专利名称：实时荧光pcr检测牛羊源性成分探针序列及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因的扩增与检测，特别涉及牛、羊源性成份的实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检测探针序列及试剂盒。
背景技术：
欧洲自1996年发生和传播疯牛病(Bovine SpongiformEncephalopathy，BSE)后，在国际上引起了广泛的重视。由于该病的发展与人类健康密切相关，科学界对此进行了大量和深入地研究。现已证实，疯牛病的病原体是一种“朊蛋白”，它导致绵羊患上一种被称“痒病”的慢性神经机能病，痒病传播到牛身上即导致了疯牛病。由于疯牛病至今尚无有效的治疗方法，免疫接种也不能预防这类疾病，因此许多国家陆续制定政策和法规，采取紧急措施，开展对疯牛病的普查和监测，加强对疯牛病的预防控制和管理，禁止从疯牛病疫区的国家或地区进口含牛、羊成份的制品(如饲料、血液制品、化妆品等)，以防范疯牛病的传入或控制其蔓延。
目前，动物源性成份的检测鉴别方法有物理、化学、免疫学和分子生物学方法(即聚合酶链式反应，PCR法)。其中尤其以分子生物学方法最为快速、灵敏。PCR方法又分为定性PCR和定量PCR方法。定性PCR已广泛应用于基于核酸的研究和临床诊断等领域，但这种检测方法依赖于不同程度的PCR后处理，容易因污染而产生假阳性，凝胶电泳使用的染色剂溴化乙锭(EB)为强烈的致癌物质，若操作不当，会危害实验人员的健康。
发明内容
本发明的目的旨在克服现有定性PCR技术的不足而提供一种高特异性、高灵敏性和高精确性、闭管检测、操作快速重现性好、抗污染且进一步降低假阳性率的牛、羊源性成份的实时荧光PCR检测探针序列和试剂盒。
本发明的原理是在定量PCR体系中，不仅有两条普通的引物，而且还加有一条荧光标记探针。这条探针的5’端和3’端分别标记了荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)。当这条探针保持完整时，R基团的荧光信号被Q基团所淬灭；一旦探针被切断，淬灭作用消失，R基团的荧光信号就可以被检测到。荧光的强度与PCR成正相关，收集荧光信号，从而可以检测出待测样品的初始拷贝数，判定待测样品中是否含有牛、羊源性成份。还可通过加入一系列已知浓度梯度的标准样品，建立标准曲线，还可对待测样品中的牛、羊成份进行定量检测。
本发明的目的是这样实现的所有探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团，两者可构成能量传递结构。
用于检测牛源性成份的荧光PCR检测探针的优选序列是5’-caatccagaactgacaccaac-3’，该探针的最大序列是5’-cttttatcacaatccagaactgacaccaacaaaaatat-3’，该探针最小序列是5’-ccagaactgacacc-3’。按上述探针序列生产制成的用于检测牛源性成份的实时荧光PCR检测试剂盒。
用于检测羊源性成份的荧光PCR检测探针的优选序列是5’-tgtcctttggtgttatgaat-3’，该探针的最小序列是5’-ctttggtgttat-3’，该探针用于检测山羊成份的最大序列是5’-gttcatgtttgtcctttggtgttatgaatacttattatt-3’，用于检测绵羊成份的最大序列是5’-ctcatgtctgtcctttggtgttatgaatgctcattatt-3’。按上述探针序列生产制成的用于检测羊源性成份的实时荧光PCR检测试剂盒。
本发明的优点是实时荧光PCR采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性。该技术巧妙地运用了PCR技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，使得本方法具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。
用于检测牛、羊成份的实时荧光PCR探针序列即可用于定性检测，又可用于定量检测。当作定性检测时，以阳性对照物为准，判定结果为阴性(未检出)或阳性(检出)；当作定量检测时，通过已知含量的标准样品，建立标准曲线，即可定量检测。
具体实施例方式
实施例1用于检测牛源性成份的实时荧光PCR检测的探针序列和试剂盒，检测牛源性成份。
检测基因牛线粒体DNA。
引物序列上游5’-gccatatactctccttggtgaca-3’，下游5’-gtaggcttgggaatagtacga-3’。
探针序列5’-caatccagaactgacaccaac-3’。
试剂盒应用该探针序列制成的用于检测牛源性成份的试剂盒。
实施例2用于检测羊源性成份的实时荧光PCR检测的探针序列和试剂盒，检测羊源性成份。
检测基因羊线粒体DNA。
引物序列上游 5’-tattaggcctcccccttgtt-3’，下游5’-ccctgctcataagggaatagcc-3’。
探针序列5’-tgtcctttggtgttatgaat-3’。
试剂盒应用该探针序列制成的用于检测牛源性成份的试剂盒。
检测主要仪器超净工作台、消毒灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机、低温冰箱，冷藏冷冻冰箱、纯水器、双蒸水器、旋涡震荡器、微量进样器(0.5μL，2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL)等。
检测主要试剂10×PCR缓冲液、MgCl2、dNTP(dATP、dUTP、dCTP、dGTP)、UNG酶(Uracil N-glycosylase)、Taq酶、引物和探针(按探针序列制成试剂盒)等。
提取DNA
(1)试剂盒法按说明书操作步骤进行。
(2)SDS法称2g样品于10ml离心管中，加入8m110％SDS和10ul/ml蛋白酶K提取液，56℃振荡消化1hr。2000rpm离心5min；取离心上清液，加等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混匀，静置5min；8000rpm离心5min；小心取离心上清液，加等体积氯仿/异戊醇(24∶1)混匀，静置5min；8000rpm离心理5min；取离心上清液加0.65倍体积的异丙醇，混匀，12000rpm4℃离心10min；弃去上清液，加500ul70％冰乙醇；12000rpm4℃离心5min；取沉淀，吹干(37℃约10 min)。加50ulddH2O溶解白色沉淀，此即为总DNA抽提物。4℃过夜，或37℃保温1hr后直接用于PCR或电泳测试。
实时荧光PCR检验所用引物和探针序列如实施例1、2所述。
实时荧光PCR反应体系
实时荧光定量PCR的反应参数为50℃/2min，预变性95℃/10min；95℃/15s，60℃/1min，40个循环(注不同仪器应将反应参数作适当调整)。
权利要求
1.用于牛源性成份检测的荧光PCR检测探针序列，其特征是该探针的优选序列是5’-caatccagaactgacaccaac-3’，探针的最大序列是5’-cttttatcacaatccagaactgacaccaacaaaaatat-3’，探针的最小序列是5’-ccagaactgacacc-3’。
2.用于羊源性成份检测的荧光PCR检测探针序列，其特征是该探针的优选序列是5’-tgtcctttggtgttatgaat-3’，最小序列是5’-ctttggtgttat-3’；用于检测山羊源性成份的荧光PCR探针的最大序列是5’-gttcatgtttgtcctttggtgttatgaatacttattatt-3’，用于检测绵羊源性成份的荧光PCR探针的最大序列是5’-ctcatgtctgtcctttggtgttatgaatgctcattatt-3’。
3.根据权利要求1、2、所述的用于牛、羊源性成份实时荧光PCR检测的探针序列，其特征是荧光报告基团标记在探针的5′端，荧光淬灭基团标记在探针的3′端，两者可构成能量传递结构。
4.根据权利要求1、2和3所述的探针序列，其特征是可以制成用于牛、羊源性成份实时荧光PCR检测的试剂盒。
全文摘要
本发明提供用于检测牛、羊源性成分的实时荧光PCR探针序列和试剂盒，给出检测牛、羊线粒体DNA基因的探针序列(包括最大、最小及优选序列)，按探针序列生产制成的试剂盒，用于牛、羊源性成分的定性和定量检测。本发明采用的实时荧光PCR技术采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性。该技术巧妙地运用了PCR技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，使得本方法具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。
文档编号G01N33/52GK1490609SQ0213495
公开日2004年4月21日 申请日期2002年10月15日 优先权日2002年10月15日
发明者曹际娟, 覃文 申请人:曹际娟, 覃文