端DNA片段；
[0064] 步骤d:将所述平末端DNA片段进行3 '端加 A，得到3 '端加 A的DNA片段；
[0065] 步骤e:将所述3 '端加 A的DNA片段加接头，得到加接头DNA片段;和
[0066] 步骤f:将所述加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物。
[0067] 此外，在另一个方面中，本发明提供一种测序方法(本发明的测序方法），其中，W 采用本发明的构建方法构建的二代测序文库作为对象进行测序。
[0068] 除了 W采用本发明的构建方法构建的二代测序文库作为对象之外，本发明的测序 方法可W采用本技术领域的常规方法来进行。优选地，本发明的测序方法可W利用例如 Illumina平台（例如HiSeq 2500或化xtSeq 500)进行。
[0069] 实施例
[0070] W下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的 具体实施例仅用W解释本发明，并不用于限定本发明。
[0071] 实施例1使用本发明的提取方法提取葡萄果实的基因组DNA
[0072] 1.提取流程
[0073] (1)取葡萄组织4份，每份lOOmg，编号为1、2、3、4,分别加入液氮充分研磨。取编号1 和编号2的样本，分别进行如下操作：
[0074] (2)将研磨好的组织迅速转入到预先装有7(K)yL65°C预热的裂解液中，充分混匀， 将离屯、管置于65°C水浴锅中40分钟。
[0075] 裂解液的组分如表1所示，
[0076] 表 1
[0077]
[0078] (3)加入等体积的氯仿异戊醇(24:1)，充分混匀后12,000rpm离屯、10分钟。
[0079] (4)将步骤(3)得到的上清液小屯、的转移到新的离屯、管中。
[0080] (5)加入RNA酶至终浓度为60yg/mL，室溫消化10分钟；
[0081 ] (6)加入蛋白酶K至终浓度为12化g/mL，37°C消化30分钟；
[0082] (7)加入等体积的酪氯仿异戊醇(25:24:1 )，充分混匀后12，000巧m(~13，400 X g) 离屯、10分钟。
[0083] (8)将步骤(7)得到的上清液小屯、的转移到新的离屯、管中。
[0084] (9)加入0.8倍体积的预冷异丙醇。
[0085] (10) -20°C 放置 30 分钟，12，000巧m 离屯、15 分钟。
[0086] (11)小屯、用枪头挑出DNA沉淀，加入500μΙ 1M NaCl，必要时56°C助溶。离屯、1分钟。
[0087] (12)向上述溶液中加入1倍体积异丙醇，混匀，-20°C沉淀30分钟；12，00化pm(~ 13,400Xg)离屯、15 分钟。
[008引 （13)去上清，加入500化预冷的70%乙醇，12，000巧m(~13,400 Xg)离屯、2分钟，弃 上清。
[0089] (14)重复步骤(13)。
[0090] (15)去上清，加入5(K)yL预冷的无水乙醇，12,00化pm离屯、5分钟，弃上清。
[0091] (16)室溫放置5分钟W彻底惊干残余的乙醇。
[0092] (17)加入40化的TE Buffer溶解。
[0093] 2提取结果
[0094] (1)检测方法
[00M]纯度检测:凯奥K5500微量分光光度计；
[0096] 浓度检测:如bit巧光光度计；
[0097] 完整性检测:琼脂糖凝胶电泳(胶浓度1%、电压120V、时间30分钟）。
[0098] (2)检测结果
[0099] 表 2
[0100]
[0101]
[0102] 电泳图谱如图1所不，图1编号与表2编号对应的样本编号一致，Ml : λ-Hind皿 digest Marker(分子量标准），每个样品用量lOOng/孔。
[0103] 对比例1使用现有技术的提取方法提取葡萄果实的基因组DNA
[0104] 1.提取流程
[0105] 取编号为3和4的样本分别进行下述操作，
[0106] (1)将葡萄组织样本迅速转入到预先装有7(K)yL65°C预热的裂解液中，充分混匀， 将离屯、管置于65°C水浴锅中40分钟。
[0107] 裂解液的组分如表3所示，
[010引表3
[0109]
[0110] (2)待冷至室溫25°C后，加入等体积的氯仿异戊醇（24:1)，充分混匀后12,000巧m 离屯、10分钟。
[0111] (3)将上清液小屯、的转移到新的离屯、管中。
[0112] (4)加入0.8倍体积的预冷异丙醇。
[0113] (5) -20°C 放置 30 分钟，12，000巧m 离屯、15 分钟。
[0114] (6)小屯、用枪头挑出DNA沉淀，加入500μΙ 1M NaCl，必要时56°C助溶。
[0115] (7)向上述溶液中加入2倍体积异丙醇，混匀，-20°C沉淀30分钟；12，00化pm离屯、15 分钟。
[0116] (8)去上清，加入50化L预冷的70 %乙醇，12，00化pm离屯、2分钟，弃上清。
[0117] (9)重复步骤(8)。
[011引 （10)去上清，加入50化L预冷的无水乙醇，12,00化pm离屯、5分钟，弃上清。
[0119] (11)室溫放置5分钟W彻底惊干残余的乙醇。
[0120] (12)加入40化的TE Buffer溶解。
[0121] 2.提取结果
[0122] (1)检测方法
[0123] 同实施例1中的检测方法。
[0124] (2)检测结果 [01巧]表4
[0126]
[0127] 电泳图谱如图2所示，图2编号与表4编号对应的样本编号一致，Ml: λ-Hind皿 digest Marker(分子量标准），每个样品用量lOOng/孔。
[012引对照实施例1和对比例1的提取结果，可W看出实施例1的基因组DNA质量明显优于 对照方法，具体表现在W下方面：（1)提取得到的DNA总量高，提取样本1和样本2得到的基因 组DNA总量均达到化gW上，符合后续的文库制备要求和测序要求；（2)提取得到的基因组 DNA完整性好，无明显降解，在文库制备环节可获得质量较好的文库；（3)DNA纯度高，0D260/ 230和0D260/280数据表明，蛋白污染和RNA污染均较少。
[0129]上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局 限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和 环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改 动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附 权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 一种葡萄果实的基因组DNA的提取方法，包括如下步骤： 步骤A:将样本置于液氮中进行研磨，得到研磨样本； 步骤B:将所述研磨样本置于裂解液中进行裂解，得到裂解产物； 步骤C:将所述裂解产物置于第一提取液中进行抽提，得到第一抽提产物； 步骤D:将所述第一抽提产物进行RNA酶消化，得到RNA酶消化产物； 步骤E:将所述RNA酶消化产物进行蛋白酶K消化，得到蛋白酶K消化产物； 步骤F:将所述蛋白酶K消化产物置于第二提取液中进行抽提，得到第二抽提产物； 步骤G:将所述第二抽提产物中置于异丙醇中进行沉淀， 其中， 所述第一提取液由氯仿和异戊醇组成，所述氯仿和异戊醇的体积比为24:1; 所述第二提取液由Tris饱和苯酚、氯仿和异戊醇组成，所述Tris饱和苯酚、氯仿和异戊 醇的体积比为25:24:1。2. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述裂解液的组分为：2%的CTAB、pH 为8的lOOmM的Tris-HCl缓冲液、1.4M的NaCl溶液、20mM的EDTA、4%的PVP、0.5体积％的0_巯 基乙醇。3. 根据权利要求1或2任一项所述的提取方法，其特征在于，所述步骤G后还包括步骤Ο-?: 将目标基因组 DNA 进行纯化。4. 根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述步骤C、步骤F和/或步骤G后还包 括步骤Η:将所述步骤C、步骤F和/或步骤G的产物进行离心。5. 根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，所述葡萄果实为新鲜果实。6. -种果实的基因组DNA的提取试剂盒，其特征在于，包括样本裂解试剂，第一提取试 剂，第二提取试剂，助沉试剂和纯化试剂，其中，所述样本裂解试剂包括CTAB、Tri s-HCl溶 液、NaCl、EDTA、PVP、β-巯基乙醇，所述第一提取试剂包括氯仿和异戊醇，所述第二提取试剂 包括Tris饱和苯酚、氯仿和异戊醇。7. -种权利要求1-5任一项所述提取方法或权利要求6所述提取试剂盒在提取葡萄果 实基因组DNA中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述葡萄果实为新鲜果实。9. 一种用于二代测序的果实DNA文库构建方法，包括如下步骤： 步骤a:采用权利要求1-5任一项所述提取方法提取得到葡萄果实的基因组DNA; 步骤b:将所述葡萄果实的基因组DNA打断到希望进行测序的长度，得到希望进行测序 的DNA片段； 步骤c:将希望进行测序的DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段； 步骤d:将所述平末端DNA片段进行3 '端加 A，得到3 '端加 A的DNA片段； 步骤e:将所述3 '端加 A的DNA片段加接头，得到加接头DNA片段;和 步骤f:将所述加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物。
【专利摘要】本发明涉及一种高质量的果实的基因组DNA的提取方法，属于分子生物领域。本发明提供的提取方法包括对葡萄果实的液氮研磨、DNA抽提、沉淀杂质以及DNA的纯化。采用本发明提供的提取方法能够有效的去除葡萄果实样本中富含的多糖、多酚等次生代谢产物，从而获得高质量的葡萄果实基因组DNA。本发明提供的提取方法主要应用于基因检测领域。
【IPC分类】C40B50/06, C12N15/10, C12Q1/68
【公开号】CN105505917
【申请号】CN201511021563
【发明人】魏少华, 童育, 玄兆伶, 李大为, 梁峻彬, 陈重建
【申请人】安诺优达基因科技(北京)有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月31日