bp依次 为酶切位点 NheI、KpnI、BamHI、XhoI。5. 包括权利要求1所述环状RNA人工过表达框架的表达载体。6. 权利要求1至4任一项所述的环状RNA人工过表达框架的构建方法，该方法包括以 下步骤：设计扩增引物，以人的HEK293细胞的基因组DNA为模板，采用分段PCR扩增，分别 扩增表达框架的上游框架序列、下游框架序列及填充序列，在全长序列两端分别添加NheI、 XhoI酶切位点序列，方便将整个表达框架连接到质粒载体中；在填充序列两端添加KpnI和 BamHI酶切位点序列，用于连接所要研究的目标环状RNA的核苷酸序列。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述扩增引物分为三段，其核苷酸序列如 下： 1) 第一段扩增上游框架引物： Up-F:5' CGCGCTAGCTTCTACATGCGCTCAAGAAAACA3，， Up-R:5' ATGCTCAGCTGGTACCGCCAAAACAGGTTCAA3，； 2) 第二段扩增填充序列引物： stuffer-F ：5r GTTTTGGcGGTACCAGCTGAGCATAGTTCSr , StufTer-Rd' TTTGGCGGATCCACTGTGAACCACTGAA3'; 3) 第三段扩增下游游框架引物： Down-F :5^ TGGTTCACAGTGGATCCGCCAAAACAGGTTCAAG3'， Down-R :5^ GGCCTCGAGAGGAAGTCCAGTTATTAA3'。8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述分段PCR扩增的反应体系如下：第一 轮PCR为20 yl总体系，PCR分别扩增：具体是2XPCR MIX IOy 1，IOmM上下游引物各Iy 1， HEK293细胞DNA模板lyl，用灭菌水补足20yl体系；第一轮反应条件为：95°C 5min预 变性，循环内95°C 30s变性，60°C 30s退火，72°C延伸40s，共35个循环，PCR反应循环后 72°C继续延伸7min，然后20°C保存；第一轮PCR反应完取每个片段的PCR产物I y 1进行第 二轮重叠PCR扩增反应，具体反应体系是50 yl :具体是2XPCR MIX 25 yl，IOmM的Up-F和 Down-R引物各2. 5 y 1，第一轮PCR产物各段产物总共3 y 1，用灭菌水补足50 y 1体系；第二 轮反应条件为：95°C 5min预变性，循环内95°C 30s变性，60°C 30s退火，72°C延伸lmin， 共40个循环，PCR反应循环后72°C继续延伸7min，然后20°C保存。9. 权利要求1所述的环状RNA人工过表达框架应用于人工表达目的基因。10. -种人工表达目的基因的方法，包括：用KpnI和BamHI酶切除环状RNA人工过表 达框架中的填充序列，然后直接将目标基因的核苷酸序列连接到所述环状RNA人工过表达 框架中进行表达，其中所述环状RNA人工过表达框架具有如SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序
【专利摘要】本发明公开了一种环状RNA人工过表达框架，其具有如SEQ？ID？NO.1所述的核苷酸序列。本发明构建的环状RNA人工过表达框架能够有效地过表达环状RNA。
【IPC分类】C12N15/63, C12N15/11, C12N15/66
【公开号】CN105087570
【申请号】CN201510566302
【发明人】张茂雷, 刘明, 李自强, 薛权灿
【申请人】广州吉赛生物科技有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年9月7日