获得较高滴度的病毒为3X106TU/ml。
[0057] (4)病毒检测：
[005引 293T细胞W浓度2X105cells/m L接种于24孔板中，每孔加500yL含10%FCS的 DMEM培养液培养过夜。测时将4化病毒液加到500化含2%FCS的DMEM培养液中混合均匀，然 后换掉原有的培养液，培养过夜后在换回10%FCS的培养液培养，7化观察绿色巧光蛋 白表达情况，结果如图3所示，表明新构建的pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreenl-EFl-化ro载体 和pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreenl-EFl-Puro载体均可W用于外泌体标记物巧光检测，并获得 了较强的绿色巧光和红色巧光检测效果图，同时也说明构建的载体可W高效启动外泌体基 因 CD63、CD9和高效巧光基因 ZsGreenl的表达。
[0化9] 2、稳定转染
[0060] (1)细胞:从液氮中取出冷冻保存的皿K 293T细胞，迅速放在37°C水浴锅内溶解， 然后离屯、收集细胞，用培养基稀释后培养在多聚赖氨酸包被的细胞培养皿中。当密度达到 60 % -70 %时，可用于后续的转染实验。
[0061 ] (2)转染：将不含有内毒素的30-40yg DNA(pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreenl-EFl- 化ro或pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreenl-EFl-Puro:15yg，pLP-l:10yg，pLP-2:10yg，pLP-VSVG: 化g)转染到上述细胞内。转染方法可采用：电穿孔转染，脂质体转染。
[0062] 脂质体转染:转染前一天将皿Κ 393T细胞培养长至90 %汇合时，取四种质粒各化 g，脂质体的量为质粒的2.5倍，共转染至293Τ细胞，培养8-12小时之后更换培养基。弃去培 养液，用PBS冲洗，然后蛋白酶消化为单个细胞。按每孔20化L的量将消化后的细胞转移至96 孔板中。24h后，加入抗性浓度的完全培养液筛选。大约两周后，开始有细胞克隆长出，待其 长至96孔板的60%时，转移至24孔板。之后将细胞分成两份，其中一份用于阳性克隆的检 测，得到的阳性克隆继续扩大培养至培养瓶中，并冻存在-80°C留作备用。
[0063] 电穿孔转染:转染前一天将皿K 393T细胞培养长至90 %汇合时，用PBS冲洗，加入 蛋白酶消化为单细胞，离屯、，收集沉淀，用PBS洗沉淀，然后将细胞重悬于DMEM中，使终浓度 为0.5-2 X 107个细胞/ml。细胞悬液和质粒混合后放于电击杯中，冰浴lOmin，电转，在室溫 下放置lOmin后，用完全培养基稀释细胞并转入4个96孔板中。24h后，加入抗性浓度的抗生 素完全培养液筛选。大约两周后，开始有细胞克隆长出，待其长至孔板的60%时，扩增至24 孔板。之后将细胞分成两份，其中一份用于阳性克隆的检测，经检测为阳性的细胞克隆继续 扩人培养至培养瓶中，并冻存在-8(TC留作备用，说明构建的表达外泌体标记物的慢病毒载 体可有效用于细胞感染和细胞系的构建。
[0064] 实施例4:
[00化]SBP亲和纯化
[0066] (1)将构建的载体 pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreenl-EFl-Puro 和 PCDH-CMV-CD9-SBP- ZsGreenl-EFl-Puro分别转染入细胞，经过一段时间的培养，收集细胞并裂解。
[0067] (2)向79mg净重的细胞中加入1ml链霉亲和素结合缓冲液。
[0068] (3)将上述样品加入固定相为链霉亲和素的柱子中，4度放置30分钟。
[0069] (4)用40ml的链霉亲和素结合缓冲液洗脱柱子。
[0070] (5)用2ml含有2mM生物素的链霉亲和素结合缓冲液洗脱柱子10分钟，并重复两次， 收集洗脱液，获得高纯度外泌体，取收集液直接用于Western Blot分析检测结果如图4所 示，表明外泌体具有明显的过表达效果。
[0071 ]本申请中设及的核巧酸或氨基酸序列表如下：
[0072]
[0078] W上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点，本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，运些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等效物界定。
[0079] 本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
【主权项】
1. 一种表达外泌体标记物的慢病毒载体，以慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro为出 发载体进行改进，其特征在于，所述的表达外泌体标记物的慢病毒载体是在PCDH-CMV-MCS-EF1 -Puro的多克隆位点区域分别引入带SBP标签的⑶63基因和⑶9基因，同时在引入的⑶63 基因和⑶9基因后面添加绿色荧光蛋白基因 ZsGreenl。2. 如权利要求1所述的表达外泌体标记物的慢病毒载体，其特征在于:所述的表达外泌 体标记物的慢病毒载体为将慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro的Xbal和Not頂每切位点之 间分别包含CD63-SBP-ZsGreenl和CD9-SBP-ZsGreen片段的慢病毒载体。3. -种权利要求2所述的表达外泌体标记物的慢病毒载体构建方法，其特征在于:按如 下的步骤进行： 1) 根据GeneBank中人CD63、CD9的mRNA上CDS序列、SBP标签序列、ZsGreenl标签蛋白，设 计 XbaI-CD63-SBP-ZsGreenl-NotI 和 XbaI-CD9-SBP-ZsGreenl-NotI 两个 DNA 片段，送于上海 Invitrogen公司合成双链DNA分子； 2) 分别用限制性内切酶Xbal和Notl酶切步骤1合成的双链DNA分子，酶切体系:Xbal: 1μ L，Not I: lyL，缓冲液:3yL，合成的DNA序列：lyg，补充去离子水至30yL、37 °C酶切4小时，回收 酶切产物； 3) 用限制性内切酶Xbal和Notl酶切出发载体pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro,酶切体系： Xbal: lyL，Not I: lyL，缓冲液：3yL，pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro质粒：lug，补充去离子水至30μ L、37 °C酶切4小时，回收载体骨架； 4) 将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，连接体系:T4DNA连接酶:lyL，缓冲液:1 此，回收的合成DNA序列：20ng，回收的质粒：lOngc^WC连接过夜后，转化大肠杆菌，筛选阳 性菌并提取其质粒，得到重组载体pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreenl-EFl-Puro和pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreenl-EFl-Puro。4. 如权利要求1所述的外泌体标记物慢病毒载体，其特征在于，CD63-SBP-ZSGreenl片 段的核苷酸序列如序列表中SEQIDN0.1所示;CD9-SBP-Z SGreenl片段的核苷酸序列如序列 表中SEQIDN0.2所示；5. 权利要求1所述的外泌体标记物慢病毒载体在生物技术领域中的应用。6. 根据权利要求5所述的外泌体标记物慢病毒载体在生物技术领域中的应用，其特征 在于:利用权利要求1所述的表达外泌体标记物的慢病毒载体在细胞感染和细胞系构建上 的应用。7. 根据权利要求5所述的外泌体标记物慢病毒载体在生物技术领域中的应用，其特征 在于:利用权利要求1所述的表达外泌体标记物的慢病毒载体在CD63和CD9外泌体SBP亲和 纯化上的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种表达外泌体标记物的慢病毒载体，其是在pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro的多克隆位点XbaI和NotI区域分别引入带SBP标签的CD63和CD9基因，同时在引入的CD63和CD9基因后面添加荧光能力极强的绿色荧光蛋白基因ZsGreen1，构建pCDH-CMV-CD63-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro和pCDH-CMV-CD9-SBP-ZsGreen1-EF1-Puro重组慢病毒载体。本发明表达外泌体标记物的慢病毒载体具以下优势：成熟速度更快的荧光蛋白基因ZsGreen1具有更强的荧光效果便于即时观察，表达的外泌体携带SBP标签，可实现外泌体观察和纯化一体化。
【IPC分类】C12N15/66, C12N15/867, C12N15/65
【公开号】CN105671082
【申请号】CN201610033539
【发明人】金卫林, 殷楚
【申请人】武汉淼灵生物科技有限公司
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年1月18日