金维智合成羊痘病毒GPCR基因片段(374bp)，并克隆到pUC57载体，命名为pGPCR/ RPA。用质粒提取方法(Promega，USA)来提取pGPCR/RPA质粒。用Nanovue(GE lifescience) 来定量纯化的DNA，并随后进行十倍倍比稀释，并随后储存于-80°C备用。
[0066] 5、real_time RPA试验扩增条件优化
[0067]以提取纯化的病毒DNA/RNA或者标准DNA质粒为模板进行扩增，实验体系如下： 14.75yL 水解缓冲液（rehydration buffer，TwistDx exo Kit, Cambridge, United Kingdom)，1 · 05yL上游引物（10μΜ)，1 · 05yL下游引物（10μΜ)，0 · 3yL的RPA exo探针（10μΜ)，2 yL的DNA/RNA模板，4 · 6yL的ddH2〇以及 1 · 25yL的醋酸儀(magnesium acetate，280mM) 〇
[0068] 其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：
[0069] 上游引物：5'-CGTGTTGGTGTTTCCTTTTAATTTATACAATAGTA-3'（SEQ ID Ν0.1 所示）
[0070] 下游引物：5'-CAATAGCATGTCATTTATAACATTGATGAGTATTG-3'（SEQIDN0·2所示） [0071 ]探针：5 ' -TAAACAATGGAGTTTGGGAGATTGTTTGTG(FAM-
[0072] dT)A(THF)A(BHQl-dT)TCAAAGCTATGTTTTAC-P-3'（SEQ ID 从).3所示）。
[0073] 反应条件为38°C，反应可在20min之内完成。同时本发明分别用该体系对合成的三 对上游引物和三对下游引物与探针的组合进行评价，评价结果表明其中一对引物(Fe2/ Re2)与探针的组合能够产生最强的扩增信号，因此，该引物对与探针进行组合应用到本发 明中。
[0074] 在进行RPA引物的反应温度的确定时，按照上述体系加入反应物。我们分别试验了 37°(：、38°(：、39°(：不同的反应温度，反应时间为201^11，结束后通过1^3005?软件对结果进行 分析。通过对结果分析表明，38°C扩增结果最佳。所以本发明所设计的羊痘病毒real-time RPA扩增温度设定为38°C。所以，本试验以下的反应温度均设定为38°C。在进行RPA引物的反 应时间的确定时，按照上述体系加入反应物。并将温度设定为38°C时，试验反应不同时间扩 增差异。我们将时间分别设定为20min、30min和lh，结果表明，扩增20min之后的阴性在一个 小时之后仍然为阴性，20min之后的阳性在一个小时之后仍然为阳性，因此，我们选择20min 为本发明的扩增设定时间。
[0075] r e a 1 -1 i m e R P A试验检测结果判定：一个样品所有的重复试验，在特定的时间内 (20min)扩增结果均大于背景值3.5个标准方差(3.5SD)的为阳性，反之，该样品为阴性。
[0076] 6、real_time RPA试验灵每j[度以及特异性检测
[0077] 在进行RPA引物的反应灵敏度检测时，按照上述体系加入反应物。使用模板为上述 合成的标准质粒，通过核酸测定仪测定浓度计算出拷贝数，分别稀释出浓度梯度为ιο?ιο 1 个拷贝共计7个梯度作为模板。反应温度设为38°C的qPCR仪中进行，时间设定为20min，通过 实时荧光实时监控扩增结果。如图1A所示，该试验的敏感性为10 2拷贝/反应。并且具有较广 的检测范围，至少在1〇7-1〇2范围内的样品均能被检测出来。
[0078] 在real-time RPA敏感性试验中，我们对于同一个试验进行了6次重复，结果表明 6次试验的检测结果一致，均能够很好的检测最低100个拷贝的标准DNA，本发明利用PRISM 5.0软件(GraphPad Software，USA)对试验的可重复性进行统计分析，结果如图1B所示，表 明该发明具有很好的可重复性。阈值为平均值土标准方差(SD)。同时，本发明利用Excel软 件对real-time RPA试验的6次重复性结果进行退行性分析，结果如图1C所示，说明该方法 能够很好的检测羊痘病毒。
[0079]随后我们用绵羊痘病毒混合组织样品（n = 24)进一步验证该实验的准确性，试验 数据表明：qPCR检测结果与RPA检测结果完全一致，所有样品均为阳性，并且我们用excel统 计了qPCR检测结果(CT值)与real-time RPA检测结果(min)之间的相关性，结果表明real-time RPA与现有的qPCR有很高的符合度(见图2)。
[0080] qPCR检测方法参照文献(Bal insky，C · A · ，et al.,Rapid preclinical detection of sheeppox virus by a real-time PCR assay.J Clin Microbiol,2008.46(2):p.438-42.)中的方法进行。
[0081] 在进行real-time RPA试验的反应特异性的检测时，按照上述体系加入反应物。其 中使用模板分别为绵羊痘病毒(SPV)、山羊痘病毒(GPV)、羊口疮病毒(0RFV)、小反刍兽疫病 毒(PPRV)、口蹄疫病毒(FMDV)。反应温度设为38°C的qPCR仪中进行，反应时间设定为20min。 结果表明，只有绵羊痘病毒和山羊痘病毒能够很好的进行扩增，其他病毒均不能扩增，因 此，该方法具有很好的特异性。
[0082] 表2评估real-time PRA试验的特异性
[0083]
[0084] neg:代表阴性
[0085] 7、real_time RPA试验检测临床样品
[0086] 我们用建立的RPA方法来检测采集自甘肃省的临床样品(n = 23)以及健康羊的组 织样品（n = 5)，并将检测结果与qPCR的检测结果相比较。结果表明5份健康羊的组织样品 RPA检测结果和qPCR检测结果一致，均都为阴性。在23份临床样品中，real-time RPA检测结 果为6份阳性样品（时间为:4min-6.6min)，而qPCR检测结果为7份临床样品为阳性(CT值为 15-29,其中6份阳性样品与RPA检测的6份阳性样品一致）。基于检测的28份样品，与qPCR检 测结果相比较，real-time RPA的敏感性和特异性分别为96%和100%。
[0087] 表3.分别比较real-time PRA试验和qPCR试验临床样品检测结果 [0088]
[0089] 综上可见，本发明设计合成的一对引物和一条探针基因序列以及其形成的实时荧 光PRA(real-time RPA)方法可以快速诊断绵羊痘病毒(SPV)和山羊痘病毒(GPV)，而且该检 测方法简单、快速、检测结果真实可靠。
[0090] 实施例2快速检测羊痘病毒的试纸条RPA(LFS RPA)检测试剂盒及检测方法的建立
[0091] 1、引物及探针序列的设计及制备
[0092] 本发明发明人通过对来自于 GenBank 中的 X74443，L39878，EU267274，EU267273， AJ849636，FJ905304，AY560591和AJ563705的GPCR基因同源序列进行比对分析，确定了羊痘 病毒GPCR基因的保守区域，针对该区域设计了引物和探针，以期能够检测到尽可能多的羊 痘病毒。所有的引物和探针都由生工生物(上海，中国）合成。本发明分别设计合成了三对上 游引物、三对下游引物以及一条探针序列，如下表4所示。
[0093] 表4、本发明设计的LFS RPA引物和探针
[0094]
[0096] 2.毒株、细胞以及临床样品
[0097] 本研究中使用的所有的毒株均由本实验室保存:GPV AV40，SPV Gulang2009，PPRV Nigeria 75/1，ORFV/Vaccine/CHA，以及口蹄疫病毒（FMDV type A/CHA/2009;FMDV/0/CHA; FMDV/Asia 1 /CHA)。绵羊痘病毒混合组织样品(η = 24)是由羊的心、脾、肺、肾、淋巴结以及皮 肤以1:10的比例制成组织悬液并混合SPPV阳性样品，qPCR确认的阳性组织样品（n = 6)， qPCR确认的阴性组织样品(n = 6)，临床疑似样品(n = 23)来自于甘肃省临洮，qPCR确认的来 自于健康羊组织阴性样品(η = 5)。Vero细胞由本实验室保存，用含有8 %血清的DMEM培养基 在37°C，5%C02条件下培养。
[0098] 3.病毒基因组提取
[0099]使用高纯度的病毒核酸提取方法(Roche)按照说明书来来提取病毒DNA/RNA，并最 终用50yL的无 RNas e水洗脱。提取的DNA/RNA存放到-80 °C冰箱中以待随后的使用。
[0100] 4.产生质粒DNA标准品
[0101] 金维智合成羊痘GPCR基因片段(374bp)，并克隆到pUC57载体，命名为pGPCR/RPA。 用质粒提取方法(Promega，USA)来提取pGPCR/RPA质粒。用Nanovue(GE lifescience)来定 量纯化的DNA，并随后进行十倍倍比稀释，并随后储存于-80°C备用。
[0102] 5. RPA试验扩增条件优化
[0103] 首先，我们确定LFS RPA方法的最佳反应温度，我们分别试验了 15 °C、20 °C、25°C、 30°C、35 °C、38°C、40 °C、45 °C、50 °C不同反应温度，并且将孵育时间设定为30min。如图3A所 示，结果表明反应温度低于30°C时，在试纸条上没有出现试验条带，在30°C时出现较弱的试 验条带，在35 °C -45 °C之间试验条带没有可观察的差异，当温度大于50 °C时没有出现试验条 带，结果表明该试验的最佳反应温度为35°C_45°