一种表达外泌体标记物的慢病毒载体及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，尤其设及构建慢病毒表达的外泌体标记质粒及其 应用。
【背景技术】
[0002] 外泌体是细胞来源的小泡，存在于生物的体液中和细胞培养的培养基中，其直径 在30nm到lOOnm之间。外泌体又被称为
[0003] Microvesicles,epididimosomes,argosomes,exosome-likevesicles, microparticles ,promininosomes,prostasomes,dexosomes,texosomes,dex,tex, archeosomesandoncosomes。外泌体的形成途径有两个:其一，细胞内的泡体和细胞膜融合 形成;其二，直接由细胞膜形成。（维基百科）。外泌体包含各种来源于细胞的成分，诸如蛋白 质，RNA，双链DNA，脂肪，代谢分子。但不同的外泌体含有相同的组分。外泌体可通过和其他 细胞膜的融合进而内吞来发挥作用，Rabs在细胞内吞途径和外泌体的形成中发挥重要作 用。越来越多的研究发现外泌体在生物体正常生理状态下发挥重要作用；也参与各种疾病 过程，可用于疾病的诊断，治疗和预后。在正常生理状态下，外泌体介导先天免疫反应和适 应性免疫反应;病毒感染中，许多病毒(诸如HIV，HCMV，HSV1，HHV-6，ANDV，SeV，RSV，IAV)可 W和外泌体相关蛋白发挥作用，影响Rabs来调节外泌体的形成进而帮助病毒自身复制，传 播和修饰免疫。在白血病等癌症中，癌细胞分泌的外泌体通过和其他细胞相互融合，维持癌 细胞的微环境，增加细胞的增值能力、运动能力、侵染特性和抗药性;而癌细胞的微环境在 癌症的维持和发展中发挥重要作用，癌症来源的外泌体通过W下途径维持肿瘤的微环境： 帮助肿瘤细胞逃脱免疫系统和帮助起始免疫反应，促进纤维母细胞和间充质细胞分化为肌 成纤维细胞，引起血管形成，促进肿瘤转移。在胃癌的发展过程中外泌体也发挥重要作用1。 癌细胞分泌的外泌体可到达体液中，通过检测运些外泌体可帮助癌症的早期诊断。可W通 过阻断癌细胞产生外泌体和外泌体-免疫系统，外泌体-其他细胞的相互作用来抑制外泌体 介导的肿瘤转移;树突状细胞来源的外泌体可W显著刺激免疫系统的特性，进而攻击肿瘤 细胞，抑制肿瘤生长、转移和进展3。由于外泌体是由膜包被的小泡，而且可W和细胞融合， 进而可W作为药物载体。通过外泌体来呈递寄生虫的miRNAs给宿主细胞在严重免疫反应的 治疗中具有很大潜力。在创伤性脑损伤中，外泌体可W作为实时诊断W及疾病进展的指标。 可W通过外泌体来传递核酸形成W外泌体为基础的基因治疗。外泌体在疾病的诊断中十分 方便，甚至可W用唾液来作为样品。通过外泌体给药还有一个很大的优势就是可W通过血 脑屏障，解决了传统给药方式不容易透过血脑屏障，对于治疗脑部疾病具有重要价值。
[0004] 病毒载体作为传递物质的一种工具，其在科学研究中具有诸多优点，比如:更容易 传递DNA进入哺乳动物细胞、容易克隆和修饰。其中的慢病毒载体不仅可W整合进入分裂细 胞的基因组，也可W整合入不分裂的细胞的基因组。
[0005] 在科学研究中，为实时观察生物内的状态常常使用一些巧光蛋白，诸如绿色巧光 蛋白（GFP)。巧光蛋白的发现和使用极大促进了科学研究。但运些巧光蛋白由于其亮度较弱 而在一定程度上阻碍了研究进展。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供表达外泌体标记物的慢病毒载体:9〔0护〔1￥-〔063-58口- ZsGreenl-EF 1-Puro,pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro 〇
[0007] 本发明采用如下方案：一种表达外泌体标记物的慢病毒载体，是W慢病毒载体 pCDH-CMV-MCS-EFl-化ro为出发载体进行改进，所述的表达外泌体标记物的慢病毒载体是 在pCDH-CMV-MCS-EF 1 -Puro的多克隆位点区域分别引入带SBP标签的CD63基因和CD9基因， 同时在引入的CD63基因和CD9基因后面添加绿色巧光蛋白基因 ZsGreenl。
[0008] 在上述技术方案中，所述的表达外泌体标记物的慢病毒载体为将慢病毒载体 pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro 的 Xbal 和 Notl 酶切位点之间分别包含 CD63-SBP-ZsGreenl 和 CD9- SBP-ZsGreen片段的慢病毒载体。
[0009] 本发明的另一目的是，提供一种上述表达外泌体标记物的慢病毒载体构建方法， 按如下的步骤进行：
[0010] 1)根据GeneBank中人CD63、CD9的mRNA上CDS序列、SBP标签序列、ZsGreenl标签蛋 白，设计XbaI-CD63-SBP-ZsGreenl-NotI和XbaI-CD9-SBP-ZsGreenl-NotI两个DNA片段，送 于上海Invitrogen公司合成双链DNA分子；
[0011] 2)分别用限制性内切酶Xbal和Not I酶切步骤1合成的双链DNA分子，酶切体系： Xbal:化L，NotI: 1化，缓冲液:3化，合成的DNA序列：lyg，补充去离子水至30化、37°C酶切4小 时，回收酶切产物；
[0012 ] 3)用限制性内切酶Xba I和No 11酶切出发载体pCDH-CMV-MCS-EF 1-Puro，酶切体系： Xbal: 1化，Not I:化L，缓冲液：3化，pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro质粒：lug，补充去离子水至30μ L、37 °C酶切4小时，回收载体骨架；
[0013] 4)将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，连接体系：T4DNA连接酶：1化，缓 冲液：化L，回收的合成DNA序列：20ng，回收的质粒：long。16°C连接过夜后，转化大肠杆菌， 筛选阳性菌并提取其质粒，得到重组载体pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreenl-EFl-Puro和pCDH- CMV-CD9-SBP-ZsGreenl-EFl-Puro〇
[0014] 上述外泌体标记物慢病毒载体，CD63-SBP-ZsGreenl片段的核巧酸序列如序列表 中沈QIDN0.1所示;CD9-SBP-ZsGreenl片段的核巧酸序列如序列表中沈QIDN0.2所示；
[0015] 本发明同时提供一种上述的外泌体标记物慢病毒载体在生物技术领域中的应用。
[0016] 上述外泌体标记物慢病毒载体在生物技术领域中的应用，利用上述的表达外泌体 标记物的慢病毒载体在细胞感染和细胞系构建上的应用。
[0017] 上述外泌体标记物慢病毒载体在生物技术领域中的应用，利用上述的表达外泌体 标记物的慢病毒载体在CD63和CD9外泌体SBP亲和纯化上的应用。
[0018] 本发明提供的质粒将绿色巧光基因 Zsgreen克隆进细胞上，运些表达出来的巧光 蛋白就会随着外泌体分泌出来，让载体表达的外泌体CD63XD9带上绿色巧光，完美实现外 泌体实时观察研究活体外泌体的变化，可用于研究外泌体的生物学功能W及其在医学诊 断、治疗、预后和给药方式上的参考价值。
[0019] 为构建上述质粒本发明在pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro载体上将合成的NheI-CD63- SBP-ZsGreenl-NotI、MleI-CD9-SBP-ZsGreenl-NotI插入到多克隆位点MCS处。
[0020] 本发明采用的ZsGreenl基因所表达的巧光蛋白，比GFP巧光效果更强，同时设计了 SBP位点使用链霉素亲和纯化。因为依据形态学，生物化学及不同细胞源的外泌体是有区别 的，运些不同的理化性质有利于外泌体的提取所有在提取外泌体的过程中，本发明解决了 现有技术汇总常常会遇到很多不便的地方和不能实时了解所提取的外泌体的质量和纯度 的技术问题，本发明通过引入SBP位点外泌体经链酶亲和素纯化的技术方案，得到更纯的外 泌体，纯化的外泌体作用于Western blot分析，RNA表达分析W及作为基因运载工具。
[0021] 本发明构建的质粒：pCDH-CMV-CD63/CD9-SBP-ZsGreenl-EFl-Puro。不同之处：本 发明采用的是ZsGreenU绿色巧光蛋白），比GFP巧光效果更强，还设计了SBP位点可W进行 亲和纯化，能更好的观察活细胞，对于即时观察外泌体作为药物载体有重要的应用。通过不 断的对外泌体作用的研究，本发明发现在各种疾病的诊断、治疗、预后，W及作为药物载体 等将发挥越来越重要的作用，本发明的外泌体将作为"自然的纳米颗粒"进入临床，发挥其 无可替代的作用。
[0022] 本发明的表达外泌体标记物的慢病毒载体较常用的慢病毒载体具有更多优势:成 熟速度更快的巧光蛋白基因 ZsGreenl具有更强的巧光效果便于即时观察，表达的外泌体携 带SBP标