C，我们选择38°C作为该试验的反应温度。
[0104] 随后，我们测试了38°C条件下，不同孵育时间对于扩增结果的影响，我们试验了 〇111；[11、1111；[11、5111；[11、10111；[11、15111；[11、20111；[11、25111；[11、30111；[11的试验结果，如图313所不，在扩增10111；[11 的时候，试验条带上出现微弱的条带，当反应时间在15min-30min之间时试验条带没有出 现可观测的差异，因此，我们选择20min作为该试验的孵育时间。
[0105] 我们以提取纯化的病毒DNA/RNA或者标准DNA质粒为模板进行扩增，实验体系如 下：14.75yL水解缓冲液（rehydration buffer，TwistDx exo Kit,Cambridge,United Kingdom)，1 · 05yL上游引物（ΙΟμΜ)，1 · 05yL下游引物（ΙΟμΜ)，0 · 3yL的RPA exo探针（ΙΟμΜ)，2 yL的DNA/RNA模板，4· 6yL的ddH20以及 1 · 25yL的醋酸镁(magnesium acetate，280mM) 〇
[0106] 上游引物：5'-CGTGTTGGTGTTTCCTTTTAATTTATACAATAGTA-3'（SEQ ID N0.1 所示）
[0107] 下游引物：5'-biotin-CAATAGCATGTCATTTATAACATTGATGAGTATTG-3'（SEQIDN0·2 所示）
[0108] 探针：5 ' -FAM-AACAATGGAGTTTGGGAGATTGTTTGTGTA
[0109] -THF-ATTCAAAGCTATGTTTT-P-3，（SEQ ID 恥.4所示）。
[0110]扩增反应在温度设定为38 °C的水浴锅中进行，反应时间为20min，结束后使用侧流 层析试纸条对结果进行检测。同时我们用该体系对设计合成的三对上游引物、三对下游引 物与探针组合进行评价，评价结果表明其中一对(Fn2/Rn2)引物与探针组合能够产生最强 的扩增信号，因此，该引物对与探针进行组合应用到本发明中。
[0111 ]检测结果判定:一个样品在特定的条件下（38°C，20min)试纸条上控制线为阳性， 并且试验线为阳性的样品为阳性样品；试纸条上控制线为阳性，而试验线为阴性的样品为 阴性样品。
[0112] 6、反应灵敏度检测
[0113] 在进行LFS RPA方法的灵敏度检测时，按照上述体系加入反应物。使用模板为上述 合成的标准质粒，通过核酸测定仪测定浓度计算出拷贝数，分别稀释出浓度梯度为lOtlO 1 拷贝共计7个梯度作为模板。扩增反应在温度设为38 °C的水浴锅中进行，时间设定为20min， 通过试纸条终点检测扩增结果。结果表明该方法的敏感性为1〇2拷贝/反应，并且具有较广 的检测范围，至少在1〇 7-1〇2范围内的样品均能被检测出来，如图4A所示。随后，我们用绵羊 痘病毒混合组织样品（n = 24)来进一步检测该方法的敏感性，结果表明，qPCR检测结果与 LFS RPA检测结果完全一致，所有样品均为阳性。因此，说明该方法具有很好的敏感性。
[0114] 7、反应特异性检测
[0115] 在进行LFS RPA的反应特异性的检测时，按照上述体系加入反应物。使用模板分 别为绵羊痘病毒(SPV)、山羊痘病毒(GPV)、羊口疮病毒(0RFV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、口 蹄疫病毒(FMDV)。反应温度设为38 °C的水浴锅中进行，反应时间设定为20min。结果表明，只 有绵羊痘病毒和山羊痘病毒能够很好的进行扩增，其他病毒均不能扩增，因此，该方法具有 很好的特异性，结果如下表5所示。
[0116] 表5评估LFS RPA试验的特异性
[0117]
[0118] neg:代表阴性;pos:代表阳性。
[0119] 8、LFS RPA方法检测临床样品
[0120] 我们用LFS RPA方法测试qPCR确认的6份阳性样品和6份阴性样品，LFS RPA试验结 果表明：qPCR确认的6份阳性样品均为阳性，qPCR确认的6份阴性样品均为阴性。
[0121 ] qPCR检测方法参照文献(Bal insky，C. A. ，et al.,Rapid preclinical detection of sheeppox virus by a real-time PCR assay.J Clin Microbiol,2008.46(2):p.438-42.)中的方法进行。
[0122] 我们用建立的LFS RPA方法来检测采集自甘肃省的临床样品(n = 23)以及健康羊 的组织样品(n = 5)，并将检测结果与qPCR的检测结果相比较。结果表明5份健康羊的组织样 品LFS RPA检测结果和qPCR检测结果一致，均都为阴性。在23份临床样品中，LFS RPA检测结 果为6份阳性样品，而qPCR检测结果为7份临床样品为阳性(CT值为15-29,其中6份阳性样品 与LFS RPA检测的6份阳性样品一致）。基于检测的28份样品，与qPCR检测结果相比较，LFS RPA的敏感性和特异性分别为96%和100%，结果如下表6所示。
[0123] 表6分别比较LFS RPA试验和qPCR试验临床样品检测结果
[0124]
[0125] 综上可见，本发明设计合成的一对引物和一条探针基因序列以及其形成的试纸条 RPA(LFS RPA)方法可以快速诊断绵羊痘病毒以及山羊痘病毒，而且该检测方法简单、快速、 检测结果真实可靠。
【主权项】
1. 一种用于快速检测羊痘病毒的实时荧光RPA检测试剂盒，其特征在于包括有一对引 物和一条探针， 其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示： 上游引物：5 ' -CGTGTTGGTGTTTCCTTTTAATTTATACAATAGTA-3 ' 下游引物：5 ' -CAATAGCATGTCATTTATAACATTGATGAGTATTG-3 ' 探针：5 ' -TAAACAATGGAGTTTGGGAGATTGTTTGTG-FAM-dT -A-THF-A-BHQl-dT-TCAAAGCTATGTTTTAC-P-3 '。2. 如权利要求1所述的实时荧光RPA检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括水解 缓冲液，醋酸镁以及ddH20。3. 如权利要求1或2所述的实时荧光RPA检测试剂盒，其特征在于用于检测羊痘病毒时， 反应体系如下：14.75yL的水解缓冲液，1.05yL的ΙΟμΜ上游引物，1.05yL的ΙΟμΜ下游引物， 0.3yL的ΙΟμΜ探针，2yL的病毒DNA模板，4.6yL的ddH20以及1.25yL的280mM醋酸镁； 扩增反应在温度设定为37-39°C的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为20min-lh， 结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。4. 如权利要求3所述的实时荧光RPA检测试剂盒，其特征在于扩增反应在温度设定为38 °(：的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为20min，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分 析。5. 权利要求1-4任一项所述的实时荧光RPA检测试剂盒在制备检测羊痘病毒试剂中的 用途，所述羊痘病毒为绵羊痘病毒或山羊痘病毒。6. -种用于快速检测羊痘病毒的试纸条RPA检测试剂盒，含有侧流层析试纸条，其特征 在于还包括有一对引物和一条探针， 其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示： 上游引物：5 ' -CGTGTTGGTGTTTCCTTTTAATTTATACAATAGTA-3 ' 下游引物：5 ' -biot in-CAATAGCATGTCATTTATAACATTGATGAGTATTG-3 ' 探针：5 ' -FAM-AACAATGGAGTTTGGGAGATTGTTTGTGTA -THF-ATTCAAAGCTATGTTTT-P-3 '。7. 如权利要求6所述的试纸条RPA检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括水解缓 冲液，醋酸镁以及ddH20。8. 如权利要求6或7所述的试纸条RPA检测试剂盒，其特征在于用于检测羊痘病毒时，反 应体系如下：14.75yL的水解缓冲液，1.05yL的ΙΟμΜ上游引物，1.05yL的ΙΟμΜ下游引物，0.3μ L的ΙΟμΜ探针，2yL的病毒DNA模板，4.6yL的ddH 20以及1.25yL的280mM醋酸镁； 扩增反应在温度设定为37-39°C的水浴锅中进行，反应时间为15min-30min，结束后使 用侧流层析试纸条对结果进行检测。9. 如权利要求8所述的试纸条RPA检测试剂盒，其特征在于扩增反应在温度设定为38 °C 的水浴锅中进行，反应时间为20min，结束后使用侧流层析试纸条对结果进行检测。10. 权利要求6-9任一项所述的试纸条RPA检测试剂盒在制备检测羊痘病毒试剂中的用 途，所述羊痘病毒为绵羊痘病毒或山羊痘病毒。
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测羊痘病毒的实时荧光RPA试剂盒及其用途，还公开了一种快速检测羊痘病毒的试纸条RPA试剂盒及其用途。该两种试剂盒分别包括SEQ？ID？NO.1及SEQ？ID？NO.2所示的引物及各自的探针，虽然针对同一靶标序列，但引物和探针的修饰碱基和检测平台不同。实验证明本发明的两个试剂盒的敏感性均为102拷贝/反应，并均只能特异性检测绵羊痘病毒和山羊痘病毒。分别用本发明的两个试剂盒检测羊痘病毒疑似样品，结果表明这两个试剂盒的检测结果与qPCR均具有很高的符合度。因此，本发明的两个试剂盒均能快捷、高效、灵敏的检测绵羊痘或山羊痘病毒，为绵羊痘或山羊痘病毒的鉴别诊断提供了有效技术手段。
【IPC分类】C12R1/93, C12Q1/68, C12Q1/70
【公开号】CN105567873
【申请号】CN201610054568
【发明人】张志东, 杨洋, 张向乐, 秦晓东, 赵志荀, 张强
【申请人】中国农业科学院兰州兽医研究所
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年1月27日