38°C的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为 20min，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。
[0025] 对本发明的实时荧光RPA(real-time RPA)试剂盒的检测灵敏度及特异性进行了 实验，灵敏度试验结果表明使用该试剂盒检测羊痘病毒的敏感性为1〇2拷贝/反应，并且具 有较广的检测范围，至少在1〇 7-1〇2范围内的样品均能被检测出来。特异性检测结果表明，使 用该试剂盒分别检测绵羊痘病毒、山羊痘病毒、羊口疮病毒、小反刍兽疫病毒以及口蹄疫病 毒，结果只有绵羊痘病毒和山羊痘病毒能够很好的进行扩增，其他病毒均不能扩增，因此， 说明该试剂盒具有很好的特异性。随后我们用绵羊痘病毒混合组织样品(n = 24)进一步验 证了该试剂盒的检测准确性，试验数据表明：其与qPCR检测结果完全一致，所有样品均为阳 性。
[0026] 因此，进一步的，本发明还提出了以上所述的实时荧光RPA检测试剂盒在制备检测 羊痘病毒试剂中的用途，所述羊痘病毒为绵羊痘病毒或山羊痘病毒。
[0027] 本发明还提出了一种用于快速检测羊痘病毒的试纸条RPA(LFS RPA)检测试剂盒， 含有侧流层析试纸条(Hybridetect 2T，Milenia Biotec GmbH,Germany)，以及有一对引物 和一条探针，
[0028] 其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：
[0029] 上游引物：5'-CGTGTTGGTGTTTCCTTTTAATTTATACAATAGTA-3'（SEQ ID N0.1 所示）
[0030] 下游引物：5'-biotin-CAATAGCATGTCATTTATAACATTGATGAGTATTG-3'（SEQIDN0·2 所示）
[0031 ]探针：5 ' -FAM-AACAATGGAGTTTGGGAGATTGTTTGTGTA
[0032] -THF-ATTCAAAGCTATGTTTT-P-3，（SEQ ID 恥.4所示）。
[0033] 其中，biotin表示生物素，FAM表示羧基焚光素，THF表示四氢咲喃连接子，P表示磷 酸，用于阻止链的延伸。
[0034] 在本发明所述的试纸条RPA检测试剂盒中，优选的，所述试剂盒中还包括水解缓冲 液，醋酸镁以及ddH20。
[0035] 使用本发明所述的试纸条RPA检测试剂盒检测羊痘病毒，优选的，反应体系如下： 14.75yL的水解缓冲液，1.05yL的ΙΟμΜ上游引物，1.05yL的ΙΟμΜ下游引物，0.3yL的ΙΟμΜ探 针，2yL的病毒DNA模板，4.6yL的ddH 20以及1.25yL的280mM醋酸镁；
[0036] 扩增反应在温度设定为37-39°C的水浴锅中进行，反应时间为15min-30min，结束 后使用侧流层析试纸条(Hybridetect 2T，Milenia Biotec GmbH,Germany)对结果进行检 测。
[0037]更优选的，扩增反应在温度设定为38°C的水浴锅中进行，反应时间为20min，结束 后使用侧流层析试纸条对结果进行检测。
[0038]对本发明的试纸条RPA(LFS RPA)试剂盒的检测灵敏度及特异性进行了实验，灵敏 度试验结果表明使用该试剂盒检测羊痘病毒的敏感性为1〇2拷贝/反应，并且具有较广的检 测范围，至少在1〇 7-1〇2范围内的样品均能被检测出来。特异性检测结果表明，使用该试剂盒 分别检测绵羊痘病毒、山羊痘病毒、羊口疮病毒、小反刍兽疫病毒以及口蹄疫病毒，结果只 有绵羊痘病毒和山羊痘病毒能够很好的进行扩增，其他病毒均不能扩增，因此，说明该试剂 盒具有很好的特异性。随后我们用羊痘病毒混合组织样品（n = 19)进一步验证了该试剂盒 的检测准确性，试验数据表明：其与qPCR检测结果完全一致，所有样品均为阳性。
[0039] 因此，进一步的，本发明还提出了所述的试纸条RPA检测试剂盒在制备检测羊痘病 毒试剂中的用途，所述羊痘病毒为绵羊痘病毒或山羊痘病毒。
[0040] 相较于现有技术，本发明的方法具有以下优点：
[0041 ] (1)能够节约试验时间：RPA整个试验过程只需要20min，该时间远远低于qPCR的 1.5小时以及LAMP的60min。加上样品处理以及准备试验的时间，RPA整个检测过程能够在一 个小时之内完成。
[0042] (2)能够降低反应温度:RPA只需要恒温38°C即可完成试验，该温度远远低于qPCR 的60 °C -95 °C 以及LAMP的63 °C。
[0043] (3)方法更加简单、便于携带：扩增所需的酶和一些其他必要的东西已经冻干保 存，能够在常温下长时间放置，扩增时只需要加入水解缓冲液、引物、探针和模板，并加入镁 离子起始反应即可，不需要熟练的试验人员。
[0044] (4)特异性强：因该试验中添加了探针，增加了该方法特异性，基于荧光试剂的 LAMP方法因为没有探针，特异性相对较差。
[0045] (5)更加不易于污染:该试验中添加了核酸外切酶III，对扩增产物进行切割，因此 降低了产物污染的可能性，qPCR没有添加切割产物的酶，LAMP需要跑核酸电泳胶，因此，均 有污染的可能性。
[0046] (6)检测结果真实可靠:与现有的qPCR有很高的符合度。
【附图说明】
[0047]图1(A)为将合成的针对羊痘病毒引物和探针的标准品质粒进行十倍倍比稀释，稀 释范围为lOtlO1拷贝，随后用Real-time RPA方法进行敏感性检测，如图所示为扩增20min 后实时荧光定量PCR仪的结果。此图可看出本发明所设计的引物和探针可以在38°C条件下， 很好的检测1〇7-1〇 2拷贝的模板，其中NC代表阴性对照；
[0048]图 1(B)为利用PRISM 5.0软件（GraphPad Software,USA)对Real-time RPA方法的 可重复性进行验证，阈值为平均值土标准方差(SD)，该试验进行过6次重复性试验；
[0049]图1(C)为对Real-time RPA方法的6次重复性结果进行退行性分析，我们用三角符 号标出95%可能性的检测限制；
[0050] 图2为比较绵羊痘病毒混合组织样品（n = 24)的Real-time RPA和qPCR检测结果， 用excel软件来进行退行性分析，其中Y轴为RPA的时间阈值，X轴为qPCR循环数阈值；
[0051] 图3为确定LFS RPA方法的最佳反应温度和最佳反应时间，由图可以看出LFS RPA 方法能够在较宽的温度范围内起作用，（A)为将反应时间设定为30min，将反应温度分别设 定为 15°C、20°C、25°C、30 °C、35 °C、38°C、40°C、45°C、50°C 的试验结果；（B)为将反应温度设 定为38°C，反应时间分别设定为〇111；[11、1111；[11、5111；[11、10111；[11、15111；[11、20111；[11、25111；[11、30111；[11的试验 结果；
[0052] 图4(A)为检测LFS RPA方法的敏感性，我们将合成的标准品质粒进行定量，并以十 倍倍比稀释的方式稀释出浓度为1(^-101的质粒DNA作为模板进行试验，试验条件为上述的 最佳试验条件(38°C，20min)，试验结果如图所示，NC代表阴性对照；（B)为检测LFS RPA方法 的特异性，我们分别用绵羊痘病毒、山羊痘病毒、羊口疮病毒、小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒 提取的DNA/RNA作为模板进行试验，试验结果如图所示，Negative control代表阴性对照。
【具体实施方式】
[0053]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0054]实施例1快速检测羊痘病毒的实时荧光RPA(Real-time RPA)检测试剂盒及检测方 法的建立
[0055] 1、引物及探针序列的设计及制备
[0056] 本发明发明人通过对来自于GenBank中的X74443，L39878，EU267274，EU267273， AJ849636，FJ905304，AY560591和AJ563705的GPCR基因同源序列进行比对分析，确定了羊痘 病毒GPCR基因的保守区域，针对该区域设计了引物和探针，以期能够检测到尽可能多的羊 痘病毒。所有的引物和探针都由生工生物(上海，中国）合成。本发明分别设计合成了三对上 游引物、三对下游引物以及一条探针序列，如下表1所示。
[0057] 表1、本发明设计的羊痘病毒Real-time RPA引物和探针
[0058]
[0060] 2.毒株、细胞以及临床样品
[0061] 本研究中使用的所有的毒株均由本实验室保存:GPV AV40，SPV Gulang2009，PPRV Nigeria 75/1，ORFV/Vaccine/CHA，以及口蹄疫病毒（FMDV type A/CHA/2009;FMDV/0/CHA; FMDV/Asia 1 /CHA)。绵羊痘病毒混合组织样品(η = 24)是由羊的心、脾、肺、肾、淋巴结以及皮 肤以1:10的比例制成组织悬液并混合SPPV阳性样品，临床疑似样品（n = 23)来自于甘肃省 临洮，RT-qPCR确认的阴性样品(η = 5)来自于健康羊组织。Vero细胞由本实验室保存，用含 有8 %血清的DMEM培养基在37 °C，5 % C02条件下培养。
[0062] 3.病毒基因组提取
[0063]使用高纯度的病毒核酸提取方法(Roche)按照说明书来来提取病毒DNA/RNA，并最 终用50yL的无 RNas e水洗脱。提取的DNA/RNA存放到-80 °C冰箱中以待随后的使用。
[0064] 4.产生质粒DNA标准品
[0065]