HCT-8/V和KBV200
[0051] 6孔板内提前一天种好待感染的目的细胞株HCT-8/V(人结直肠癌多药耐药细胞） 和KBv200 (人口腔鳞癌多药耐药细胞），细胞感染时细胞汇集率达到40~50 %为宜；感染前 用lmL新鲜培养基换液，用另外lmL新鲜培养基稀释步骤(2)制得的50yL病毒浓缩液，加入2μ L聚凝胺(Polybreen，10mg/mL，最终工作浓度为10yg/mL)混勾后，逐滴均勾滴入六孔板1个 孔内，轻轻晃匀；依据不同细胞株的性质，于感染后6~48h换新鲜培养液;慢病毒介导的基 因会在48~96h期间陆续表达，如果效率不理想可以进行反复感染，被感染表达目的基因的 细胞理论上均为稳定株;核心载体有Puro (噪呤霉素）的筛选标记，可以利用Puromycin进行 稳定株的筛选;筛选之前测定实验所用细胞株Puromycin的全部致死浓度为50yg/mL，用全 部致死浓度对感染后细胞HCT-8/V或KBv200进行筛选；
[0052] (4)稳定感染细胞株的筛选与培养
[0053] 利用50yg/mL的Puromicin对感染后的细胞株HCT-8/V或KBv200进行筛选，筛选持 续20d，对筛选后的细胞进行培养；
[0054] (5)根据所设计的两段sgRNA序列设计鉴定引物，用于对敲除后目的片段进行鉴 定，所设计引物如表2所示：
[0055]表2鉴定引物序列
[0056]
[0057]利用QuickExtract DNA extraction kit对稳定感染细胞株HCT-8/V或KBv200进 行基因组抽提，利用鉴定引物进行PCR鉴定；
[0058] 其中，对于含有lentiCRISPRv2-hABCBl-Sgl的病毒颗粒转染后的细胞株HCT-8/V 或KBv200,其PCR反应体系（50yL)为：10Xbuffer 5yL;dNTP lyL;模板DNA lyL;Detection l-F(10yM)lyL;Detection l-R(10yM)lyL;Pfu高保真酶lyL;ddH20 40yL;PCR反应扩增条 件：95°C初始变性5min; 95°C变性30S，55°C退火30S，72°C延伸2min，35个循环；72°C最后延 伸lOmin;
[0059] 对于含有lentiCRISPRv2-hABCBl-Sg2的病毒颗粒转染后的细胞株HCT-8/V或 KBv200,其PCR反应体系（50yL): 10 X buffer 5yL;dNTP lyL;模板DNA lyL;Detection 2-F (ΙΟμΜ) lyL; Detect ion 2-R( ΙΟμΜ) lyL; Pf u 高保真酶 lyL; ddH20 40yL; PCR 反应扩增条件：95 °(3初始变性5min;95°C变性30S，46°C退火30S，72°C延伸2min，35个循环；72°C最后延伸 10min；
[0060] PCR反应产物跑胶后利用Gel Extraction Kit(OMEGA)进行胶回收，对胶回收产物 进行测序分析，测序结果如图2和3所示。测序结果表明两个编辑组以两种方式发生了突变， 对照组与野生型基因组进行对比没有发生变化。本发明发成功建立了敲除ABCB1基因的细 胞株HCT-8/V sgl;HCT-8/V sg2;KBV200 sgl;KBV200 sg2。
[0061 ]实施例3体外细胞实验对筛选后细胞进行鉴定人基因 ABCB1敲除效果
[0062] (l)western blot
[0063] 利用western blot实验鉴定实施例2中成功敲除ABCB1基因的细胞株HCT-8/V sgl、HCT-8/V sg2、KBV200 sgl和KBV200 sg2的p-gp蛋白表达量，成功转染空载体 lentiCRISPRv2的细胞株HCT-8/V和KBv200作为对照，其中，一抗为Anti-ABCBl (MM SC-13131 ，购自 santa cruze)，二抗为 Anti-mouse IgG，HRP-linked Antibody(货号 7076，cell signaling)，具体方法为常规western blot操作流程。
[0064] 结果如图4所示，在HCT-8/V与KBv200细胞中，转入sgl和sg2的细胞与只转入载体 的细胞p-gp表达量有明显差异，Sgl与Sg2中几乎未表达p-gp蛋白，可作为ABCB1基因被敲除 的证据之一。
[0065] (2)MTT法检测细胞活性
[0066] 选取p-gp的特异性底物Doxorubicin(购自LC)和Vincristine(购自LC)与非特异 性底物cisplatin(购自LC)用MTT法检测检测成功敲除ABCB1基因的细胞株HCT-8/V sgl、 HCT-8/V sg2、KBV200 sgl和KBV200 sg2对上述药物的敏感性。将细胞HCT-8/V sgl、HCT-8/ V sg2、KBV200 sgl和KBV200 sg2及成功转染空载体lentiCRISPRv2的细胞株HCT-8/V和 KBv200对照细胞以每孔3000~5000个细胞的数量接种到96孔板，待细胞贴壁后，分别加入 不同浓度的Doxorubicin(0 · 03、0 · 1、0 · 3、1、3、10、30μΜ)、Vincristine(0 ·03、0 · 1、0 · 3、1、3、 10、30以]\〇和(^8?1&乜11(0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、10(^]\〇。培养7211后，每孔加入1(^1^511^/ mL的MTT再培养4h，然后弃培养液每孔加入100yL的DMS0,用酶标仪在570nm读取每孔的吸光 值。用Bliss法计算半数抑制浓度值(IC50)。
[0067]结果如图5所示，与单独转入载体的对照细胞相比，成功敲除ABCB1基因的细胞株 (HCT-8/V sgl、HCT-8/V sg2、KBV200 sgl和KBV200 sg2)对Doxorubicin和Vincristine的 敏感性增加，IC50值明显降低。而对于p-gp的非特异性底物Cisplatin来说，对照组与成功 敲除ABCB1基因的细胞株对比，IC50值并没有差异。这可作为利用CRISPR-Cas9系统对HCT-8/V与KBv200的ABCB1基因进行敲除成功的证据之一。
[0068] (3)药物积累实验
[0069] p-gp是由基因 ABCB1编码的高度糖基化的跨膜蛋白，它通过消耗ATP而将药物从细 胞内栗出，从而降低肿瘤细胞内的药物浓度。选择两种p-gp的底物：Rh-123 (购自sigma-Aldrich)和Doxorubicin看两种分子在细胞内的积累情况:将细胞HCT-8/V sgl、HCT-8/V sg2、KBV200 sgl和KBV200 sg2及成功转染空载体lentiCRISPRv2的细胞株HCT-8/V和 KBv200对照细胞以每孔2.5X105个的数量接种到6孔板，待细胞贴壁后，分别加入ΙΟμΜ的 Rh_123(Rhodamine 123)和Doxorubicin，培养2h后，PBS润洗3遍，焚光显微镜下拍摄焚光情 况，然后将细胞用胰酶消化，用PBS重悬后用流式细胞分析仪检测荧光强度，然后用Flow jo 软件进行定量分析；
[0070] 结果如图6、7、8所示，两个编辑组（HCT-8/V sgl、HCT-8/V sg2、KBV200 sgl和 KBV200 sg2)与对照组相比荧光强度明显增多，证明编辑组细胞的p-gp没有发挥功能将两 种药物栗出细胞。而对照组的p-pg能正常的发挥药栗功能，因此荧光强度较低。表明两个编 辑组ABCB1基因被成功敲除。
[0071] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种特异靶向人ABCB1基因的sgRNA导向序列，其特征在于:所述的特异靶向人ABCB1 基因的sgRNA导向序列为Sgl或Sg2;其核苷酸序列分别为： Sgl:5 '-TTGGACTGTCAGCTGCTGTC-3 '； Sg2:5 '-GACTGTCAGCTGCTGTCGTC-3 '。2. -种利用CRISPR-Cas9系统敲除人ABCB1基因的方法，其特征在于包含如下步骤： (1) 在权利要求1中所述的SgRNA导向序列的5 '端加上CACCG得到正向寡核苷酸；同时根 据导向序列获得其对应的DNA互补链，并且在其5'端加上AAAC得到反向寡核苷酸;分别合成 上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性，退火，形 成双链； (2) 将步骤(1)制得的双链与Cas9载体连接，得到重组敲除表达载体； (3) 将步骤(2)制得的重组敲除表达载体与包装系统共转染包装细胞，然后收获病毒纯 化并浓缩，得到病毒颗粒； (4) 将步骤(3)制得的病毒颗粒感染细胞，筛选稳转细胞，得到成功敲除ABCB1基因的细 胞。3. 根据权利要求2所述的利用CRISPR-Cas9系统敲除人ABCB1基因的方法，其特征在于： 步骤(2)中所述的Cas9载体为lentiCRISPRv2载体。4. 根据权利要求2所述的利用CRISPR-Cas9系统敲除人ABCB1基因的方法，其特征在于： 步骤(3)中所述的包装细胞为293T细胞。5. 根据权利要求2所述的利用CRISPR-Cas9系统敲除人ABCB1基因的方法，其特征在于： 步骤(3)中所述的包装系统中的包装载体为pMD2.G和psPAX2。6. 根据权利要求2所述的利用CRISPR-Cas9系统敲除人ABCB1基因的方法，其特征在于： 步骤(4)中所述的细胞为肿瘤多药耐药性细胞。7. 根据权利要求6所述的利用CRISPR-Cas9系统敲除人ABCB1基因的方法，其特征在于： 步骤(4)中所述的细胞为HCT-8/V或KBv200。8. 权利要求1所述的特异靶向人ABCB1基因的sgRNA导向序列在制备抗肿瘤多药耐药性 药物中的应用。9. 根据权利要求8所述的特异靶向人ABCB1基因的sgRNA导向序列在制备抗肿瘤多药耐 药性药物中的应用，其特征在于： 所述的肿瘤为人口腔鳞癌或人结直肠癌。
【专利摘要】本发明属于基因工程应用领域，具体涉及一种特异靶向人ABCB1基因的sgRNA导向序列及应用。所述的特异靶向人ABCB1基因的sgRNA导向序列，为Sg1或Sg2；其核苷酸序列分别为：Sg1:5ˊ-TTGGACTGTCAGCTGCTGTC-3ˊ；Sg2:5ˊ-GACTGTCAGCTGCTGTCGTC-3ˊ。本发明根据sgRNA导向序列设计合成两条单链oligo序列，退火形成双链，然后与Cas9载体连接，利用Cas9载体将sgRNA以及CRISPR系统引入目标细胞中，Cas9蛋白会在sgRNA的引导下找到与其匹配的DNA序列，进行剪切，实现基因ABCB1的敲除。
【IPC分类】C12N15/113, C12N15/867, A61P35/00, A61K31/7088
【公开号】CN105441451
【申请号】CN201511033609
【发明人】石智, 杨阳, 邱建阁, 张文姬, 蒋起韦, 覃武明, 陈耀, 郑迪威, 魏梦宁
【申请人】暨南大学
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月31日