一种制备颗粒状和薄片状荧光标记微塑料的方法与流程

本发明涉及一种制备颗粒状和薄片状荧光标记微塑料的方法，所制备的微塑料用于定性、定量分析不同形状的微塑料在环境介质和生物体内的分布和富集规律，可广泛用于各类微塑料的生态环境风险研究，属于高分子材料制备领域。

背景技术：

微塑料是指直径小于5mm的塑料颗粒。由于塑料产量逐年增加且其本身难以降解，导致塑料污染已经成为海洋中的一大难题。紫外辐射和机械磨损可以将塑料降解成小尺寸的微塑料，微塑料的潜在环境健康风险越来越受到重视。文献研究发现，在实际环境和生物体检测中发现，微塑料的形状多种多样，主要有纤维(棒状)，颗粒，片状，球形。来自渔网，绳索或衣服的塑料微纤维是水体中微塑料的普遍类型，其次是不规则形状的塑料碎片，颗粒和薄膜。受限于材料的获取，现阶段对微塑料的毒性研究主要针对球形，但是球形作为一个规则且非主要存在的微塑料不具代表性，因而有必要考察不同形状对微塑料在生物组织内富集分布和毒效应的影响。

材料的制备是不同形状微塑料研究的一项重要内容。目前普遍存在的制备材料的方法是，研磨，剪切，环境采样和从日常护理品中提取。这些方法所得的微塑料(1)粒径不均一，大小千差万别；(2)荧光强度弱，无法使用分子荧光光谱仪定量；(3)由于尺寸较大而不能被生物富集。且现有的方法费时费力，效率不高。

为了更好地研究微塑料在环境和生物体内的富集分布，评价微塑料的生态环境风险。本发明提供了一种快速制备不同形状的微塑料的方法，该方法所得到的微塑料相对均一，荧光强度较强，尺寸适合生物富集实验的需要，而且该方法可操作性强，效率高。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，现阶段关于微塑料毒性研究中使用形状均一的塑料微球不能很好地模拟环境中不同形状的微塑料的现状，提供一种制备颗粒状和薄片状荧光标记微塑料的方法，通过密炼法和粉碎法制备。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种制备颗粒状和薄片状荧光标记微塑料的方法，包括如下步骤：

(1)荧光标记：将塑料与染料混合，通过常规的密炼工艺，将染料与塑料混合后倒入转矩流变仪的给料口，在适当的温度下使得染料标记到塑料上；

(2)压片：将步骤(1)得到的荧光标记的塑料其中一部分荧光标记的塑料进行压片使其厚度为8～12μm；

(3)粉碎：使用高速粉碎机粉碎上述步骤(1)和步骤(2)得到的两种荧光标记的塑料，分别得到颗粒状和薄片状的荧光标记微塑料；

(4)过滤筛分：用溶剂分散步骤(3)得到的微塑料，采用尼龙滤网抽滤，分别得到不同粒径范围内的颗粒状和薄片状的荧光标记微塑料。

其中，步骤(1)所述密炼工艺可采用转矩流变仪或者密炼机，优选转矩流变仪，密炼温度为180～190℃，时间为5～8min；所述染料为脂溶性染料，优选thioindigo系染料；所述塑料为聚苯乙烯塑料(ps)、聚乙烯塑料(pe)、聚对苯二甲酸塑料(pet)和聚丙烯塑料(pp)中的一种或多种；所述染料与塑料混合的质量比为1:10～1:25。

其中，步骤(2)所述压片采用平板硫化机，温度为160～180℃，压力为3～5mpa，单次压片所用荧光标记的塑料质量为80～100mg；所述需要做压片处理的荧光标记的塑料占步骤(1)得到的荧光标记的塑料总质量的10～90％。

其中，步骤(3)采用高速粉碎机粉碎塑料，根据粉碎效果确定时间为3～5min，粉碎的次数≥3次。

其中，步骤(4)采用超声分散，强度为40～50khz，时间为5～8min；所述溶剂选自水或水与表面活性剂以适当比例混合的混合液中的任意一种；所述表面活性剂为吐温20、吐温40或吐温60中的一种。

根据想要得到的不同粒径范围的微塑料选用合适孔径的尼龙滤网，所述尼龙滤网选自孔径为50μm、40μm、30μm、20μm或10μm中的任意一种或多种。

采用以上制备方法所制备得到的颗粒状和薄片状荧光标记微塑料也在本发明的保护范围中。

采用以上制备方法所制备得到的颗粒状和薄片状荧光标记微塑料在研究微塑料在环境中和生物体内的富集分布的应用。

有益效果：

1、本申请所得到的微塑料荧光强度较强，且大小，形状相对均一，便于使用荧光显微镜和分子荧光光谱仪定性、定量分析不同形状的微塑料在环境介质和生物体内的分布和富集规律，可广泛用于各类微塑料的生态环境风险研究。

2、本申请采用的方法操作简单、方便、快捷，尤其与用剪刀手工剪切塑料纤维的繁重工作量相比更高效。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为本发明技术路线图。

图2为通过密炼工艺荧光标记的聚苯乙烯的成品图。

图3为荧光标记聚苯乙烯压片后的成品图。

图4为荧光显微镜下颗粒状荧光标记微塑料的效果图。

图5为颗粒状荧光微塑料的粒径分布图。

图6为颗粒状荧光微塑料溶液在550nm下的激发光谱图。

图7为颗粒状荧光微塑料溶液的标准曲线图

图8为颗粒状荧光微塑料在斑马鱼组织内的含量图。

具体实施方式

下面结合具体实施事例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。以下实施例中，转矩流变仪型号为haakepolylabosrheodrive7，产自thermoelectron(karlsruhe)gmbh；染料thioindigo购自阿达玛斯试剂有限公司；平板硫化机型号为gt-7014-p30c，产自高铁检测仪器有限公司；高速粉碎机型号为se-250g，产自上海转转电器有限公司；超声分散机型号为kh7200de，产自昆山禾创超声仪器有限公司。图1是本发明技术路线图。

实施例1

颗粒状和薄片状的聚苯乙烯荧光标记微塑料的制备：

(1)一次性将48g聚苯乙烯颗粒与1.92gthioindigo染料混合，注入转矩流变仪的给料口，设定温度为190℃，时间为5min，将聚苯乙烯进行荧光标记，所得的荧光标记的聚苯乙烯，如图2所示；

(2)每次取步骤(1)所得的荧光标记的聚苯乙烯约100mg，置于平板硫化机上进行压片，设定温度为180℃，压力为5mpa，将其压成厚度为10μm的片状塑料，如图3所示；

(3)使用高速粉碎机粉碎上述步骤(1)和(2)得到的两种荧光标记的聚苯乙烯，粉碎4次，每次粉碎5min，分别得到颗粒状的和薄片状的聚苯乙烯荧光微塑料；

(4)利用超声作用使得两种微塑料在水中分散好，超声强度为40khz，时间5min，分别用50μm，30μm，10μm的尼龙滤网抽滤，得到粒径范围在10～30μm的颗粒状(如图4所示)和薄片状的聚苯乙烯荧光标记微塑料。

实施例2

颗粒状和薄片状的聚乙烯荧光标记微塑料的制备：

(1)一次性将48g聚乙烯颗粒与3.6gthioindigo染料混合，注入转矩流变仪的给料口，设定温度为180℃，时间为6min，将聚乙烯进行荧光标记，所得的荧光标记的聚乙烯；

(2)每次取步骤(1)所得的荧光标记的聚乙烯约80mg，置于平板硫化机上进行压片，设定温度为160℃，压力为4mpa，将其压成厚度为8μm的片状塑料；

(3)使用高速粉碎机粉碎上述步骤(1)和(2)得到的两种荧光标记的聚乙烯，粉碎3次，每次粉碎3min，分别得到颗粒状的和薄片状的聚乙烯荧光微塑料。

(4)利用超声作用使得两种微塑料在水和0.0001％的吐温60混合液中分散好，超声强度为50khz，时间8min，分别用40μm，20μm，10μm的尼龙滤网抽滤，得到粒径范围在10～20μm的颗粒状和薄片状的聚乙烯荧光标记微塑料。

实施例3

颗粒状和薄片状的聚丙烯荧光标记微塑料的制备：

(1)一次性将48g聚丙烯颗粒与4.8gthioindigo染料混合，注入转矩流变仪的给料口，设定温度为190℃，时间为8min，将聚丙烯进行荧光标记，所得的荧光标记的聚丙烯；

(2)每次取步骤(1)所得的荧光标记的聚丙烯约90mg，置于平板硫化机上进行压片，设定温度为180℃，压力为3mpa，将其压成厚度为12μm的片状塑料；

(3)使用高速粉碎机粉碎上述步骤(1)和(2)得到的两种荧光标记的聚丙烯，粉碎5次，每次粉碎4min，分别得到颗粒状的和薄片状的聚丙烯荧光微塑料。

(4)利用超声作用使得两种微塑料在水与0.0002％的吐温20混合液中分散好，超声强度为50khz，时间6min，分别用50μm，30μm，20μm的尼龙滤网抽滤，得到粒径范围在20～30μm的颗粒状和薄片状的聚丙烯荧光标记微塑料。

实施例4

颗粒状聚苯乙烯荧光标记微塑料在生物体内的富集规律实验：

确定粒径分布：在荧光显微镜下统计实施例1制备得到的颗粒状聚苯乙烯荧光标记微塑料的粒径分布，得到粒径在0～10μm约占12％，10～20μm约占37％，20～30μm约占33％，30～40μm约占13％，40～50μm约占5％，如图5所示。

确定激发波长与发射波长：利用荧光光谱仪测得颗粒状微塑料悬浮液的发射波长和激发波长分别为550nm和584nm，如图6所示。

染毒实验：以制备好的荧光标记的颗粒状微塑料做为受试物，受试动物为成熟健康的斑马鱼(daniorerio，5月龄，0.29±0.022g)，随机分为染毒组和对照组，每组包含3个平行，每个平行使用5条鱼，染毒周期为：3天吸收阶段+3天清除阶段。对照组使用紫外消毒的曝气自来水，染毒组使用已经制备好的荧光标记的颗粒状微塑料，用与对照组一致的紫外消毒曝气自来水配置20mg/l微塑料悬浮液体系先暴露3天(吸收阶段)，后转移至与对照组一致的紫外消毒曝气自来水再暴露3天(清除阶段)。其他实验条件如下：温度：24±1℃，ph：7.2±0.5，溶解氧：6.6±0.3mg/l，电导率：0.256±0.005ms/cm，硬度：185±9mg/lcaco3。

样品采集：6天后，解剖染毒组和对照组斑马鱼，采集目标组织器官(肝、肠)，每个平行中5条鱼的组织混合作为一个样，冷冻干燥72h称干重，并做好记录。

组织消解：将干燥组织置于1ml浓硝酸中，70℃消解2h后用超纯水定容至5ml，得到待测样品溶液。

标准曲线：配置不同浓度梯度的荧光微塑料溶液，采用荧光光谱仪，设置激发波长和发射波长为550nm和584nm，测定各溶液的荧光强度，绘制标准曲线，如图7所示。样品测定：在550nm和584nm的激发和发射波长下，测定待测样品溶液的荧光强度，根据标准曲线计算相应浓度，浓度乘上定容后体积得到微塑料量。

含量换算：将得到的微塑料量与对应的组织干重作比，换算得到单位质量组织中微塑料的含量；其中染毒组样品的结果要扣除空白对照组背景值，结果得到最终结果，即颗粒状微塑料在斑马鱼组织中的富集量。绘制颗粒状聚苯乙烯荧光标记微塑料在斑马鱼组织中随时间的吸收与清除曲线，如图8所示。

本发明提供了一种制备颗粒状和薄片状荧光标记微塑料的方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。