专利名称：Hdppz配体的钌配合物作为单线态氧荧光探针的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及水溶液中单线态氧(1O2)的測定，具体涉及ー种吩嗪衍生物配体的钌金属配合物单线态氧荧光探针的制备及其应用。
背景技术：
单线态氧是氧分子处于高能激发态的ー种不稳定的存在形式，其化学性质很活泼，较基态氧更不稳定，是通常所说的活性氧物种之一。活性氧物种在正常的人体细胞中含量很少，在健康的人体中处于平衡状态，而且这些体内产生的活性氧对生命活动具有重要的作用，它们在体内參与多种多样的生理活动，如信号的传导，神经传递，肌肉紧张的调节、蠕动，血小板的聚合以及血压高低的调节，免疫系统的控制，学习记忆，能量的产生，细胞规律的分裂生长等。但是一旦这ー平衡被打破，它们就可能对人体产生伤害作用，导致 膜脂过氧化或脱脂化，造成膜差别透性丧失、离子大量外渗、代谢紊乱等一系列生理变化，严重时导致细胞死亡。单线态氧作为有机化学中ー种珍贵试剂，在许多光化学和光生物反应，如光降解、污染物的光转化、化学发光、生物体氧化老化、甚至是光致癌作用等过程中，都扮演着十分重要的角色。在有机合成中，单线态氧使得在高度立体专ー的有机化合物中引入氧变得极为容易。在生物体系中，单线态氧对生命体系有着重大的影响。单线态的生理学氧化作用越来越受到研究者的关注。单线态氧在细胞损伤和凋亡中起着重要的作用，它对机体可能造成强氧化性损伤，从而引起机体脂质过氧化作用的发生，导致生物膜、小动脉、DNA、蛋白质和中枢神经系统的损伤，加快机体的衰老和死亡，因此被认为是体内重要的毒性物种，能引发与氧化损伤有关的疾病，如白内障、肺水肿、糖尿病、肌肉萎缩、营养缺乏、精神病和肿瘤萌生等[(a)K. Briviba, L. O. Klotz, H. Sies, Toxic andsignaling efiects of photochemicalIy or cnemically generated singlet oxygenin biological systems, Biol. Chem.，1997，378，1259. b) J. R. Wagner, P. A. Motchnik，R.Stocker, H. Sies, B. N. Ames, The oxidation of blood plasma and low densitylipoprotein components by chemically generated singlet oxygen, J. Bio丄·しhem.，1993，268，18502. c)A. Gomes，E.Fernandes, JoseL. F. C. Lima, Fluorescence probes usedfor detection of reactive oxygen species，J. Biochem. Biophys. Methods. ,2005,65,45. ] o单线态氧在细胞的增生、分化、凋亡等调控中也起重要作用，被认为是一种新的第ニ信使[(a)R. W. Redmond, I.E. Kochevar, Spatially resolved cellular responses tosinglet oxygen, Photochem. Photobiol.，2006，82 (5),1178-1186. (b)N. L. Oleinick，R.L. Morris, I.Belichenko, The role of apoptosis in response to photodynamictherapy :what，where, why, and how, Photochem. Photobiol. Sci. , 2002,1，1-21.]。相反，也可以利用单线态氧的强氧化性来杀死体内的病毒细胞。科学家已经利用单线态氧这种强氧化性来治疗肿瘤，实验表明恶性细胞获取并结合单线态氧的敏化剂药物的能力显著地大于正常组织分子，这样通过光照后，药物分子产生的单线态氧就能选择性地杀死肿瘤细胞，这种光动力学治疗技术在肿瘤的诊断和治疗中具有广泛的应用前景，目前已应用于下生殖道癌前病变、原位癌和晩期恶性肿瘤，如外阴癌和卵巣癌等许多部位的诊断和治疗[a)D. G. J. E. J. D. Dolmans, R. K. J. Fukumura, timeline Photodynamic tnerapy for cancer，Nat.Rev. Cancer,2003，3，380.b)A.P.Castano，P. M. Mroz, R. Hamblin，Photodynamictherapy and anti-tumour immunity. Nat. Rev. Cancer，2006，6，535. c)N. Nishiyama，W. D.Jang, K.Kazunori, SupramoIecuIar nanocarriers integrated with dendrimersencapsulating photosensitizers for effective photodynamic therapy andphotochemical gene delivery. New J. Chem.，2007，31，1074. d)T. Oba，Photosensitizernanoparticles for photodynamic therapy. Curr. Bioact. Comp.，2007，3，239.]。医学上，用亚甲基蓝(methylene blue, MB)光敏化法产生的102来对血浆消毒和肿瘤的光动カ学诊断[L. C. Harber, A. S. Fleischer, R. L. Baer, Erythropoietic protoporphyria andphotohemolysis. J. Am. Med. Assoc.，1964，189，191.]。这种光动力学治疗技术在肿瘤的诊断和治疗中具有广泛的应用前景。单线态氧与人类健康和疾病密切相关，是当前生命科学和化学科学交叉研究的热点。由于单线态氧在光化学和光生物过程中具有如此重要的地位，102检测倍受关注， 特别是生物体系中1O2的检测越来越引起科研工作者的关注。研发高灵敏度和选择性好的单线态氧的小分子荧光探针具有重要意义，它能实时地给出单线态氧靶向细胞体系内生物大分子的重要空间分布信息，能够适时准确地检测体内单线态氧的含量，对于某些疾病的预防、诊断以及病理的研究都有十分重要的指导意义[K. Tanaka, T. Miura, N. Umezawa,Y. Urano, K. Kikuchi, T. Higuchi, T. Nagano, Rational design of fluorescein-basediluorescence probes，Mechanism-based design of a maximum fluorescence probe forsinglet oxygen, J. Am. Chem. Soc.，2001，123 (11)，2530.]。目前已报道的用于检测单线态氧的方法主要有以下几种(I)磷光光度法。磷光光度法的原理是处于激发态氧分子的单线态氧，其能量高于基态氧分子，电子由激发态跃迁回基态时，以光的形式释放能量而发出磷光。它利用单线态氧自身淬灭在1268nm处产生的近红外磷光进行检測，此法最直接，对生物体无侵害，选择性高，被认为是检测单线态氧的标准方法。但灵敏度低、检出信号弱、无法用于很低浓度1O2 的检测[K. Andersen, Z. Cao, P. R. Ogilby, L. Poulsen, I. Zebger, J. Phys. Chem. A. 2002，106,8488.]。(2)化学捕获吸光光度法。此方法是利用9，10- ニ苯基蒽(DPA)与1O2的特征性反应生成稳定的内过氧化物引起DPA吸收光谱的变化，通过检测DPA吸收光谱的变化来测量102，此法选择性好，灵敏度比1268nm磷光探测高[M. J. Steinbeck, A. U. Khan,M.J.Karnovsky, Extracellular production οι singlet oxygen by stimulatedmacrophages quantified using 9，I0-diphenylanthracene and perylene in apolystyrene film, J. Biol. Chem.，1993，268 (21)，15649. ] 该方法已被用于测定刺激性吞嗷细胞中的单线态氧的含量[a)M. J. Steinbeck，A. U. Khan,M. J. Karnovsky，Intracellularsinglet oxygen generation by phagocytosing neutrophils in response to particlescoated with a chemical trap. J. Biol.Chem.，1992,267，13425. b)M. J. Steinbeck，A.U.Khan, M. J. Karnovsky, Extracellular production of singlet oxygen bystimulated macrophages quantified using 9，10—diphenylanthracene and perylenein a polystyrene film. J. Biol. Chem. , 1993, 268,15649. ] 但是，此法是基于吸收光谱，所以灵敏度仍然较低。(3)有机突光探针法。典型的有机突光探针9, IO-Dimethylanthracene(DMA),DMA是ー种荧光化合物H = 375/436)，能选择性地与单线态氧反应生成其内过氧化物，本身荧光消失。近年来，利用荧光信号为检出手段的有机荧光探针法包括两类(a)利用1O2与带有蒽环的荧光素类探针分子专ー性反应，使得探针由原来的非荧光性分子变为强突光性分子，从而用于1O2的检测[N. Umezawa, K. Tanaka, Y. Urano, K. Kikuchi,T. Higuchi, T. Nagano, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1999, 38, 2899 ；K. Tanaka, T. Miura,N. Umezawa, Y. Urano, K. Kikuchi, T. Higuchi, T. Nagano, J. Am. Chem. Soc. 2001,123, 2530.]。该方法检测时间短，灵敏度高，但不适用于低pH值环境和实时检測。(b)利用荧光探针分子间的能量传递，激发探针分子发出强的迟滞荧光，进而用于检测1OJA. A. Krasnovskii,C. Schweitzer,H. Leismann, C. Tanielian,E. A. Luk’ yanets, Quantum Electron. ,2000,30,445 ；A. A. Krasnovskii, Μ. E. Bashtanov, N. N. Drozdova, 0.A. Yuzhakova,E.A.Luk’ yanets,Quantum Electron. , 2002, 32,83. ] 0这类探针主要有酞菁染料和紫菜嗪衍生物等，当接收 到单线态氧的能量后能在700nm附近发出荧光用于检測。(4)化学发光探针法。这是ー类基于光诱导电子转移机理的单线态氧荧光探针[X. H. Li, G. X. Zhang, H. M. Ma, D. Q. Zhang, J. Li, D. B. Zhu, J. Am. Chem. Soc. 2004,126，11543.]，这类探针检测速度快且具有很高的灵敏度和很好的选择性，但水溶性差，不利于生物体系中1O2的測定。(5)稀土荧光探针。袁景利小组基于稀土荧光配合物的长寿命荧光特征，制备了一系列稀土荧光探针，利用时间分辨荧光检测技术测定单线态氧已取得较好的效果[袁景利，宋波，王桂兰，谭明乾，ー种基于铕配合物的单线态氧荧光探针及其应用，中国发明专利，申请号200510130851. 9 ;袁景利，宋波，王桂兰，一种单线态氧铕配合物荧光探针及其应用，中国发明专利，申请号200510045768. I ;袁景利，宋波，王桂兰，一种铽配合物单线态氧荧光探针及其应用，中国发明专利，申请号200510045767. 7]，这类配合物的激发波长处于紫外区，测定1O2时，对生物体系有损伤[B. Song. G. L. Wang. M. Q. Tan. J. L. Yuan. NewJ. Chem. 2005，29，1431.]。我们最近报道了ー个铼(I)配合物的单线态氧荧光探针[Y. J.Liu，K. Z. Wang,Eur. J. Inorg. Chem.，2008，5214.]和ー个中国发明专利申请[王科志，刘艳菊，陈春辉，钌和铱金属配合物单线态氧荧光探针的制备及其应用，中国发明专利，申请号200810240591. 4]。这些配合物虽可在可见光激发下检测单线态氧，但无单线态氧存在时该配合物表现出较大的背景荧光，且水溶性、单线态氧的检测灵敏度与选择性仍需进ー步改迸。因此进ー步制备具有水溶性好、灵敏度高、选择性好，适用范围广，可见光激发的单线态氧荧光探针具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是开发荧光增强倍数大和1O2检测限低的新型1O2荧光探针。为实现上述目的，本发明的技术方案如下将含有Hdppz配体的钌配合物作为单线态氧荧光探针，对物质体系中的单线态氧进行定性和定量分析。所述钌配合物的结构通式为[RuAmLn]Xk，其中X为抗衡离子；L为6-轻基-ニP比P定并(3, 2-a 2 1 , 3 1 _c)吩嗪(6-Hydroxy-dipyrido [3, 2~a :21 , 3 1 _c]phenazine，简称Hdppz)，其结构如式I所示；A为N"N辅助配体；m = O或2，n = I或3，且m+n = 3 ；k = I 或 2。
权利要求
1.钌配合物[RuAm(Hdppz)Jxk作为单线态氧突光探针的用途，其中Hdppz是6-轻基-二吡啶并(3，2-a:2'，3' -c)吩嗪配体；A为N~N辅助配体；X为抗衡离子；m = O或2,η = I 或 3,且 m+n = 3 ；k = I 或 2。
2.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述A为联吡啶或邻菲咯啉。
3.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述X为负一价离子，选自Cl_，PF6-,ClO4-,NO3' BF;和 CF3SCV 中的一种。
4.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述钌配合物[RuAm(Hdppz)n]Xk是下列配合物la、Ib和Ic之一
5.如权利要求I 4任一所述的用途，其特征在于，利用所述钌配合物测定中性或碱性水溶液中单线态氧的含量，包括以下步骤 1)在已知的能有效产生单线态氧的中性或碱性溶液体系中加入所述钌配合物，在一系列的单线态氧浓度条件下，通过可见光激发测定体系的荧光强度和吸光度，得到相对应的荧光量子效率，获得荧光量子效率相对于单线态氧浓度的标准曲线； 2)在含所述钌配合物的中性或碱性缓冲溶液中加入一定量的待测溶液，通过可见光激发测定其荧光强度和吸光度，计算出荧光量子效率； 3)根据步骤2)测得的荧光量子效率的值，通过步骤I)获得的标准曲线确定待测溶液中单线态氧的含量。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述步骤I)和2)中荧光量子效率通过如下公式计算得出Φ s = cKtd (Astd/As) (is/Istd) (ns/ n std)2 其中，下标S和Std分别表示待测体系和标准物质，Φ为荧光量子效率，A为激发波长 处的吸光度，I为发射的荧光强度，n为溶液的折光率。
全文摘要
本发明公开了Hdppz配体的钌配合物作为单线态氧荧光探针的应用。该配合物以过渡金属钌为中心离子，以6-羟基-二吡啶并(3，2-a2′，3′-c)吩嗪(Hdppz)为配体，通过其羟基与单线态氧作用，使配合物的荧光强度发生很大的变化，进而进行单线态氧的荧光测定。该钌配合物用于检测单线态氧具有可见光激发，选择性好，灵敏度高，检测手段简单等优点，适宜中性和碱性体系中单线态氧的测定。
文档编号G01N21/64GK102827209SQ20111015937
公开日2012年12月19日 申请日期2011年6月13日 优先权日2011年6月13日
发明者王克志, 李奇, 刘艳菊, 尹红菊 申请人:北京师范大学