而序列2和序列4能够有效祀向CMAH基因产生切割，因此检测到小片段的存在，表明 序列2和序列4能够作为CRISPR-化s9特异性敲除猪CMAH基因的祀序列。
[0202] 实施例五、CMAH基因敲除单克隆的挑选和鉴定
[0203] 1.单克隆的挑选（基于序列2的祀序列）
[0204] (1)将部分感染的目的细胞群进行传化取100个单细胞转移至10cm dish培养。 [020引 似培养约10天后，有相当数量的单克隆生长到肉眼可见的水平。
[0206] (3)用移液器头刮取独立的克隆，将细胞转移至24孔板中培养，每个孔对应一个 克隆。
[0207] (4)再经过约一周的培养后，有部分克隆长至足够的数量，准备做进一步的鉴定。 [020引 2.鉴定单克隆的CMAH敲除情况
[0209] (1)收集待检的单克隆及野生型细胞，分别抽提基因组DNA。
[0210] (2)按照前述方法，分别扩增单克隆及野生型细胞的CMAH基因片段，所扩增的基 因片段包含sgRNA祀序列。
[02·Μ] (3)将等量的单克隆PCR片段与野生型PCR片段混合，加热变性、复性，形成杂交 DNA分子。
[021引 （4)用化uiser酶切割退火后的杂交DNA，45°C解育20min。
[0213] (5)电泳检测酶切产物，根据是否有切割片段确定单克隆是否发生有效突变（图 6) 〇
[0214] (6)将有效突变的单克隆的PCR片段进一步测序，确定祀序列附近的突变情况。鉴 定敲除CMAH基因的单克隆（图7)。 邮1引图6所示的结果显示，基于序列2所示的祀序列的lentiCRISPR V2-CMAH假型慢 病毒感染目的细胞，从100个单细胞中随机挑选的7个单克隆经化uiser酶酶切电泳检测， 其中有6个单克隆（即1、2、3、4、6、7号单克隆）能检测到切割小片段，表明基因敲除发生， 基因敲除效率能够达到80% W上，说明序列2所示的祀序列具有很高的祀向敲除CMAH基因 的作用。
[021引图7示出了对图6中的3号和7号单细胞克隆的PCR片段进一步测序，确定切割 位点附近的突变情况，其中图7A为3号单细胞克隆的PCR片段的测序结果，后半部分有双 峰现象，分析其包含一种缺失突变（图7C中的B1序列）和部分野生型，运说明发生了祀向 敲除CMAH基因的情况，野生型的存在可能是基因组中两条染色体上的其中一个等位基因 没有发生祀向敲除或者部分野生型细胞没有发生突变，然而缺失突变的存在可W明确地说 明成功地祀向敲除CMH基因。
[0217] 图7B为7号单细胞克隆的PCR片段的测序结果，后半部分有双峰现象，经分析包 含两种突变：一种为插入突变（在图7C中命名为D4-1)，一种为缺失突变（在图7C中命名 为D4-2)，表明CMH基因发生祀向敲除，两种不同的突变类型可能是在挑取单克隆的时候 还没有发生基因修复作用，后来分裂后的细胞分别修复成不同的突变类型，或者两条染色 体上的等位基因均发生敲除作用后修复成不同的基因型。总之，插入突变和缺失突变的存 在表明CMAH基因发生祀向敲除作用。
[021引 W上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发 明的具体实施只局限于运些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可W做出若干简单推演或替换。
【主权项】
1. 在运用CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因中用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA， 其特征在于： (1)所述sgRNA在CMAH基因上的靶序列符合5' -N(20)NGG-3'的序列排列规则，其中 N(20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G，符合所述规则的靶序列位于 正义链或反义链； (2 )所述sgRNA在CMAH基因上的靶序列位于CMAH基因的N端的5个外显子编码区，或 靶序列的一部分位于CMAH基因的N端的5个外显子，其余部分跨越与相邻内含子的交界， 位于相邻内含子； (3)所述sgRNA在CMAH基因上的靶序列是唯一的。2. 根据权利要求1所述的用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA，其特征在于，所述靶序 列为序列表中SEQ ID NO :1~61中任一条序列所示的序列。3. 根据权利要求1所述的用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA，其特征在于，所述靶序 列为序列表中SEQ ID NO :2或4所不的序列。4. 运用CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下 步骤： (1) 在权利要求1-3任一项所述的sgRNA的靶序列的5' -端加上用于形成粘性末端的 序列，合成得到正向寡核苷酸序列；在权利要求1-3任一项所述的sgRNA的靶序列对应的互 补序列的两端加上合适的用于形成粘性末端的序列，合成得到反向寡核苷酸序列；将合成 的所述正向寡核苷酸序列与反向寡核苷酸序列退火、复性，形成具有粘性末端的双链寡聚 核苷酸； (2) 将所述双链寡聚核苷酸连入线性化的携带Cas9基因的表达载体，得到携带含相应 靶序列的sgRNA寡聚核苷酸和Cas9基因的表达载体，转化感受态细菌，筛选鉴定出正确的 阳性克隆，并对所述阳性克隆摇菌、提取质粒； (3) 用所述携带有sgRNA寡聚核苷酸和Cas9基因的表达载体、包装质粒和包装细胞系 包装出同时携带靶向CMAH基因的sgRNA和Cas9的假型慢病毒； (4) 使用所述假型慢病毒感染目的细胞，并进一步培养；然后收集被感染的目的细胞， 以其基因组DNA为模板扩增包含所述靶序列的基因片段，经过变性、复性及酶切，确定CMAH 基因的敲除情况。5. 根据权利要求4所述的CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法，其特征在于， 所述表达载体为序列表中SEQ ID NO :62所示序列的载体。6. 根据权利要求4或5所述的CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法，其特征在 于，所述方法包括如下步骤： (1) 在权利要求1-3任一项所述的sgRNA的靶序列的5' -端加上CACCG序列，合成得 到正向寡核苷酸序列；在权利要求1-3任一项所述的sgRNA的靶序列对应的互补序列的 5' -端加上AAAC序列、3' -端加上C，合成得到反向寡核苷酸序列；将合成的所述正向寡核 苷酸序列与反向寡核苷酸序列退火、复性，形成具有粘性末端的双链寡聚核苷酸； (2) 将所述双链寡聚核苷酸连入如序列表中SEQ ID NO :62所示序列的表达载体 lentiCRISPR v2经BsmB I限制性内切酶酶切得到的线性化载体，得到携带sgRNA寡聚核苷 酸的重组表达载体lentiCRISPR V2-CMAH，转化感受态细菌，筛选鉴定出正确的阳性克隆， 并对所述阳性克隆摇菌、提取质粒； (3) 用所述表达载体lentiCRISPR V2-CMAH、包装质粒和包装细胞系包装出同时携带靶 向CMAH基因的sgRNA和Cas9的假型慢病毒； (4) 使用所述假型慢病毒感染目的细胞，并进一步培养；然后收集被感染的目的细胞， 以其基因组DNA为模板扩增包含所述靶序列的基因片段，经过变性、复性及酶切，确定CMAH 基因的敲除情况。7. 根据权利要求6所述的CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法，其特征在于， 所述包装质粒为质粒PLP1、质粒pLP2和质粒pLP/VSVG ;所述包装细胞系为HEK293T细胞。8. 根据权利要求6所述的CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法，其特征在于， 所述目的细胞为猪PIEC细胞； 所述以其基因组DNA为模板扩增包含所述靶序列的基因片段，经过变性、复性及酶切， 确定CMAH基因的敲除情况，具体为： (a) 以感染病毒的目的细胞的基因组DNA为模板，用CMAH基因的上下游引物扩增包含 所述sgRNA的靶序列的CMAH基因片段，同时用相同引物扩增未感染病毒的野生型细胞的基 因组DNA ; (b) 纯化上述扩增到的CMAH基因片段，然后将来自感染病毒的目的细胞的CMAH基因片 段与来自野生型细胞的CMAH基因片段等量混合、加热变性、复性，形成杂交DNA分子； (c) 用Cruiser酶切割复性后的杂交DNA分子； (d) 电泳检测酶切产物，检测靶序列介导的CMAH基因敲除效果。9. 在CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法中用到的重组表达载体 lentiCRISPR V2-CMAH，其特征在于，所述重组表达载体的骨架载体的序列如序列表中SEQ ID NO :62所示；所携带的靶序列如权利要求1-3任一项所述的sgRNA的靶序列，优选序列 表中SEQ ID NO :2或4所示的靶序列。10. 如权利要求1-3任一项所述的SgRNA或权利要求9所述的重组表达载体 lentiCRISPR V2-CMAH在CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法中的用途。
【专利摘要】本发明公开了一种运用CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法及用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA。本发明的特异性靶向CMAH基因的sgRNA在CMAH基因上的靶序列符合5’-N(20)NGG-3’的序列排列规则，其中N(20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G；在CMAH基因上的靶序列位于CMAH基因的N端的5个外显子编码区或与相邻内含子的交界处；在CMAH基因上的靶序列是唯一的。本发明的sgRNA用于CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法中，能够快速、精确、高效、特异性地敲除猪CMAH基因，有效地解决构建CMAH基因敲除猪周期长和成本高的问题。
【IPC分类】C12N15/11, C12N15/867
【公开号】CN105518135
【申请号】CN201580000479
【发明人】蔡志明, 牟丽莎, 谢崇伟, 高汉超, 刘璐, 陈鹏飞, 张军方, 陆赢
【申请人】深圳市第二人民医院
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年6月12日