专利名称：黄烷酮化合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的黄烷酮化合物，以及各自含有该黄烷酮化合物的抗氧化剂、抗菌剂、抗癌剂、食品饮料、化妆品、准药物和药物。
背景技术：
已知的黄烷酮化合物可列举nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C。对于这些已知的黄烷酮化合物，可参见“K.Yakushijin，K.Shibayama，H.Murata和H.Furukawa由HernandiaNymphaefolia(presl)Kubitzki得到的新异戊二烯黄烷酮，杂环杂志，14卷397-402页，1980”，“W.R.Phillips，N.J.Baj，A.A.L.Gunatilaka和D.G.I.Kingston由Mimulus clevelandii得到的C-香叶基化合物，天然产物杂志，59卷495-497页，1996”，以及“M.H.Tseng，C.H.Chou，Y.M.Chen和Y.H.Kuo由macaranga tanarius落叶得到的异种相克相成异戊二烯黄烷酮，天然产物杂志，64卷827-828页，2001”。Nymphaeol-A是从Hernandia nymphaefolia(presl)Kubitzki或Mimulus clevelandii分离得到的。Nymphaeol-B是从Hernandia nymphaefolia(presl)Kubitzki分离得到的。Nymphaeol-C是从Hernandia nymphaefolia(presl)Kubitzki或Macaranga tanarius分离得到的。然而，这些黄烷酮化合物的生理活性还不明了。
发明内容
因此，本发明人进行了广泛的研究以寻找已知黄烷酮化合物的生理活性，并通过分离新的黄烷酮化合物以发现新黄烷酮化合物的有用的生理活性。本发明是基于由此获得的发现而做的。本发明的第一个目的是提供一种具有各种应用如食品饮料和药物的新黄烷酮化合物。本发明的第二个目的是提供利用了这些黄烷酮化合物的有用生理活性的对已知的或新的黄烷酮化合物的应用。
为了达到上述目的，本发明首先是提供了由下式表示的黄烷酮化合物
本发明的另一方面是提供各自含有上述黄烷酮化合物的抗氧化剂、抗菌剂、抗癌剂、食品饮料、化妆品、准药物和药物。
本发明还有一个方面是提供各自含有至少一种选自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C的黄烷酮化合物的抗氧化剂、抗菌剂、抗癌剂、食品饮料、化妆品、准药物和药物。
图1中的表汇集了实施例中的化合物1的物理化学性质。
图2中的表显示了实施例中的化合物1的核磁共振数据。
图3中的表汇集了实施例中的化合物2的物理化学性质。
图4中的表显示了实施例中的化合物2的核磁共振数据。
图5中的表汇集了实施例中的化合物3的物理化学性质。
图6中的表显示了实施例中的化合物3的核磁共振数据。
图7中的表汇集了实施例中的化合物4的物理化学性质。
图8中的表显示了实施例中的化合物4的核磁共振数据。
具体实施例方式
下面说明本发明的第一实施方式。
根据第一实施方式的黄烷酮化合物是5，7，3′，4′-四羟基-5′-C-香叶基黄烷酮(isonymphaeol-B)，由结构式1表示 该黄烷酮化合物的分子式为C25H28O6，分子量为424，熔点为123～126℃(见图3)。该黄烷酮化合物是一种天然存在的新化合物，并由本发明人从冲绳蜂胶中分离出来。虽然该黄烷酮化合物的结构特性类似于圣草酚的，但是它在5′-位置有C-香叶基。因此，它具有比圣草酚更高的亲脂性(或膜渗透性)。
该黄烷酮化合物具有同圣草酚或α-生育酚一样高的抗氧化作用。此外，该黄烷酮化合物具有抗癌作用，其能够抑制癌细胞如乳癌细胞的扩散。此外，该黄烷酮化合物具有诱导生理学细胞死亡(或编程性细胞死亡)的作用，以除去不希望有的细胞如癌变细胞和已接近细胞寿命的老化细胞。此外，该黄烷酮化合物对革兰氏阳性细菌如金黄葡萄球菌和生孢子细菌如Genus氏杆菌具有抗菌作用。
根据第一实施方式的抗氧化剂含有该黄烷酮化合物作为活性成分(或抗氧化组分)。该抗氧化剂可作为防腐剂添加到食品饮料中以有效的抑制各种产品的变质(主要是氧化变质)，如油脂的氧化变质，香料的变质，色素的分解和褪色。在一个通过口摄取了含有该抗氧化剂的食品饮料如保健食品的活体中，该黄烷酮化合物除去活性氧以起到增强健康的作用，如肝功能增强作用，乙醛毒性的降低，低密度脂蛋白胆固醇(LDL)的抗氧化作用，乳癌细胞的抑制扩散作用，以及改善免疫功能。该抗氧化剂可包含在化妆品或准药物中使用。此时，它起到对皮肤、口腔等的美白作用和防老化作用等等。
根据第一实施方式抗菌剂含有该黄烷酮化合物作为活性成分。该抗菌剂是加入到例如食品饮料中来使用的。在这种情况下用于防止食品饮料腐败。该抗菌剂可以加入到药物中使用，或可以作为例如传染病治疗药物或抗菌化疗的药物使用。该抗菌剂可加入到化妆品或准药物中使用。此时，其作用是保持皮肤、口腔、腋窝等处的清洁。
当该抗菌剂加入到食品饮料、药物、化妆品或准药物中使用时，这些产品中含有的黄烷酮化合物的浓度优选为10ppm或更大，更优选20ppm或更大，进一步优选为30ppm至10,000ppm，尤其优选为50ppm至1,000ppm。当黄烷酮化合物的浓度小于10ppm时，抗菌作用难以充分发挥。相反，当浓度大于10,000ppm时则不经济。
根据第一实施方式的抗癌剂含有该黄烷酮化合物作为活性成分，其主要作为药物使用。抗癌剂剂量的确定要使得当黄烷酮化合物作用于癌细胞时其浓度优选在0.1μM至100mM，更优选10至1,000μM。如果黄烷酮化合物的浓度小于0.1μM时，治疗效果将很弱。相反，当浓度大于100mM时则不经济。
该抗癌剂的成人剂量以黄烷酮化合物计，优选0.5～10g每天，更优选2～5g每天。当黄烷酮化合物的日剂量小于0.5g时，抗癌作用难以充分发挥。相反，当日剂量大于10g时则不经济。该抗癌剂的儿童剂量优选为成年人剂量的一半。
当该黄烷酮化合物包含在食品饮料(如保健食品)、化妆品或准药物中时，这些产品能够通过促进对如癌变细胞等不希望有的细胞的生理消除来达到防癌效果。当产品为药物时，该黄烷酮化合物在其中的浓度优选为1至50％，更优选为10至30％。
根据第一实施方式的食品饮料含有该黄烷酮化合物。这些食品饮料可含有上述的抗氧化剂或抗菌剂。由于包含在食品饮料中的黄烷酮化合物的抗氧化剂作用，这些食品饮料能够除去体内活性氧，并因此作为能够发挥各种增强健康作用的保健食品使用。包含在食品饮料中的黄烷酮化合物还因其防变质作用而能够防止食品饮料的变质，从而提高了食品饮料的储藏稳定性，或籍黄烷酮化合物的抗菌作用而防止食品饮料的腐败，从而提高食品饮料的储藏稳定性。因此，食品饮料的品质可在长时间内保持稳定。因其抗癌的作用，食品饮料中所包含的黄烷酮化合物能够促进不希望有的细胞如癌变细胞和已接近细胞寿命的老化细胞的生理消除。因此这些食品饮料还可作为能够发挥极大的增进健康作用的保健食品使用。
该食品饮料的成人摄入量以黄烷酮化合物计，优选0.05～10g每天，更优选0.2～5g每天。当黄烷酮化合物的日摄入量小于0.05g时，黄烷酮化合物的抗氧化作用难以有效发挥。相反，当日摄入量大于10g时则不经济。
第一实施方式具有以下优点。
第一实施方式的黄烷酮化合物是5，7，3′，4′-四羟基-5′-C-香叶基黄烷酮(isonymphaeol-B)，由上面的结构式1表示。由于该黄烷酮化合物具有抗氧化作用、抗癌作用、抗菌作用等，它可以具有多种用途，包括食品饮料和药物。尤其是，黄烷酮化合物是一种单一化合物，却能同时发挥多重和多种功效。因此，对于该黄烷酮化合物可用作以蜂胶为代表的多功能保健食品的原料这一点尤其值得注意。此外，该黄烷酮化合物还可用在类似于圣草酚的应用，以及亲脂性比圣草酚更高的各种应用中。由于黄烷酮化合物包含在传统上用作保健食品原料的蜂胶中，在经口摄取和经皮肤摄入上不存在问题。
第一实施方式的抗氧化剂含有高抗氧化作用的黄烷酮化合物作为活性成分。因此，当在食品饮料、化妆品或准药物中加入该抗氧化剂时，其能够防止这些产品的变质以提高储藏稳定性，并且当该抗氧化剂经口头摄取或皮下摄入时能够在体内发挥健康增强作用和抗老化作用。
第一实施方式的抗菌剂含有高抗菌作用的黄烷酮化合物作为活性成分。因此，当在食品饮料、化妆品或准药物中加入该抗菌剂时，其能够防止这些产品的变质以提高储藏稳定性，并且当该抗菌剂作为化妆品或准药物经皮下摄入时能够发挥高保健作用和高除臭作用。该抗菌剂还可作为药物使用。
第一实施方式的抗癌剂含有高抗癌作用的黄烷酮化合物作为活性成分。因此，该抗癌剂对癌症具有高的疗效，并具有防癌的效果。
第一实施方式的食品饮料(饮料或食品)含有具有抗氧化作用、抗癌作用和抗菌作用等的黄烷酮化合物。因此，对于该食品饮料，防止了其自身的变质和腐败，且在体内同时发挥多种有益功效，如健康增强作用、抗老化作用，新陈代谢增强作用和防癌效果。当食品饮料中黄烷酮化合物的含量设置在相对小的量时，很易得到其储藏稳定性只是因黄烷酮化合物的防变质或防腐败作用而得到提高的食品饮料。
下面说明本发明的第二实施方式。
根据第二实施方式的黄烷酮化合物包含至少一种选自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C的物质。
nymphaeol-B是5，7，3′，4′-四羟基-2′-C-香叶基黄烷酮，由结构式2表示 nymphaeol-B的分子式为C25H28O6，分子量为424，熔点(MP)为80～83℃(见图1)。nymphaeol-B是一种天然存在的有机化合物，并由本发明人从冲绳蜂胶中分离出来。虽然nymphaeol-B的结构特性类似于圣草酚，但是它在2′-位有C-香叶基。因此，它具有比圣草酚更高的亲脂性(或膜渗透性)。
nymphaeol-A是5，7，3′，4′-四羟基-6-C-香叶基黄烷酮，由结构式3表示 nymphaeol-A的分子式为C25H28O6，分子量为424，熔点(MP)为172～175℃(见图5)。nymphaeol-A是一种天然存在的有机化合物，并由本发明人从冲绳蜂胶中分离出来。虽然nymphaeol-A的结构特性类似于圣草酚，但是它在6-位有C-香叶基。因此，它具有比圣草酚更高的亲脂性(或膜渗透性)。
nymphaeol-C是5，7，3′，4′-四羟基-6-(3，3-二甲基烯丙基)-2′-C-香叶基黄烷酮，由结构式4表示
nymphaeol-C的分子式为C30H36O6，分子量为492(见图7)。nymphaeol-C是一种天然存在的有机化合物，并由本发明人从冲绳蜂胶中分离出来。虽然nymphaeol-C的结构特性类似于圣草酚，但是它在6-位有一个3，3-二甲基烯丙基，以及在2′-位有一个C-香叶基。因此，nymphaeol-C具有比圣草酚、nymphaeol-A和nymphaeol-B都更高的亲脂性(或膜渗透性)。
nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C中任何一个都具有如同圣草酚或α-生育酚一样的抗氧化作用。此外，nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C中的任何一个都具有抗癌作用，其能够抑制癌细胞如乳癌细胞的扩散。nymphaeol-A和nymphaeol-C的抗癌作用比nymphaeol-B的要高。每个nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C都具有诱导生理学细胞死亡(编程性细胞死亡)的作用，从而除去不希望有的细胞如癌变细胞和已接近细胞寿命的老化细胞。此外，nymphaeol-B对革兰氏阳性细菌如金黄葡萄球菌和生孢子细菌如Genus氏杆菌具有抗菌作用。每个nymphaeol-A和nymphaeol-C都对革兰氏阴性细菌如大肠杆菌和上述的革兰氏阳性菌和生孢子菌具有抗菌作用。
根据第二实施方式的抗氧化剂包含选自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C中的至少一种作为活性成分(或抗氧化组分)。该抗氧化剂可作为防腐剂添加到食品饮料中以有效的抑制各种产品的变质(主要是氧化变质)，如油脂的氧化变质，香料的变质，色素的分解和褪色。在一个通过口摄取了含有该抗氧化剂的食品饮料如保健食品的活体中，每个nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C都具有除去活性氧以起到增强健康的作用，如肝功能增强作用，乙醛毒性的降低，低密度脂蛋白胆固醇(LDL)的抗氧化作用，抑制乳癌细胞扩散的作用，以及改善免疫功能。该抗氧化剂可包含在化妆品或准药物中使用。此时，它起到对皮肤、口腔等的美白作用和防老化作用等等。
根据第二实施方式的抗菌剂包含至少一种选自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C的物质来作为活性成分。该抗菌剂是加入到例如食品饮料中来使用的。在这种情况下用于防止食品饮料腐败。该抗菌剂可以加入到药物中使用，或可以作为例如传染病治疗药物或抗菌化疗的药物使用。该抗菌剂可加入到化妆品或准药物中使用。此时，其作用是保持皮肤、口腔、腋窝等处的清洁。
当该抗菌剂加入到食品饮料、药物、化妆品或准药物中使用时，这些产品中含有的nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C的总浓度优选为10ppm或更大，更优选15ppm或更大，进一步优选为30ppm至10,000ppm，尤其优选为50ppm至1,000ppm。其总浓度小于50ppm时，发挥的抗菌作用难以令人满意。相反，当浓度大于10,000ppm时则不经济。
根据第二实施方式的抗癌剂包含至少一种选自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C的物质来作为活性成分，其主要是作为药物使用。该抗癌剂剂量的确定要使得当nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C作用于癌细胞时其总浓度优选在0.1μM至100mM，更优选10至1,000μM。当其总浓度低于0.1μM时，疗效会很弱。相反，当浓度大于100mM时则不经济。
该抗癌剂的成人剂量以nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C计，优选0.5～10g每天，更优选2～5g每天。当nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C的日剂量小于0.5g时，抗癌作用难以充分发挥。相反，当日摄入量大于10g时则不经济。nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C的儿童剂量优选为成年人的一半。
当选自nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C的至少一种物质包含在食品饮料(如保健食品)、化妆品或准药物中时，这些产品能够通过促进对如癌变细胞等不希望有的细胞的生理消除来达到防癌效果。当产品为药物时，nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C在其中的总浓度优选为1至50％，更优选为10至30％。
根据第二实施方式的食品饮料包含至少一种选自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C的物质。这些食品饮料可以含有上述的抗氧化剂或抗菌剂。由于包含在食品饮料中的nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C的抗氧化作用，这些食品饮料能够除去体内活性氧，并因此作为能够发挥各种健康增强作用的保健食品使用。包含在食品饮料中的nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C还因其防变质作用而能够防止食品饮料的变质，从而提高了食品饮料的储藏稳定性，或籍其抗菌作用而防止食品饮料的腐败，从而提高食品饮料的储藏稳定性。因此，食品饮料的品质可在长时间内保持稳定。在食品饮料中的nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C通过其抗癌作用，促进了那些不希望有的细胞如癌变细胞和已接近细胞寿命的老化细胞的生理去除。因此这些食品饮料还可用作能够发挥极大的增进健康作用的保健食品使用。
该食品饮料的成人摄入量以nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C计，优选0.05～10g每天，更优选0.2～5g每天。当nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C的日摄入量小于0.05g时，抗氧化作用难以有效地发挥。相反，当日摄入量大于10g时则不经济。
第二实施方式具有以下优点。
由于nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C中任一种都具有抗氧化作用、抗癌作用和抗菌作用等，它们可以具有多种用途，包括食品饮料和药物。尤其是，虽然nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C中每一个是单一化合物，却能同时发挥多重和多种功效。因此，对于nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C中每一个都可用作以蜂胶为代表的多功能保健食品的原料这一点尤其值得注意。
此外，nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C还可用在类似于圣草酚的应用，以及亲脂性比圣草酚更高的各种应用中。由于nymphaeol-A，nymphaeol-B或nymphaeol-C包含在传统上用作保健食品原料的蜂胶中，在经口摄取和经皮肤摄入上不存在问题。
根据第二实施方式的抗氧化剂包含至少一种选自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C的物质作为活性成分，其中每个都具有高抗氧化作用。因此，当在食品饮料、化妆品或准药物中加入该抗氧化剂时，其能够防止这些产品的变质，从而提高储藏稳定性，并且当该抗氧化剂经口头摄取或皮肤摄入时能够在体内发挥健康增强作用和抗老化作用。
根据第二实施方式的抗菌剂包含至少一种选自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C的物质作为活性成分，其中每个都具有高抗菌作用。因此，当在食品饮料、化妆品或准药物中加入该抗菌剂时，其能够防止这些产品的变质，从而提高储藏稳定性，并且当该抗菌剂作为化妆品或准药物经皮肤摄入时能够发挥高保健作用和高除臭作用。该抗菌剂还可作为药物使用。
根据第二实施方式的抗癌剂包含至少一种选自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C的物质作为活性成分，其中每个都具有高抗癌作用。因此，该抗癌剂对癌症具有高的疗效，并具有防癌的效果。
第二实施方式的食品饮料(饮料或食品)含有至少一种选自nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C的物质，其中每个都具有抗氧化作用、抗癌作用和抗菌作用等。因此，对于该食品饮料，防止了其自身的变质和腐败，且在体内同时发挥多种有益功效，如健康增强作用、抗老化作用，新陈代谢增强作用和防癌效果。当食品饮料中nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C的含量设置在相对小的量时，很易得到其储藏稳定性只是因nymphaeol-A，nymphaeol-B和nymphaeol-C的防变质或防腐败作用而得到提高的食品饮料。
以下，将结合实施例对本发明加以更详细地描述。
<化合物的分离>
在50g冲绳蜂胶原料中加入500ml乙醇，而后超声处理数分钟。将该溶液在室温下搅拌一整夜，将残留物质过滤掉。将得到的提取液减压浓缩以得到39.73g的乙醇提取液。然后，在下述条件下对该乙醇提取液进行柱型色谱法分离，用下面(1)到(11)的淋洗溶剂淋洗得到11种馏分。
柱管玻璃柱，5.0×45cm填料硅胶，约590cm3淋洗溶剂(1)己烷∶乙酸乙酯＝90∶10(350ml)(2)己烷∶乙酸乙酯＝80∶20(220ml)(3)己烷∶乙酸乙酯＝70∶30(250ml)(4)己烷∶乙酸乙酯＝60∶40(1000ml)(5)己烷∶乙酸乙酯＝50∶50(200ml)(6)己烷∶乙酸乙酯＝40∶60(100ml)(7)己烷∶乙酸乙酯＝30∶70(100ml)(8)己烷∶乙酸乙酯＝20∶80(100ml)(9)己烷∶乙酸乙酯＝10∶90(100ml)(10)乙酸乙酯(200ml)(11)甲醇(700ml)当所得到的每个馏分在下列HPLC(高效液相色谱)条件1下分析时，已经证实用淋洗溶剂(4)淋洗得到的馏分(称作“第四馏分”)含有四种主要成分。
HPLC条件1柱YMC-Pack R&D ODS(4.6×250mm)溶剂A水(与2％的乙酸)，B乙腈(与2％的乙酸)淋洗条件0-60min(梯度淋洗；A∶B＝80∶20～20∶80)流率1ml/min检测280nm紫外线然后，该第四馏分在以下HPLC条件2下分离和净化，从而分离出化合物1(产率61.1mg)，化合物2(产率65.7mg)和化合物3(产率99.8mg)。此外，该第四馏分在以下HPLC条件3下分离和净化，从而分离出化合物4(产率20.0mg)。
HPLC条件2柱YMC-Pack R&D ODS(20×250mm)溶剂水(与0.1％的TFA)∶乙腈(与0.1％的TFA)＝40∶60流率9ml/min检测280nm紫外线HPLC条件3柱YMC-Pack R&D ODS(20×250mm)溶剂水(与0.1％的TFA)∶乙腈(与0.1％的TFA)＝20∶80流率9ml/min检测280nm紫外线<化合物1～4的鉴定>
每个化合物1～4的结构通过1H-NMR(核磁共振)，13C-NMR，MS(质谱)，IR(红外)光谱，UV(紫外)光谱等等分析。
(化合物1)化合物1的物理化学性质如图1所示。由ESI-MS测定证实化合物1的分子量为424。IR光谱显示，在3420cm-1处有一个羟基，在1680cm-1有一个羰基，由UV光谱显示出黄烷酮或黄烷醇的特征光谱，从而认定化合物1具有黄烷酮构架。由1H-NMR光谱积分值确认存在28个质子，由13C-NMR光谱观察到25个信号。由DEPT光谱识别出三个甲基、四个亚甲基、七个次甲基和十一个季碳原子。从上述结果可知化合物1的分子式是C25H28O6。此外，由图2的核磁共振数据，同时参照HSQC光谱，1H-1H COSY，HMBC光谱，CD光谱(圆二色性谱)等，认定化合物1是由上述结构式(2)表示的nymphaeol-B(5，7，3′，4′-四羟基-2′-C-香叶基黄烷酮)。尽管由Hernandia nymphaefolia(presl)Kubitzki分离得到该化合物已有报告，但是采用本研究的方法从蜂胶分离得到这种化合物则是首次。
(化合物2)化合物2的物理化学性质如图3所示。由ESI-MS测定证实化合物2的分子量为424。IR光谱显示，在3360cm-1处有一个羟基，在1680cm-1有一个羰基，由UV光谱显示出黄烷酮或黄烷醇的特征光谱，从而认定化合物2具有黄烷酮构架。由1H-NMR光谱积分值确证实存在28个质子，由13C-NMR光谱观察到25个信号。由DEPT光谱识别出三个甲基、四个亚甲基、八个次甲基和十一个季碳原子。从上述结果可知化合物2的分子式是C25H28O6。此外，由图4的核磁共振数据，同时参照HSQC光谱，1H-1H COSY，HMBC光谱，CD光谱等，认定化合物2是由上述结构式(1)表示的5，7，3′，4′-四羟基-5′-C-香叶基黄烷酮。该化合物是一个至今未在文献中有报导的新化合物。
(化合物3)化合物3的物理化学性质如图5所示。由ESI-MS测定证实化合物3的分子量为424。由IR光谱显示，在3380cm-1处有一个羟基，在1680cm-1有一个羰基，由UV光谱显示出黄烷酮或黄烷醇的特征光谱，从而认定化合物3具有黄烷酮构架。由1H-NMR光谱积分值确证实存在28个质子，由13C-NMR光谱观察到25个信号。由DEPT光谱证实存在三个甲基、四个亚甲基、七个次甲基和十一个季碳原子。从上述结果可知化合物3的分子式是C25H28O6。此外，由图6的核磁共振数据，同时参照HSQC光谱，1H-1H COSY，HMBC光谱，CD光谱等，认定化合物3是由上述结构式(3)表示的nymphaeol-A(5，7，3′，4′-四羟基-6-C-香叶基黄烷酮)。尽管由Hernandia nymphaefolia(presl)Kubitzki和Mimulus ctevelandii分离得到该化合物已有报告，但是采用本研究的方法从蜂胶分离得到这种化合物则是首次。
(化合物4)化合物4的物理化学性质如图7所示。由FAB-MS测定证实化合物4的分子量为492。由IR光谱显示，在3400cm-1处有一个羟基，在1640cm-1有一个羰基，由UV光谱显示出黄烷酮或黄烷醇的特征光谱，从而认定化合物4具有黄烷酮构架。由1H-NMR光谱积分值确证实存在36个质子，由13C-NMR光谱观察到存在有30个碳原子。由DEPT光谱证实存在五个甲基、五个亚甲基、七个亚甲基次甲基和十三个季碳原子。从上述结果可知化合物4的分子式是C30H36O6。此外，由图8的核磁共振数据，同时参照HSQC光谱，1H-1H COSY，HMBC光谱，CD光谱等，认定化合物4是由上述结构式(4)表示的nymphaeol-C(5，7，4′，4′-四羟基-6-(3，3-二甲基烯丙基)-2′-C-香叶基黄烷酮)。尽管由Hernandia nymphaefolia(presl)Kubitzki和Macaranga tanarius分离得到该化合物已有报告，但是采用本研究的方法从蜂胶分离得到这种化合物则是首次。
<测定在蜂胶中的含量>
为了解冲绳蜂胶中究竟含有多少化合物1～4，在下列HPLC条件4下作分析以确定每个化合物1～4的含量。结果是，经证实每100g冲绳蜂胶原料中含有12.7g的化合物1，10.5g的化合物2，13.5g的化合物3和9.1的化合物4。
HPLC条件4柱YMC-Pack R&D ODS(4.6×250mm)溶剂A水(与0.1％的TFA)，
B乙腈(与0.1％的TFA)淋洗条件0～50min(梯度淋洗；A∶B＝65∶35--0∶100)流率1ml/min检测280nm紫外线<DPPH自由基清除活性测试>
DPPH(α，α-二苯基-β-苦基肼基)是一个紫色稳定的自由基，在517nm处出现最大光吸收，并可通过获得氢而转变为无色肼。利用该显色反应便可确定每个化合物1～4的自由基清除活性。也就是说，将每个化合物1～4溶于乙醇中制得3ml浓度为25μM的样品溶液。其后，在每个得到的样品溶液中加入0.5mM的DPPH溶液0.75ml(溶剂是乙醇)并搅拌，在蔽光处反应一小时，然后测定其在517nm下的吸光率。此外，作为化合物1～4的替代，使用BHT(丁基化羟基甲苯)、α-生育酚或圣草酚以确定按照与上述相同程序的吸光率。此外，作为上述样品溶液的替代，使用乙醇作为对照以确定按照与以上相同程序的吸光率。每种原料的自由基清除活性(％)使用以下计算式1计算。结果如下列表1所示。顺便提及，表1中的每个值是运作三次得到的平均值及其标准偏差。
计算式1(自由基清除活性)＝[{(对照样品的吸光率)-(样品溶液的吸光率)}/(对照样的吸光率)]×100表1
由表1的结果显示，化合物1～4每个的自由基清除活性都比BHT的高，且基本上与α-生育酚的自由基清除活性相同。其中，化合物3的自由基清除活性最高，它与圣草酚的基本上相同。虽然化合物1、3和4都是已知原料，但对其自由基清除活性还未按惯例研究过。而本研究对化合物1、3和4各自非常高的自由基清除活性第一次得到了澄清。
<β-胡萝卜素褪色测试>
β胡萝卜素会因过氧化亚油酸(亚油酸自氧化的产物)与β胡萝卜素中的双键反应而褪色。利用该现象便可确定每个化合物1～4的抗氧化活性。也就是说，首先，将2ml的200mg/ml的Tween-40的氯仿溶液、0.4ml的100mg/ml的亚油酸的氯仿溶液和3ml的0.1mg/ml的β胡萝卜素的氯仿溶液混合，然后用氮气除去溶剂。随后，加入100ml的蒸馏水并充分搅拌以获得乳液。在3ml所得到的乳液中加入乙醇以完全溶解溶剂中的溶质。其后，将每个化合物1～4溶于乙醇以制备浓度为1.2mM的样品溶液。将50μl的样品溶液与上述溶质已完全溶解的乳液混合以制备反应液(或样品反应液)。于是每个化合物1～4在该反应液中的浓度为20μm。将该反应液在60℃下培养60分钟。然后测量每种反应液在培养前后对470nm的吸光率。此外，用BHT、α-生育酚或圣草酚替代化合物1～4以确定按照与上述相同程序的反应液在培养前后的吸光率。此外，作为对照，制备一种不含样品溶液的反应液(或对照反应液)以确定按照与上述相同程序的反应液在培养前后的吸光率。每种原料的抗氧化活性(％)用以下计算式2计算。结果由上述表1所示。顺便提及，表1中的每个值是运作三次得到的平均值及其标准偏差。
计算式2(抗氧化活性)＝[{(对照样的退色率)-(样品溶液的退色率))/(对照样的退色率)×100注意在计算式2中，“对照样的退色率”是对照反应液在培养前的吸光率除以培养后的吸光率再除以60所得到的值的自然对数；而“样品溶液的退色率”是样品反应液在培养前的吸光率除以培养后的吸光率再除以60所得到的值的自然对数。
表1的结果显示并证实，化合物2具有与BHT、α-生育酚和圣草酚大致相同的高抗氧化活性。
表1的结果显示并证实，化合物1～4中的任何一种都具有高抗氧化活性，在它们之中，化合物1、2和4具有与每个BHT、α-生育酚和圣草酚都大致相同的高抗氧化活性。虽然化合物1、3和4是已知材料，但对其抗氧化活性还未按惯例研究过。而本研究对化合物1、3和4各自非常高的抗氧化活性第一次得到澄清。
<抑制乳癌细胞扩散测试>
在培养乳癌细胞(MCF-7)时，如果加入具有促进细胞扩散作用的雌二醇(或17β-雌二醇)，能够在短期内促进乳癌细胞的扩散。利用这一现象来检测化合物1～4等对乳癌细胞扩散的抑制效果。也就是说，首先，用二甲基亚砜稀释每个化合物1～4以制备样品溶液。其后，在一个96格平皿的每个格中接种2×103个MCF-7，4小时后加入雌二醇和样品溶液。在每个格子中加入雌二醇以使雌二醇的最终浓度为0.1μm，而样品溶液的最终浓度为0.2μm，2μm，或20μm。在按预定时间(三或五天)培养后，将每个培养基换成新的培养基，在新的培养基中加入10％新培养基的量的酶溶液(细胞计数Kit-8Wako)。培养基在37℃的培养箱中保持两个小时以后，用分光光度计测定培养基在450nm波长下的吸光率(基准波长630nm)以对每个格中的活细胞数目定量。
对那些培养期定为五天的格子，在培养第三天时，培养基替换为一个新培养基，然后，在新培养基中加入雌二醇和样品溶液，继续培养至第五天。对那些培养期定为零天的格子，在细胞培养4小时之后向培养基中加入酶溶液。将该培养基在37℃的培养箱中保温两小时，然后测定吸光率。
作为化合物1～4的替代，圣草酚被用来测定按照与上述相同程序的吸光率，从而对每个格子中的活细胞数目定量。此外，用未加入雌二醇或样品的对照样1来测定按照与上述相同程序的吸光率，从而对每个格子中的活细胞数目定量，而使用未加入样品的对照样2来测定按照与上述相同程序的吸光率，从而对每个格子中的活细胞数目定量。
将对照样1在零天培养期后的活细胞数目假定量化为1，那么上述每轮操作量化得到的活细胞数目的相对值如表2所示。顺便提及，表2中的每个值是来自八个格子的平均值及其标准偏差。
表2
由表2的结果可以证实，化合物1～4每个都具有抑制乳癌细胞扩散的作用，并多少有些差异。此外还发现每个化合物1～4抑制乳癌细胞扩散的效果与其浓度相关。尤其是对于加入有20μM化合物3或4的格子，具有相对于对照样1更强的抑制乳癌细胞扩散的作用(即对乳癌细胞的细胞毒素效果)。尽管化合物1、3和4是已知材料，但对其抑制乳癌细胞扩散的作用还未按惯例研究过。而本研究对化合物1、3和4各自非常高的抗癌活性第一次得到澄清。
<关于乙醇提取物的抗菌活性试验>
用E.coli(IFO3366)作为革兰氏阴性细菌的生物指示剂，金黄葡萄球菌(IFO15035)作为革兰氏阳性菌的生物指示剂，蜡样芽胞杆菌(IFO15305T)作为具有甚至对加热消毒等处理都具有耐受性的生孢子细菌的生物指示剂，以及用从变质罐头食品中分离得到的凝结芽孢杆菌作为导致罐头食品变质的真菌的生物指示剂，从而对每个化合物1～4的抗菌活性加以评价。也就是说，首先，从蜂胶原料中提取的乙醇(见<化合物的分离>一节)溶于70％乙醇，然后，制备提取物浓度为0ppm，12.5ppm，25ppm，50ppm，100ppm或150ppm的标准琼脂培养基。随后，这些标准琼脂培养基经过高压消毒以制备评价培养基，每个生物指示剂在每个这样的评价培养基中接种以观察其生长发育。结果证实，乙醇提取液浓度越高，每个生物指示剂的生长发育被抑制得更强。尤其是当乙醇提取液浓度为30ppm或以上，或50ppm或以上时，在培养基中未检测到生物指示剂。顺便提及，先前已证实70％乙醇对每种生物指示剂的生长发育几乎没有效果。
<关于化合物1～4的抗菌活性试验>
用E.coli和Salmcnella enteritidis(S.en；NBRC3313)作为革兰氏阴性细菌的生物指示剂，金黄葡萄球菌(Sta.)作为革兰氏阳性菌的生物指示剂，以及用蜡样芽胞杆菌(B.ce)作为生孢子细菌的生物指示剂来评价每个化合物1～4的抗菌活性。也就是说，首先，将每个化合物1～4溶解于70％乙醇，然后，制备每个化合物1～4的浓度为0ppm，5ppm，10ppm，15ppm，20ppm或50ppm的标准琼脂培养基。随后，这些标准琼脂培养基经过高压消毒以制备评价培养基，每个生物指示剂在每个这样的评价培养基中接种。在接种每种细菌之后，测定每个皮式培养皿的细菌数目(CFU/皮式培养皿)。结果由表3和表4所示。
表3
表4
从表3的结果可以发现，化合物1或2的浓度越高，对革兰氏阳性菌和生孢子细菌的生长发育的抑制就更强。此外，还发现任何浓度的化合物1和任何浓度的化合物2对每个E.coli和S.en的生长发育几乎没有效果。此外，由此结果还发现，当化合物1或2作为抗菌成分包含在食品饮料、药物、化妆品或准药物中时，化合物1或2在这些产品中的浓度优选为10ppm或以上，更优选15ppm或以上。
从表4的结果发现，化合物3和4对任何生物指示剂都具有抗菌活性，尤其对E.coli，Sta.和B.ce具有很高的抗菌活性。此外，由此结果还发现，当化合物3作为抗菌成分包含在食品饮料、药物、化妆品或准药物中时，化合物3在这些产品中的浓度优选为10ppm或以上，更优选15ppm或以上。此外，由此结果还发现，当化合物4作为抗菌成分包含在食品饮料、药物、化妆品或准药物中时，化合物4在这些产品中的浓度优选为10ppm或以上，更优选50ppm或以上。注意，先前已证实70％乙醇对每种生物指示剂的生长发育几乎没有效果。
权利要求
1.一种黄烷酮化合物，其特征在于，该化合物由下列结构式表示
2.一种含有如权利要求1所述的黄烷酮化合物的抗氧化剂。
3.一种含有如权利要求1所述的黄烷酮化合物的抗菌剂。
4.一种含有如权利要求1所述的黄烷酮化合物的抗癌剂。
5.一种含有如权利要求1所述的黄烷酮化合物的食品饮料。
6.如权利要求5所述的食品饮料，其特征在于，所述食品饮料中所含的黄烷酮化合物的浓度为50ppm或以上。
7.如权利要求5所述的食品饮料，其特征在于，所述食品饮料中所含的黄烷酮化合物的浓度为50ppm到10,000ppm。
8.一种含有如权利要求1所述的黄烷酮化合物的化妆品。
9.一种含有如权利要求1所述的黄烷酮化合物的准药物。
10.一种含有如权利要求1所述的黄烷酮化合物的药物。
11.一种抗氧化剂，其特征在于，含有至少一种选自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C的黄烷酮化合物。
12.一种抗菌剂，其特征在于，含有至少一种选自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C的黄烷酮化合物。
13.种抗癌剂，其特征在于，含有至少一种选自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C的黄烷酮化合物。
14.一种食品饮料，其特征在于，含有至少一种选自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C的黄烷酮化合物。
15.如权利要求14所述的食品饮料，其特征在于，所述食品饮料中所含的黄烷酮化合物的浓度为30ppm或以上。
16.如权利要求14所述的食品饮料，其特征在于，所述食品饮料中所含的黄烷酮化合物的浓度为30ppm到10,000ppm。
17.一种化妆品，其特征在于，含有至少一种选自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C的黄烷酮化合物。
18.一种准药物，其特征在于，含有至少一种选自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C的黄烷酮化合物。
19.一种药物，其特征在于，含有至少一种选自nymphaeol-A、nymphaeol-B和nymphaeol-C的黄烷酮化合物。
全文摘要
本发明的抗氧化剂、抗菌剂、抗癌剂、食品饮料、化妆品、准药物和药物的每个部含有用下列结构式表示的新黄烷酮化合物(见图)或者，本发明的抗氧化剂、抗菌剂、抗癌剂、食品饮料、化妆品、准药物和药物中每个都含有至少一种选自nymphaeol－A、nymphaeol－B和nymphaeol－C的黄烷酮化合物。
文档编号C09K15/00GK1809551SQ20048001701
公开日2006年7月26日 申请日期2004年6月18日 优先权日2003年6月20日
发明者熊泽茂则, 中山勉, 下位香代子, 后藤崇辉, 福本修一, 新垣勉 申请人:百佳株式会社