一种去除污水中抗生素抗性基因的方法与流程

本发明涉及一种去除污水中抗生素抗性基因的方法。属于污水净化处理技术领域。

背景技术：

目前，抗生素在医疗、养殖及制药等行业中的滥用不断加重，导致了细菌对抗生素产生抗性，为细菌性疾病的防控和治疗带来极大困难。抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes,ARGs)作为一种新型环境污染物，是细菌获得抗性的重要因素之一，ARGs的产生主要来自基因的诱导突变和水平转移。环境中的诱变剂如抗生素、重金属等会诱导细菌突变产生ARGs，这类获得抗性的抗性细菌将在不同环境介质间进行增殖和传播。抗性细菌所携带的ARGs通过转化、转导和接合等基因的水平转移作用，与质粒、转座子、整合子、嵌合基因等可移动基因元件结合，从而在种内、种间传播扩散。ARGs具有可迁移性和持久存在性，在环境中难以被降解和去除，而ARGs进入食物链后会借助微生物作为载体，在食物链不同层级间转移扩增，对宿主生物造成潜在危害。污水处理系统是ARGs进入自然环境的主要途径和潜在存储库。有效去除污水中ARGs是实现污水再生回用的关键问题，污水再生回用是全球范围内水资源持续利用重要策略。在控制抗生素抗性传播，和避免抗生素抗性的潜在生态风险方面发挥重要作用。

我国是抗生素生产和使用大国，抗生素生产、医院、养殖产生的废水和市政污水中ARGs检出丰度较高，现有城镇污水处理厂多采用传统活性污泥法等传统污水处理技术，其处理目标主要定位于碳氮磷等常规污染物的去除，对污水中ARGs的去除能力十分有限，部分种类的ARGs检出率、丰度和多样性甚至有所升高。在污水处理厂中未能去除的ARGs通过出水排放进入受纳水体，我国不同水体和水环境中已检出了较高浓度ARGs。

现有去除污水中ARGs的技术主要包括：基于紫外和氯化的消毒技术，通过投加铝盐和铁盐实现的混凝沉淀技术，混凝沉淀与消毒联合处理，以及一些流程复杂的复合处理技术(包括“混凝沉淀-生化处理-过氧乙酸消毒-高压CO₂消毒-纳米二氧化钛催化-沉淀”和“格栅过滤-沉淀分离-Fenton氧化-UV/H₂O₂氧化-消毒”等)。这些现有技术都需要增设大量水处理单元、设备，并需投加大量化学药剂，极大地增加了处理成本、占地面积和运行管理难度；同时，当进水的水量和水质波动较大时，如未及时调整消毒剂的剂量或者混凝剂的投加量，处理流程的出水存在ARGs泄露风险；另外，为达到较好的ARGs去除效果而向污水厂二级出水中过多投加化学药剂，将会对收纳水体造成二次污染。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种处理效果好、运行简便稳定的去除污水中抗生素抗性基因工艺。用该方法解决了目前污水净化处理工艺对于ARGs去除存在的处理效果欠佳、处理成本高、运行管理复杂等难题。

为了达到上述目的，本发明通过对现有污水厂的调查，发现膜生物反应器(MBR)较长的固体停留时间和较高的活性污泥浓度等特点，都十分有助于处理难降解污染物。此外膜组件的膜截留作用和膜污染物的吸附作用能有效拦截小分子污染物。本发明采用生物处理和膜技术联合工艺去除污水中ARGs，通过优化调控MBR生物过程和运行参数，达到较好的ARGs去除效果。

本发明具体步骤如下：

A，构建缺氧/好氧-膜生物反应器(A/O-MBR)，向缺氧/好氧-膜生物反应器(A/O-MBR)接种城市污水处理厂曝气池中活性污泥后，采用人工配制模拟城市污水进水中待测ARGs相对丰度为1.11拷贝数/16S rRNA序列条数，启动缺氧/好氧-膜生物反应器运行；

上述步骤A中的构建缺氧/好氧-膜生物反应器(A/O-MBR)，缺氧/好氧-膜生物反应器中缺氧区和好氧区的有效容积之比为2：1；在A/O-MBR系统出水泵前增加真空压力表；好氧区内的膜组件使用孔径为0.1μm的聚偏氟乙烯平板膜，采用浸没式运行方式，膜组件下方设置底部穿孔曝气管，膜组件中部位置设置微孔曝气头构成供氧方式，控制曝气的气：水＝50：1；使用蠕动泵作为抽吸动力将待处理污水从膜的两侧跨膜抽吸进入膜内部，膜过滤后出水通过真空压力表以恒定膜通量和间歇循环方式出水，每一个间歇循环为过滤10min，停歇2min；

上述步骤A中的接种污泥取自上海市曲阳污水处理厂曝气池，接种污泥MLSS(g/L)为4.8，VSS(g/L)为3.70，SVI(mL/g)为162.5，DO(mg/L)为6.4～6.5，pH为3.5～4.5，温度(℃)为25±1；

上述步骤A中的进水采用人工配制模拟城市污水，以乙酸钠为碳源，氯化铵为氮源，磷酸二氢钾为磷源，控制COD为350～400mg/L、总氮为30～50mg/L、总磷浓度为10mg/L，人工模拟污水具体组分：780mg/L CH₃COONa，230mg/L NH₄Cl，43mg/L KH₂PO₄，8mg/L FeSO₄，102mg/L MgSO₄，42mg/L CaCl₂和0.5mL/L微量元素液(每升微量元素液中含有0.2g H₃BO₃，0.2g CoCl₂·6H₂O，0.06g CuSO₄·5H₂O，2g FeCl₃·6H₂O，0.22g MnCl₂·2H₂O，0.2g ZnSO₄·7H₂O，0.06g KI，0.12g NiCl₂)；人工配置污水中ARGs丰度平均为1.26×10⁸拷贝数/mL。

B，定期检测系统的污染物去除率，调整运行参数，稳定A/O-MBR运行状态，控制膜通量为15L/m²/h，污泥停留时间设为60d，水力停留时间设为6h，好氧区MBR池悬浮固体浓度MLSS为8～12g/L，活性污泥从好氧区至缺氧区内回流比为250～300％，反应运行温度控制在25±1℃，缺氧区搅拌转速为200～250r/min；当真空压力表压差到达40kPa时，关闭蠕动泵停止进水，作为一个过滤周期，将膜组件换洗，先进行物理清洗，再用0.5％NaClO进行化学清洗，减小膜面污染物浓度；

C，检测膜面污染物组分，其中细菌溶解性微生物代谢产物(Soluble Microbial Products，SMP)组分浓度为20～35mg/m²，细菌胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances，EPS)组分浓度为150～300mg/m²时，既能保证膜生物反应器较高的出水流量，同时也能达到强化ARGs吸附拦截的效果，出水中ARGs丰度下降2～5个数量级，ARGs去除率高达93.7％；

本发明的有益效果是：

(1)本发明通过将膜技术和生物处理技术结合，使污水中的ARGs一方面能够被MBR中活性污泥吸附降解，另一方面，MBR膜面适量污染物能够较好地吸附并拦截ARGs，避免小分子胞外游离ARGs穿透膜孔泄露于出水中，可有效去除污水中ARGs污染，避免受纳水体的ARGs污染；

(2)本发明通过检测MBR膜面污染物中各组分的浓度，确定了膜面有机污染物对强化去除污水中ARGs所需的最佳浓度，较好保证了ARGs去除效果，弥补了传统活性污泥法出水中存在较高ARGs泄露风险的不足，避免了现有高级处理工艺的流程复杂、化学药剂投量大、运行管理复杂等弊端；

(3)本发明整个工艺流程操作运行简单，易于实现，且自动化程度高，便于工业化应用，相比于现有ARGs去除工艺，本发明在处理流程的运行管理方面更加便捷高效，且无需额外投加化学药剂，降低了污水处理过程中的二次污染，且有效节省了运行管理费用。

(4)该方法重点处理新型环境污染物ARGs，符合污水深度处理与回用的需求，符合促进经济、社会和环境可持续发展的国家重大需求，利用膜生物反应器技术在污水处理中的应用有效去除污水中ARGs，为污水深度处理和水质安全保障提供理论支持和技术保障。

附图说明

图1是本发明去除污水中ARGs的处理工艺流程图；

图2是本发明目标抗性基因相对丰度的沿程分布图。

具体实施方式

A，构建本发明缺氧/好氧-膜生物反应器(A/O-MBR)，A/O-MBR反应器运行工况如表1；

表1 A/O-MBR器运行工况

向A/O-MBR中接种取自上海市曲阳污水处理厂曝气池中活性污泥，接种污泥基本性质指标见表2。

表2接种污泥基本性质指标

进水采用人工配制模拟城市污水(进水中待测ARGs相对丰度为1.11拷贝数/16S rRNA序列条数)，通过调整曝气流量、膜通量、固体停留时间等运行参数，稳定A/O-MBR的运行状态；

本实施例以人工合成模拟城市生活污水作为净化对象(进水中待测ARGs相对丰度为1.11拷贝数/16S rRNA序列条数)，包括以下步骤：

(1)采用实时定量荧光PCR检测处理流程中不同处理单元的目标抗性基因相对丰度(ARGs拷贝数/16S rRNA序列条数)；

(2)检测膜面有机污染物中各组分浓度，结合ARGs相对丰度，确定膜面有机污染物对强化去除污水中ARGs所需的最佳浓度；

(3)通过调整固体停留时间(SRT)、曝气流量、膜通量等运行参数，以及膜组件物理清洗和化学清洗频率等方式，使膜面污染物浓度最长时间地保持在去除ARGs所需的最佳浓度，从而强化系统对于ARGs的去除效果。

所述步骤A中采用膜组件下方设置底部穿孔曝气管，膜组件中部位置设置微孔曝气头的供氧方式，控制曝气的气水比为50：1左右。

所述步骤A中的聚偏氟乙烯PVDF平板式膜组件采用浸没式运行方式，使用蠕动泵作为抽吸动力，将进水从膜的两侧跨膜抽吸进入膜内部，并沿着抽吸管以恒定流量的方式出水。采用间歇出水方式：过滤10min，停歇2min。

所述步骤A中反应器进水采用人工配制模拟城市污水，以乙酸钠为碳源，氯化铵为氮源，磷酸二氢钾为磷源，控制COD、总氮和总磷浓度为350～400mg/L、30～50mg/L和10mg/L，人工模拟污水具体组分：780mg/L CH₃COONa，230mg/L NH₄Cl，43mg/L KH₂PO₄，8mg/L FeSO₄，102mg/L MgSO₄，42mg/L CaCl₂和0.5mL/L微量元素液(每升微量元素液中含有0.2g H₃BO₃，0.2g CoCl₂·6H₂O，0.06g CuSO₄·5H2O，2g FeCl₃·6H₂O，0.22g MnCl₂·2H₂O，0.2g ZnSO₄·7H₂O，0.06g KI，0.12g NiCl₂)；人工配置污水中待测ARGs丰度约为1.26×10⁸拷贝数/mL，待测ARGs相对丰度为1.11拷贝数/16S rRNA序列条数。

所述步骤A中，在A/O-MBR出水泵前安装真空压力表，以40kPa作为跨膜压差上限，当压差到达40kPa时，关闭MBR系统的抽吸动力装置蠕动泵，作为一个过滤周期。换洗的膜首先进行物理清洗，再用0.5％NaClO进行化学清洗。

所述步骤A中，A/O-MBR运行工况具体情况如下：膜组件的膜通量为15L/m²/h，固体停留时间SRT设为60d，水力停留时间HRT设为6h，好氧区悬浮固体浓度MLSS为8～12g/L，活性污泥从好氧区回流至缺氧区的内回流比为250～300％，反应运行温度控制在25±1℃，缺氧区搅拌转速为200～250r/min。

可以通过调整活性污泥的固体停留时间(SRT)、膜组件的物理清洗及化学清洗频率，优化控制系统膜面污染的程度。SMP(细菌溶解性微生物代谢产物)组分浓度为20～35mg/m²，细菌胞外聚合物(EPS)组分浓度为150～300mg/m²，系统既能保证较高的出水流量，同时也能达到强化ARGs吸附拦截的效果。

对上述实施例的结果进行检测分析，各类待测抗性基因的分析结果如图2。

(1)ARGs定量

沿程检测污水处理流程的不同单元中各类待测ARGs丰度变化情况，取样点设置在：进水口、缺氧区活性污泥、好氧区活性污泥、膜面污染物的泥饼层、膜片、出水口，具体检测分析方法如下。

1)DNA提取

DNA提取按照Fast DNA^TM Spin Kit for soil试剂盒厂家提供方法进行，具体步骤如下：

a)将冻干污泥样品或剪碎的滤膜放入裂解管E管中(Lysing Matrix E tube)，加入978μL磷酸盐缓冲液(Sodium Phosphate Buffer)和122μL MT缓冲液(MT Buffer)，使用涡旋振荡仪将混合液震荡混匀；

b)将E管于14000×g离心力下离心10min，将上清液转移至2mL离心管中，加入250μL蛋白质沉淀溶液(Protein Precipitation Solution)，并将离心管上下颠倒10次以混匀；

c)将2.0mL离心管于14000×g离心力下离心5min，将上清液转移至10mL离心管中；

d)摇匀DNA结合溶液(Binding Matrix)后，吸取1.0mL混合液加入c)中的10mL离心管中；

e)将离心管上下颠倒2min后，静置3min，使DNA附着于Binding Matrix上，并等待二氧化硅基质沉淀(这一步根据沉淀情况时间可以适当延长)；

f)小心去除500μL上清液，避免吸出沉淀物；

将剩余的上清液与沉淀物重新混匀，吸取600μL混合液至含SPIN^TM Filter的管中，以14000×g离心1min；

g)弃去收集管中的液体，重复上一步操作直至10mL离心管中的液体转移离心完；

h)将SPIN^TM Filter置于新的2mL离心管中，加入500μL SEWS-M，用枪头重新悬浊SPIN^TM Fliter管内颗粒，以14000×g离心1min；

i)再次将SPIN^TM Filter置于新的2mL离心管中，不加入任何溶液，然后以14000×g离心2min，离心后将SPIN^TM Fliter置于室温下5min；

j)将SPIN^TM Fliter置于新的1.5mL离心管中，加入100μL DES溶液，静置1min，以14000×g离心1min，收集下层离心管中的溶液即为提取并纯化完成的DNA。

2)DNA纯度和浓度检测

使用微量蛋白质核酸分析仪NanoDrop2000测定所提取DNA样品的纯度和浓度。具体操作步骤如下：

a)打开NanoDrop2000工作界面，选择核酸检测方式；

b)系统完成自检后，在上样孔内加2.5μL DES溶液，盖上盖板，单击blank调零；

c)用擦镜纸擦干上样孔后，在上样孔内加2.5μL待测样品，盖上盖板，单击measure进行检测，记录其浓度值、OD260/OD280和OD260/OD230比值。

3)检测所提取DNA样品完整性

使用琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA样品完整性。

a)检测前准备：将样品在冰上融化后，充分混匀并离心，取2μL样品进行检测。

b)检测参数：琼脂糖凝胶浓度为1％琼脂糖胶，检测电压为5V/cm，检测时间为30min。

4)普通PCR及质粒制备

使用普通PCR扩增所提取DNA中的ARGs片段，利用琼脂糖凝胶电泳观测PCR产物中是否存在目标ARGs的扩增产物，对于含有目标ARGs的PCR产物进行纯化后，进行质粒制备，所制备的质粒用于ARGs实时荧光定量PCR。普通PCR引物序列见下表1。

表1普通PCR引物序列表

5)ARGs实时荧光定量PCR

a)制备标准曲线样品

构建好的质粒经测序鉴定无误后，用紫外分光光度计测定质粒OD260值，并按下式换算质粒拷贝数：

质粒浓度换算公式(拷贝数/μL)＝质粒浓度(ng/μL)×6.02×10¹⁴/DNA分子量

将构建好的质粒10倍梯度稀释后作为qPCR标准品，标准曲线一般包含4～6个标准点，通过预实验分别选取标准品的10^-3～10^-7稀释液用于制备标准曲线。各质粒标准参数见下表2。

表2质粒标准品参数

b)荧光定量PCR反应步骤

采用的25μL qPCR反应体系包括：12.5μL 2×Green qPCR Master Mix混合染料，上下游引物各0.5μL(10μM)，2μL DNA模版，9.5μL ddH₂O。把加好样品的96孔板放在ABI 7500型荧光定量PCR仪中进行反应。反应后得到的结果可根据标准曲线计算出样品中的每种ARGs浓度。在实时荧光定量PCR技术中，Ct值表示反应管内的突光信号到达设定的域值时所经历的循环数，每个模板的Ct值与该模板的起始浓度的对数存在线性关系，起始浓度越高，Ct值越小。在利用已知起始浓度的标准品作出的标准曲线中，横坐标代表PCR产物浓度，纵坐标代表Ct值。利用未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始浓度。数据分析由Step One Software(version2.0)完成。qPCR热循环条件如下表3。

表3 qPCR热循环条件

6)ARGs去除效果

系统进水中各类待测总ARGs丰度平均为1.26×10⁸拷贝数/mL(相对丰度为1.11拷贝数/16S rRNA序列条数)，出水中ARGs丰度平均为7.90×10⁶拷贝数/mL，去除率高达93.7％(以相对丰度计，为99.4％)，说明采用该发明能很好处理含ARGs的生活污水，出水ARGs丰度下降2～5个数量级。

(2)膜污染物组分检测

在MBR膜污染的研究过程中，常将膜面有机污染物分为溶解性微生物代谢产物(Soluble Microbial Products，SMP)和胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances，EPS)。SMP、EPS等膜面污染物的吸附和拦截作用有利于去除污水中的ARGs，强化了MBR对ARGs的去除效果。优选地，控制膜面有机污染物中SMP组分浓度为20～35mg/m²，EPS组分浓度为150～300mg/m²，既能保证较高的出水流量，同时也能达到强化ARGs吸附拦截的效果。

经分析可知：

(1)ARGs在各处理单元中的去除规律

根据分析结果可知(图2)，从好氧区活性污泥到系统出水过程中，各类目标ARGs相对丰度基本呈下降趋势，各类目标ARGs在整个污水处理流程中的总去除率高达93.7％。

污水中的ARGs在从反应器进水至MBR好氧区的生物处理流程中得到了一定的去除，但是去除效果不够明显；而在从膜面泥饼层至反应器出水的膜截留和膜面有机污染物吸附截留的处理流程中，ARGs丰度得以显著下降，可见，生物处理、膜截留以及膜面有机污染物的吸附截留的结合能够有效去除污水中的ARGs污染。

其中，部分种类ARGs(例如sulⅡ等)在膜面泥层中的相对丰度高于好氧区活性污泥中的相对丰度，可能是由于MBR好氧池的穿孔曝气设备在膜面处形成较高浓度溶解氧，且膜面本身易吸附有机营养物质，使得部分携带ARGs的抗性菌在膜面上大量增殖，同时可移动基因元件促进了ARGs的水平转移和扩增，继而造成了ARGs相对丰度在膜面泥层处呈现不同程度升高。

(2)MBR好氧池污泥中ARGs与intI1相关性

细菌产生抗生素抗性的主要原因之一是通过基因水平转移获得外源性ARGs，大多数ARGs位于整合子、转座子和质粒等可移动基因元件上。虽然整合子本身不能移动，但可整合到细菌的质粒或染色体上，促进ARGs在细菌种内和种间水平转移。目前研究已发现至少5类整合子，其中质粒intI1最为常见。通过研究MBR好氧池污泥中ARGs与intI1相关性，可了解MBR好氧池污泥中ARGs的迁移性。

釆用Pearson单侧检验法研究intI1相对丰度和目标ARGs丰度变化的相关性，结果详见下表4。研究单个抗生素抗性基因相对丰度与intI1丰度之间的相关性发现，sulⅠ、tetC、tetX、ereA基因与intI1间均呈显著正相关性(P<0.01)，其中tetX的Pearson相关性系数R值最大(R＝0.755)。磺胺类sul、四环素类tet和总ARGs相对丰度与intI1丰度之间也均呈现显著正相关性(P<0.01)，Pearson相关性系数R值分别为0.518、0.543和0.749，表明MBR好氧池活性污泥中ARGs的广泛存在性和极高的可迁移性。

表4 MBR好氧池污泥中ARGs与intI1相关性

(3)ARGs相对丰度去除率与膜面污染物相关性

由于SMP和EPS含较多负电官能团(如SO₄^-、PO₄^3-、-COOH等)，且几乎所有活性污泥表面电荷都为负电，因此SMP和EPS几乎都带负电。而DNA分子上既带有负电的磷酸基团，腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶上的氨基又能被质子化而带正电荷，在细菌代谢产物吸附DNA分子的过程中，MBR体系中的阳离子(如Ca²⁺、Mg²⁺)在DNA分子的磷酸基团与SMP和EPS负电荷之间起到桥接作用。膜污染物中SMP和EPS可能通过与微生物表面、胞外小分子DNA片段的静电吸附和桥接作用强化对ARGs的吸附拦截。R语言Mantel检验分析膜面污染物组分浓度和ARGs相对丰度(拷贝数/16S rRNA序列条数)去除率的相关性结果详见下表5，可以看出，膜面污染物中SMP和EPS的浓度与ARGs相对丰度去除率均呈显著正相关(P<0.05，R>0)。分析结果表明该发明工艺不仅利用了MBR工艺在拦截小分子污染物和处理难降解污染物方面的固有优势，而且充分掌握和有效利用膜污染物对ARGs的吸附拦截作用，对去除污水中ARGs污染提供了高效的处理方法。

表5目标ARGs相对丰度去除率与膜面污染物相关性分析结果

优选地，控制膜面有机污染物中SMP组分浓度为20～35mg/m²，EPS组分浓度为150～300mg/m²，系统既能保证较高的出水流量，同时也能达到强化ARGs吸附拦截的效果。