专利名称：一株铜绿假单胞菌及其分离方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于环境技术领域，具体涉及一株铜绿假单胞菌(Α ^/ΟΜ^Μ aa/T^i/^m)，其在厌氧条件下具有高效腐殖质还原和多环芳烃降解活性。
背景技术：
多环芳经(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是指具有两个或两个以上苯环的一类有机化合物，包括萘、蒽、菲、芘等150余种化合物，有很强的致畸、致癌、致突变作用，具有水溶性差、稳定性强、毒性大、降解困难等特点，是广泛存在于环境中的一类持久性有机污染物。土壤作为环境中多环芳烃的主要归宿地和重要中转站，通过各种物理化学作用不断将多环芳烃化合物向周围环境释放。目前，多环芳烃污染土壤常规修复方法为物理化学方法，如光氧化法和化学氧化法，但都存在降解率低、耗时长、投资大、应用性差的缺陷。微生物修复是PAHs污染土壤修复的重要途径，具有成本低、效率高、不易造成二次污染等优点。现有研究结果表明，一些好氧微生物能够通过不同代谢机制将其降解、矿化，为生物修复PAHs污染土壤提供了可能。然而，土壤条件下PAHs污染的环境一般是无氧或者缺氧的，基于好氧微生物的原位生物修复技术具有明显的缺陷。因此厌氧原位生物修复技术成为PAHs污染土壤修复的重要途径。目前已有关于硫酸盐还原菌(Rothermich et al. 2002)和硝酸盐还原菌(Coates et al. 2001)在厌氧条件下降解PAHs的报道。腐殖质呼吸是近年来倍受关注的新型微生物能量代谢方式，它是指微生物以腐殖质为末端电子受体，通过氧化电子供体偶联腐殖质还原，并从这一过程中贮存生命活动的能量。腐殖质呼吸不仅与碳、氮、磷等元素的自然循环过程相偶联，而且显著影响有机污染物的厌氧降解行为。已有研究结果表明，腐殖质还原菌在污染物(如有机氯代物)厌氧降解体系中发挥着重要作用。经文献和专利检索，尚未发现关于厌氧条件下以腐殖质为电子受体，降解PAHs的铜绿假单胞菌的报道。
发明内容
本发明的目的是弥补现有技术的不足，提供一种厌氧条件下进行腐殖质还原及多环芳烃降解的高效菌株——铜绿假单胞菌菌株。本发明的另一个目的是提供所述铜绿假单胞菌的分离纯化方法。本发明还有一个目的是提供所述铜绿假单胞菌的在厌氧降解腐殖质和多环芳烃中应用。本发明所得的铜绿假单胞菌、Pseudomonas aeruginosa )PAH_1，于2011年4月21 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为=CGMCC No. 4773。本发明所述的铜绿假单胞菌PAH-I具有如下形态和生理生化特性 1)菌体形态特性
菌株PAH-I呈革兰氏阴性，直杆状(长1. 0 2. 0 μ m，宽0. 3 0. 5 μ m)，具有运动性。
2)菌落形态特性
在有氧LB琼脂平板培养4 后，菌落湿润，光滑，呈淡黄色，不透明，边缘整齐，并分泌绿色或者深褐色的称为绿脓素的色素，菌落直径2-3mm。3)生理生化特征
非发酵，兼性厌氧。可在41°C生长，在4°C不生长。3)分子生物学特征
采用SDS-蛋白酶K，氯仿-异戊醇(体积比M :1)抽提，0. 6体积异丙醇沉淀的方法提取细菌总DNA。采用细菌16SrRNA通用引物F27和R1492扩增细菌的16SrRNA，将PCR扩增产物回收后进行测序。再将得到的碱基序列在GenBank等国际核酸序列数据库内进行同源序列搜索(Blast search)，找出该菌株与数据库中同源性最高的模式菌株或保藏于ATCC 或DSM等国际菌种保藏中心的菌株。根据比对结果，该菌株与铜绿假单胞菌的16SrRNA序列具最高同源性。结合上述的生理生化特性、16S rDNA序列比对结果，本发明菌株应归属于铜绿假 1 (Pseudomonas aeruginosa ) 0本发明同时提供了所述铜绿假单胞菌的分离纯化方法通过微生物燃料电池的阳极生物膜进行分离纯化得到的。具体分离纯化方法包括以下步骤
1)取微生物燃料电池的阳极生物膜接种于液体分离培养基中；
2)排除已接种液体分离培养基中的氧气，厌氧培养，观察培养液的颜色变化情况；
3)当培养液颜色从无色变橙黄色时，将培养液转接至另一新鲜的液体分离培养基，继续厌氧富集培养3次；
4)将富集培养的菌株进行分离与纯化。本发明所述的铜绿假单胞菌在厌氧条件下能够利用腐殖质作为电子受体氧化降解多烃芳烃(菲)，葡萄糖或果糖与菲共代谢条件下可显著提高菲的降解速率，可广泛应用于轻度多环芳香烃污染土壤原位生物修复。
图1是菌株PAH-I 16S rRNA系统发育树；
图2是PAH-I利用不同电子供体还原腐殖质模型物AQDS的效果； 图3是菌株PAH-I以AQDS为电子受体时对菲的厌氧降解效果。
具体实施例方式菌株PAH-I的富集和分离
1)从PH为7的污泥微生物燃料电池中取5mL阳极液接种于50mL液体分离培养基中， (污泥微生物燃料电池的构型如CN200910041235. 4所述)，液体分离培养基的组成是每升液体分离培养基中含1. Og多环芳香烃(电子供体)、16g 2，6- 二磺酸钠蒽醌(即AQDS，电子受体)、2.5g NaHC03、0.25g NH4C1、0. 678g NaH2PO4 · 2H20、0. Ig KC1、10. OmL 维生素溶液、 10. OmL微量元素溶液。其中，维生素溶液是每升去离子水中含2. Omg生物素、2. Omg叶酸、 B6 10. Omg维生素、5. Omg硫胺素、5. Omg核黄素、5. Omg烟酸、5. Omg泛酸钙、0. Img维生素
4B12、5. Omg对氨基苯甲酸、5. Omg硫辛酸；微量元素溶液是每升去离子水中含1. 5g氨三乙酸、3. Og MgSO4 · 7Η20、0· 5g MnSO4 · H2OU. Og NaCl、0. Ig FeSO4 · 7Η20、0· Ig CoCl2 · 6Η20、 0. Ig CaCl2、0. Ig ZnSO4 · 7Η20、0· Olg CuSO4 · 5Η20、0· Olg AlK(SO4)2 · 12Η20、0· Olg H3BO3> 0. Olg Na2MoO4 · 2Η20 ；
2)往已接种污泥微生物燃料电池阳极液的液体分离培养基中鼓冲氮气不少于30分钟，鼓气完毕盖橡胶盖加铝盖密封，置于厌氧工作站(队/0)2=80/20)，30°C静置培养，观察培养液的颜色变化情况；
3)当培养液颜色从无色变为嫩黄色时，以10%的接种量将培养液转接至另一新鲜的液体分离培养基，厌氧操作及厌氧培养条件同2 )，如此富集培养三次；
4)将第四代反应后的培养液采用稀释平板法进行适当稀释，将稀释后的培养液0.1 mL 均勻涂布于LB固体培养基上，置于厌氧工作站(^/C02=80/20)30°C培养48h，挑取单菌落进行单菌落分离与纯化，其中，所述LB固体培养基的组成是蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L， NaCl 10 g/L，琼脂粉 20 g/L，pH 为 7. 0。所得菌株即为铜绿假单胞菌G^ei/i/offloftas aerw^/flosa )PAH_1，于2011年4月21 日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No. 4773。WHPseudomonas aeruginosa ) PAH-I 的生理生化特征
根据《伯杰细菌鉴定鉴定手册》第九版所述的标准程序测试菌株的生理生化特征。菌株为非发酵型兼性厌氧菌，生长温度为4-41°C生长，高于41°C、低于4°C不能生长。菌株可利用葡萄糖、果糖或多环芳香烃如菲等作为碳源。其它生化特征见表1。
权利要求
1.铜绿假单胞菌菌株PAH-I，其保藏号为CGMCCNo. 4773。
2.权利要求1所述铜绿假单胞菌菌株PAH-I的筛选方法，包括如下步骤1)取微生物燃料电池的阳极生物膜接种于液体分离培养基中；2)排除已接种液体分离培养基中的氧气，厌氧培养，观察培养液的颜色变化情况；3)当培养液颜色从无色变橙黄色时，将培养液转接至另一新鲜的液体分离培养基， 继续厌氧富集培养3次；4)将富集培养的菌株进行分离与纯化。
3.权利要求1所述铜绿假单胞菌菌株PAH-I在厌氧降解多环芳烃中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种可降解PAHs的铜绿假单胞菌菌株PAH-1，其保藏号为CGMCC No.4773。本发明的铜绿假单胞菌在厌氧条件下能够利用腐殖质为电子受体，氧化降解多环芳烃，葡萄糖或果糖和菲共代谢条件下可显著提高菲的降解速率，可广泛应用于轻度多环芳香烃污染土壤原位生物修复。
文档编号B09C1/10GK102296037SQ201110198819
公开日2011年12月28日 申请日期2011年7月15日 优先权日2011年7月15日
发明者周顺桂, 王跃强, 袁勇, 马晨 申请人:广东省生态环境与土壤研究所