一种杂帖类化合物及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种杂帖类化合物及其制备方法。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的杂帖类化合物，可以从干燥的蛇床子中提取、分离纯化得到。本研究证实该化合物对破骨细胞的分化及增殖具有抑制作用，且存在浓度依赖关系。应用化合物(Ⅰ)治疗以破骨细胞活性增强为主的骨破坏性疾病有可能成为一种有前景的治疗方法，可以用来开发成治疗骨破坏性疾病的药物。
【专利说明】
-种杂帖类化合物及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体设及从干燥的蛇床子中分离得到的一种具有治疗 骨破坏性疾病作用的杂帖类化合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 植物蛇床子为一年生草本植物，高30~80cm。茎直立，有分枝，表面有纵沟纹，疏生 细柔毛。叶互生，2~3回羽头细裂，最终裂片线状披针形，先端尖锐;基生叶有长柄，柄基部 扩大成銷状。复伞形花序顶生或蔽生;总巷片8~10,线形;花白色，花柱基短圆锥形，花柱细 长，反折。双悬果宽楠圆形，果棱具翅。花期4~7月，果期6~8月。生于原野、田间、路旁、溪沟 边等潮湿处。
[0003] 中药蛇床子为伞形科（Umbelliferae)蛇床属植物蛇床Cnidium monnierUL.) 化ss.的干燥成熟果实。蛇床子性溫，味辛苦，有小毒。外用燥湿杀虫止痒，内服溫肾壮阳，桂 风燥湿。用于治疗阳瘦，宫冷，寒搏腰痛，外治滴虫性阴道炎，手、足癖感染等。国内外关于蛇 床子药理效应的报道很多，设及免疫、神经、内分泌、屯、血管、呼吸及生殖等系统，主要表现 为抗炎、抗过敏、中枢抑制、抗屯、律失常及抗肿瘤等作用。
[0004] 蛇床子主要含香豆素类化合物，此外还有色原酬类和苯并巧喃类化合物。蛇床子 挥发油中，相对含量较高的组分主要有倍半祗类，此外还有醋类和祗醇类化合物。大量研究 证明蛇床子的有效成分为香豆素类化合物，其中含量最高的两种香豆素类化合物为蛇床子 素(0sthole，0st)、欧前古月素（Imperatorin，Imp)。
[0005] 因此Ost及Imp经常作为评价不同来源地的蛇床子药材的质量及含蛇床子中成药 的质控指标。由于Ost具有许多重要的药理活性包括抗癌、抗增殖等活性，W及Imp具有抑制 癒痛发作、扩张血管、抑制屯、肌肥大、抑制肿瘤细胞增殖、抗微生物、影响药物代谢酶活性等 多种药理作用，而受到越来越多的关注。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种从干燥的蛇床子中分离得到的一种具有治疗骨破坏性 疾病作用的杂帖类化合物及其制备方法。
[0007] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得W实现的：
[0008] 具有下述结构式的化合物(I)，
[0009]
[0010] 所述的化合物（I)的制备方法，包含w下操作步骤：（a)将干燥的蛇床子粉碎，用75 ~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油酸、乙酸乙醋和水饱和的 正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b)步骤(a)中乙酸 乙醋萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱6个柱体积，再用75%乙醇洗脱8个柱体积， 收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（C)步骤(b)中75%乙醇洗脱浸膏 用正相硅胶分离，依次用体积比为90:1、65:1、30:1、15:1和1:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱 得到5个组分；（d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为25:1、15:1和5: 1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相 硅胶分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液，洗 脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。
[0011] 进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0012] 进一步地，所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为80%。
[0013] -种药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物（I)和药学上可接受的载 体。
[0014] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、对 人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0015] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 W及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物W单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等;用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
[0016] 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0017] 实验表明化合物（I)对破骨细胞的分化及增殖具有抑制作用，且存在浓度依赖关 系。应用化合物（I)治疗W破骨细胞活性增强为主的骨破坏性疾病有可能成为一种有前景 的治疗方法。
【附图说明】
[0018]图1为化合物（I)结构式；
[0019 ]图2为化合物（I)理论ECD值与实验ECD值比较。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不W此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可W对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0021] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0022] 试剂来源：乙醇、石油酸、乙酸乙醋、正下醇、二氯甲烧为分析纯，购自上海凌峰化 学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[002；3]制备方法：（a)将干燥的蛇床子(8kg)粉碎，用80%乙醇热回流提取侦LX3次），合 并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油酸(化X3次）、乙酸乙醋(化X3次)和水饱和的正 下醇(化X3次)萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物(351g)和正下醇萃取物；（b) 步骤(a)中乙酸乙醋萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱6个柱体积，再用 75%乙醇洗脱8个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏（133g); (C)步骤(b)中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为90:1(8个柱体积）、65:1 (8个柱体积）、30:1(6个柱体积）、15:1(8个柱体积)和1:1(5个柱体积）的二氯甲烧-甲醇梯 度洗脱得到5个组分；（d)步骤(C)中组分4(31g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为 25:1(8个柱体积）、15:1(10个柱体积)和5:1(6个柱体积）的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3 个组分；（e)步骤(d)中组分2(17g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度 为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合 物（I)(31mg)。
[0024] 结构确证:HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z 359.1112，结合核磁特征可得分子式为 Ci7出日〇7，不饱和度为8。核磁共振氨谱数据δκ(邮m，DMSO-ds，600MHz): H-2 (6.43，S)，H-5 (3.26，d，J=15.1)，H-5(2.65，d，J=15.1)，H-8(2.37，m)，H-8(2.25，m)，H-9(1.91，dd，J = 12.7,7.3)，H-9a.35，m)，H-ll(3.81，s)，H-15(1.21，s)，H-16(1.29，s)，l-OH(12.87，s)，4- 0H(8.75，s)，6-OH(4.73，s)，3-OC出（3.85，s);核磁共振碳谱数据Sc(ppm，DMSO-ds，125MHz): 158.5(C，l-C)，99.0(CH，2-C)，154.2(C，3-C)，138.7(C，4-C)，30.9(Ol2,5-C)，89.8(C，6- C)，202.7(C，7-C)，24.6(Ol2,8-C)，31.4(ai2,9-C)，64.3(C，10-C)，73.9(CH，ll-C)，199.3 (C，12-C)，114.2(C，13-C)，122.6(C，14-C)，21.3(CH3，15-C)，16.7(CH3，16-C)，56.1(CH3,3- OC曲）；碳原子标记参见图1。红外光谱表明该化合物含有径基基团（3442cm-i);此外该化合 物在373和294nm有紫外吸收，说明含有多共辆结构。1? NMR谱和服Q幻普显示有17个碳信号， 分别为Ξ个甲基(包括一个甲氧基），Ξ个亚甲基，两个次甲基(一个締控碳，一个含氧碳 及九个季碳(两个幾基碳，两个締控碳，两个含氧季碳，Ξ个締控含氧季碳）。另外，一个締控 质子信号姐 6.43(lH，s，H-2)，W 及六个締碳信号 SC158.5(C，1-C)，99.0(CH，2-C)，154.2(C， 3-C)，138.7(C，4-C)，114.2(C，13-C)和 122.6(C，14-C)，表明该化合物含有一个五取代的苯 环结构。HMBC谱中，径基质子（SH12.87，s，l-OH)与C-1，C-2，C-13W及SC199.3(s，12-C)的相 关性表明幾基碳(C-12)与苯环C-13位相连，该化合物在373和294皿的紫外吸收也验证了运 一结论。HMBC谱中，径基质子δ册.75(lH，s，4-OH)与SC138.7(C，4-C)，154.2(C，3-CWP122.6 (C，14-C);甲氧基质子姐3.85(s，3-0C出)与C-3; W及H-2与C-3的相关性表明径基和甲氧基 分别位于C-4和C-3位上。去除苯环和甲氧基的屯个碳，剩余的10个碳原子形成了一个十元 环单祗结构。此外，两个含氧碳信号SC64.3(C，10-C)和73.9(CH，11-C)表明存在一个10,11- 环氧基团。HMBC谱中，H-11 (如3.79，s)与C-12和 010;曲-16(5刖.28,3)与010和(：-16(5 C16.0)的相关性验证了上述推论。综合氨谱、碳谱、HMB村普和ROESY谱，W及文献关于相关类 型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过EC的式验确定，理论值与 实验值基本一致(图2)。
[0025] 实施例2:化合物（I)药理作用试验
[002引一、材料和仪器
[0027] SD雄性大鼠（4周龄)购于河北医科大学动物实验中屯、，清洁级，体重150g。化合物 (I)自制，册LC归一化纯度大于98%。1〇,25(0恥〇3购于英国普利茅斯生物研究实验室。α- ΜΕΜ培养基购于美国GIBC0B化。Soluble RANKL购于英国化protec Science。抗酒石酸酸性 憐酸酶(TRAP)试剂盒购于美国Sigma公司。葡聚糖凝胶购于上海如吉科技发展有限公司。标 准胎牛血清购于山东银香伟业生物有限公司。注射用青霉素钢购于华北制药有限公司。注 射用硫酸链霉素购于深圳华药南方制药有限公司。丙酬、甲醒溶液购于石家庄市有机化工 厂。异氣烧购于鲁南贝特制药有限公司。二甲基亚讽购于天津市光复精细化工研究所。
[0028] BB5060/BB16二氧化碳培养箱(上海化raeus公司），VD-650型桌上式细胞培养超净 操作台（苏州净化设备有限公司），BFX5-320型低速离屯、机（中国上海沪南科学仪器联营 厂），XD-1019810倒置显微镜(江南公司），CX-21光学显微镜（日本OLYMPUS)，微量加样器(法 国GILS0N)，2510型变频振荡仪(上海新波生物技术有限公司），GF-300型电子天(JapanA&D Company，limited)，725型超低溫冰箱化orma Scientific. Inc)。未提到的材料和仪器均为 常规仪器。未提到的溶液配制均采用本领域常规溶液配制方法配制即可。
[0029] 药液配制及葡聚糖凝胶柱的制备：
[0030] 1、α-ΜΕΜ培养液的制备：
[0031] (Ι)α-ΜΕΜ粉一袋+超纯水800ml，完全溶解；
[0032] (2)加碳酸氨钢3.0?待完全溶解后加盐酸测PH达7.2;
[0033] (3)再次加超纯净水至1000ml;
[0034] (4)加抗生素(青霉素及链霉素）；
[0035] (5)滤过灭菌(0.22微米微孔滤膜过滤）
[0036] (6)500ml灭菌瓶分装，4°C储藏备用。
[0037] 2Ja，25(0H)2D3 储存液的分装
[003引 （1)取1α，25(0H)2化原液50微升（50微升一支），加入无水乙醇1150微升，使总量至 1200微升（即24倍稀释）
[0039] (2)W100微升/只分装于12支灭菌试管内，-30°C冰箱内储存备用；
[0040] (3)应用前再次稀释1000倍，使最终浓度为IX 10-8Μ。
[0041 ] 3、Soluble RANKL储存液分装
[0042] (1)取34歷17东干粉一支(10微克）；
[0043] (2)0.11 tris-肥 1 buffer 50微升溶解RANKL
[0044] (3) W5微升/只分装于10支灭菌冷冻管内，-30°C冰箱内储存备用；
[0045] (4)使用前取出一支，先用含10%FBSa-MEM培养液495微升溶解（即稀释100倍）；添 加前再次稀释100倍，使终浓度为20ng/ml。
[0046] 4、0.1M tris-肥 1 buffer的制备
[0047] (l)tris-HCl 12.llg(0.1M)；
[004引 （2)超纯水800ml(添加溶解后，调节pH至8.2);
[0049] (3)加超纯水至1000ml备用。
[0050] 5、化合物(I)储存液的制备
[0051 ] (1)储存液的浓度：Img/ml及lOOug/ml。
[0052] (2)储存液的配制：称取化合物（I)lmg放于灭菌冷冻管内，加入二甲基亚讽1ml完 全溶解，配成Img/ml的储存液。从Img/ml的储存液中取出100微升放于另一支灭菌冷冻管 内，加入二甲基亚讽900微升即配成100微克/毫升的储存液，储存于4°C恒溫冰箱，使用时间 不超过两周。Img/ml的储存液冷冻保存。
[0化3] 6、TRAP固定液的制备
[0054]在染色之前，按产品说明书配制。首先取无菌20ml试管一支，按W下顺序依次加入 试剂:丙酬6.5ml、构祿酸2.5ml、甲醒0.8ml，充分混匀，计9.8ml，现配现用。
[0化日]7、TRAP染色液的制备
[0056] 同样是在染色之前配制，按产品说明制备，现配现用。
[0057] 8、葡聚糖凝胶柱的制备
[005引（1)消毒后50ml注射器一个，除去内忍；
[0059] (2)注射筒与注射头交接处置消毒后的脱脂棉球一个；
[0060] (3)固定架固定针筒，针头处接关闭状的Ξ通；
[0061] (4)将灭菌的葡聚糖凝胶混匀，抽取30ml注入针筒内，打开Ξ通，缓慢过滤沉淀，待 凝胶沉淀液面至15ml时为止;关闭Ξ通，放入4°C恒溫冰箱过夜；
[0062] (5)实验前1小时用含有15 %胎牛血清的α-iffiM培养液50ml缓慢注入凝胶柱内，打 开Ξ通，自然过滤洗涂凝胶柱后待用。
[0063] 二、试验方法
[0064] 1、全骨髓细胞培养 [00化]1.1全骨髓细胞提取
[0066] 实验开始前30分钟将标准胎牛血清放入37 °C水浴箱内解冻;取50mL无菌离屯、管一 个，装入40mL不含胎牛血清的α-ΜΕΜ培养液，W备冲洗全骨髓细胞用。
[0067] (1)选4周龄SD雄性大鼠1只，75%乙醇消毒后，采用异氣烧吸入麻醉；（2)待麻醉起 效后，无菌条件下取大鼠两侧腔骨和股骨，剪掉骨垢端暴露骨髓腔；（3)用lOmL注射器抽取 不含血清的曰-MEM培养液，换用25号针头后自骨髓腔内冲出骨髓细胞至50mL无菌离屯、管内； (4)将所提取的细胞悬液充分吹打，待没有团块后，将盛有细胞的离屯、管与平衡管一起放入 离屯、机内离屯、，调整转速(2000转/分），离屯、5分钟；离屯、过程中配制含有15%胎牛血清的α- ΜΕΜ培养液50mL(7.5血胎牛血清加入42.5mLa-MEM培养液中）备用；（5)离屯、结束后弃去上清 液，加入含15 %胎牛血清的α-ΜΕΜ培养液20mL，充分吹打混匀，形成细胞悬液，此液简称为细 胞原液。
[0068] 1.2细胞数的计算(原液浓度及稀释倍数）
[0069] (1)取W上提取的细胞悬液25化放入试管内，然后加入5%醋酸47扣L，即形成20倍 稀释的细胞悬液;将试管放在振荡器上，振荡20秒钟，目的是去除红细胞；（2)计算细胞数： 取振荡后细胞悬液滴入细胞计数盘，勿超过边缘，盖玻片覆盖，倒置显微镜下计算细胞数， 计数盘4个大格内所有细胞均计入。本实验计算细胞数为537个，根据公式(细胞数/4) X20 X104cells/mL推算细胞原液的浓度，本实验计算如下（537/4)X 20 X 104 = 26.85 X 106cells/mL即本实验细胞原液浓度为26.85X106cells/mL，而我们需要的目的浓度是2X 106cells/mL，所W细胞原液需要稀释。（3)稀释倍数计算如下:稀释倍数二原液浓度/目的 浓度;本实验稀释倍数=26.85 X l〇6cells/mL/2 X l〇6cells/mL= 13.425，即原液需要稀释 13.425倍才能达到需要的目的浓度。本实验需要2乂106。6113/1^的细胞悬液4〇1^，简称为 目的量。（4)达到目的浓度所需原液的量，计算如下:达到目的浓度所需原液的量=目的量/ 稀释倍数。本实验计算如下：达到目的浓度所需原液的量= 40mL/13.425^2.98mL。即取 26.85 X 106cells/mL的细胞原液2.98mL放入灭菌的50mL离屯、管内，然后加入37.02mL(40- 2.98)含15%胎牛血清的α-MEM培养液即可配成2X106cells/mL的细胞悬液40mL，然后加入 Ια，25 (OH) 2〇3储存液40yL，操作过程应避光，即Ια，25 (0Η)203终浓度为1 X 10-8M ;再加入4μΙ soluble RANKL储存液，即solubleRANKL终浓度为20ng/mM加液过程在超净工作台上操作， 至此，所需2X106cells/mL的细胞悬液目的量配置完成。
[0070] 1.3培养细胞、加药
[00川 （1)细胞接种：取4行6列24孔培养板一块，每孔加入2 X 106cells/mL的细胞悬液 0.5mLαxl06cells)。（2)加入化合物α):取100μg/mL化合物（I)分装液一支于培养板的第 2列分别加入2.扣L，每加一孔均需换一个吸头;第3列每孔加入扣レ第4列每孔加入10化。加 完第4孔后，将此液放入4°C恒溫冰箱保存，取Img/mL化合物(I)储存液一支。第5列每孔加入 Img/mL化合物（I)储存液2. 第6列每孔加入化L。加完后剩余药液放入4°C恒溫冰箱保 存。第一列不加药物，作为对照组。至此在24孔培养板中化合物（I)每行都有6个浓度，分别 为0、0.5、1、2、5、104邑/血，每个浓度每列4孔(11 = 4)，第一列为对照组。（3)培养细胞:加完药 后，将培养板放入C02培养箱内，在37°C、5 %C02及饱和湿度条件下，培养7天。培养至第4天时 换培养液一次，按上述方法配制含有15%胎牛血清的α-iffiM培养液40m(16mL胎牛血清加入 34mLa-MEM培养液中），内含10化青霉素祉L链霉素(80万U青霉素，100万链霉素分别用2mL灭 菌蒸馈水溶解），加入化L solubleRANKL储存液，然后取化，25(0H)2化储存液40化加入。从培 养箱内取出培养板后，倒置显微镜下观察细胞生长状况，每孔吸出旧培养液3(K)yL，加入新 培养液4(K)yL，每吸出一列更换一次吸头，每加一孔更换一次吸头。换液完成后，将培养板继 续放入C02培养箱内，在37 °C、5 % C02及饱和湿度条件下，再培养3天。
[0072] 2、破骨前驱细胞(P0C)培养
[0073] 2.1全骨髓细胞的提取:如同W上所述方法，制备全骨髓细胞悬液1.5mL。
[0074] 2.2非附着骨髓细胞的提取
[0075] (1)把用培养液冲洗过的凝胶柱，固定在固定架上；（2)缓慢向凝胶柱内注入全骨 髓细胞1.5mL，打开Ξ通，缓慢过滤；待1.5mL全骨髓细胞渗入凝胶柱内后，再缓慢注入含 15 %胎牛血清的α-ΜΕΜ培养液lOmL。（ 3川欠集含有非附着骨髓细胞的培养液共计12-15mL，此 液称为非附着骨髓细胞原液。
[0076] 2.3细胞数的计算(原液浓度及稀释倍数)及达到目的浓度所需原液的量
[0077] 如同W上所述方法，计算细胞数，稀释倍数，达到目的浓度所需原液的量。本实验 计算细胞数为337个，推算细胞原液的浓度为16.85X 106cells/ml;稀释倍数为8.425，即细 胞原液需稀释8.425倍才能达到需要的目的浓(2X106cells/ml);达到目的浓度所需原液 的量40ml/8.425^4.75ml，即取4.75ml细胞原液放入灭菌的50ml离屯、管内，然后加入 35.25ml(40-4.75)含15%胎牛血清的α-MEM培养液即可配成2X106cells/ml的目的细胞悬 液40ml，然后加入化，25(0Η)203储存液40ul，操作过程应避光，即Ια，25(0Η)203终浓度为1 X 10-8Μ;加入soluble RANKL储存液4ul，即soluble RANKL终浓度为20ng/ml;加液过程均在超 净工作台上操作，至此，未附着骨髓细胞悬液目的量配置完成。
[0078] 2.4培养细胞及加药如同前述。
[00巧]3、倒置显微镜下观察
[0080] 3.1倒置显微镜的调节
[0081] (1)将显微镜合轴；
[0082] (2)将视野光圈开大至与聚光器光阔边缘一致；
[0083] (3)将与物镜放大倍数一致的相板放入聚光器中；
[0084] (4)把调中目镜换到目镜筒中，旋动调中目镜上的调焦环至相板相环的图像清晰；
[0085] (5)调节聚光器上的相环调中旋钮，使两个圆环图像重叠成同屯、圆状态；
[0086] (6)用普通目镜换下调中目镜。
[0087] 3.2 TRAP染色
[0088] (1)培养7天后，将培养板从培养箱内取出，弃去培养液；（2)加入固定液0.4mL/孔， 固定1分钟；（3)弃去固定液，蒸馈水冲洗四次；（4)加入染色液3-4滴/孔，用锡纸包裹培养 板；（5)在37°C、5 % C〇2及饱和湿度条件下解育30分钟后，取出培养板，弃去染色液，蒸馈水 冲洗四次，自然干燥。
[0089] 3.3 观察
[0090] 培养7天后将培养板从培养箱内取出，弃去培养液之前，在倒置显微镜下观察不同 药物浓度下细胞的生长状况及形态，决定是否染色。染色后带染色液倒置显微镜下观察染 色效果。
[0091] 4、光镜观察
[0092] 带染色液倒置显微镜下观察后，弃去染色液，蒸馈水洗4次，自然干燥，普通光镜下 观察计算破骨细胞数。
[0093] 5、统计学分析
[0094] 使用SPSS16.0统计学软件进行分析。数据处理采用mean±SD表示，对不同药物浓 度相同处理时间，各组与对照组之间比较，化合物（I)对破骨细胞形成及分化的影响，得出 的数据资料分析采用方差分析，从而得出药效和药物浓度的变化关系。
[00巧]Ξ、结果及结论
[0096] 在全骨髓细胞培养系中，0.5、1、2yg/mL组与对照组比较，TRAP染色阳性细胞(3核 W上)数仅为对照组的49.04%、28.85 %、5.77 %，经统计学分析，加药组对破骨细胞的形成 有抑制作用，当药物浓度为lyg/mL时与对照组相比，对破骨细胞形成有显著抑制作用（P< 〇.〇1)。见表1。
[0097] 在破骨前驱细胞培养系中，0.5、1、2、5yg/mL组与对照组相比，TRAP染色阳性细胞 (单核或2核)数仅为对照组的85.11 %、65.79%、37.83 %、2.21 %，经统计学分析，加药组对 破骨前驱细胞的形成有抑制作用，当药物浓度为化g/mL时与对照组相比，对破骨前驱细胞 形成有显著抑制作用(P<〇.01)。见表2。
[0098] 结论，本研究结果表明化合物（I)对破骨细胞的分化及增殖具有抑制作用，且存在 浓度依赖关系。应用化合物（I)治疗W破骨细胞活性增强为主的骨破坏性疾病有可能成为 一种有前景的治疗方法。
[0099] 表1全骨髓细胞培养系中TRAP染色阳性细胞(3核W上)数
[0100]
[0103] ~实施例3 ' '
' ' ' '
[0104] 片剂的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石酸、或巧樣 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的 比例加入赋形剂，制粒压片。
[0105] 实施例4
[0106] 口服液制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石酸、或巧樣 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服 液。
[0107] 实施例5
[0108] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒 石酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按其与赋形剂重 量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0109] 实施例6
[0110] 注射液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，w及利用有机酸如酒石酸、或巧 樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤， 灌封灭菌制成注射液。
[0111] 实施例7
[0112] 无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水 中，揽拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安飯中，低溫冷冻干燥后无 菌烙封 得粉针剂。
[0113] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不W此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可W对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I)，2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含W下操作步骤：（a)将干燥 的蛇床子粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油酸、乙 酸乙醋和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物； (b)步骤(a)中乙酸乙醋萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱6个柱体积，再用75%乙 醇洗脱8个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（C)步骤(b)中 75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为90:1、65:1、30:1、15:1和1:1的二氯甲 烧-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比 为25:1、15:1和5:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烧 基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个 柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型 大孔吸附树脂。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述用乙醇热回流提取 采用的乙醇浓度为80 %。5. -种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物（I) 和药学上可接受的载体。
【文档编号】C07D301/32GK106083766SQ201610393932
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月3日 公开号201610393932.6, CN 106083766 A, CN 106083766A, CN 201610393932, CN-A-106083766, CN106083766 A, CN106083766A, CN201610393932, CN201610393932.6
【发明人】武晓丹
【申请人】武晓丹