专利名称：一种检测猪痢疾的实时荧光pcr试剂盒及寡核苷酸序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种实时荧光PCR检测猪痢疾的试剂盒及其引物与探针，属于检验检疫领域。
背景技术：
猪痢疾(Swine dysentery ；SD)的病原体是一种革兰氏阴性的厌氧性螺旋体， 先后命名为是由猪痢疾密螺旋体(Treponema hyodysen teriae ； Τ. h )、猪痢疾蛇形螺旋体 QSerpulinahyodysen teriae ; S. h )。现在统一命名为猪痢疾短螺旋体 iBrachyspira hyodysen teriae ；B. h),目前猪痢疾密螺旋体这一名称由于历史的原因还被广泛使用。该病是猪的一种肠道传染病，以黏液性或黏液出血性腹泻为特征。在猪群中的发病率相当高，病猪生长发育受阻，耗料增加，给各地养猪业造成很大的经济损失。据统计病猪的饲料消耗率为正常猪的2倍，而增重率仅为正常猪的1/2。根据1983年Lyson的统计，为控制猪痢疾在饲料中添加的药物，每头猪花费2. 5-2. 8美元。根据Wood等(1988年)的计算，猪痢疾猪群的饲料消耗，每头上市猪要多花12. 6美元，同时每头猪还要多花费2. 4美元。在美国估计每年由于猪痢疾而损失6400万美元。该病遍布五大洲50多个国家和地区。在我国，许多省、市都有该病的存在，并且一旦传入猪群，若不采取严格的处理措施很难根除。1978年10月，上海口岸在从美国进口的451头商品猪的检疫中确诊猪痢疾后， 1979年初又在我国猪只中确诊猪痢疾，并从国内猪只分离得到猪痢疾短螺旋体纯培养，引起我国兽医界的重视，并被列入《中华人民共和国进境一、二类传染病》。在进出口的双边协议中美国、英国、澳大利亚、新西兰、荷兰、丹麦、爱尔兰、及日本等国的进口猪要求进行猪痢疾短螺旋体的检测。现有检测条件要求高(严格的厌氧培养)， 一般实验室很难满足检测的要求。到目前为止，该病还没有满意的简单可行的检测方法。在入境检测中采用行业标准SN/T 1207-2003《猪痢疾短螺旋体分离培养操作规程》，检验周期要两周时间，并且要求严格的厌氧培养监控，因此急需一种快速、敏感、特异性强的检测方法以替代或者补充该规程。Taqman荧光实时定量检测病原的技术具有灵敏度高、特异性强、快速诊断、高通量、操作简单、重复性好、自动化程度高、易标准化操作和试验的生物安全性高等突出优点， 灵敏度比普通PCR灵敏度高100倍以上，最大限度的避免了交叉污染，是国际上公认的快速准确技术之一，可检测到很微量的病毒核酸。我们已经将其应用到了禽流感病毒、新城疫病毒、猪链球菌以及口蹄疫病毒亚洲1型的检测领域，取得了很好的技术效果。TaqMan技术的要点是在普通PCR原有一对特异性引物基础上增加特异性的荧光双标记探针。该探针结合部位位于引物结合区域的中间。探针的5’端和3’端分别标记不同的荧光素，如5’端标记的荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团 (用R表示)，3’端标记的荧光素，在近距离内能吸收5’端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团(用Q表示)。当PCR反应在退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光信号；PCR反应进行到延伸阶段时，Taq酶在引物的引导下，沿着模板链合成新链；当链的延伸进行到探针结合部位时，此时的Taq酶发挥它的5’ 一 3’外切核酸酶的功能，将探针切成单核苷酸，与此同时标记在探针上的R基团游离出来，R所发出的荧光再不为Q所吸收而被检测仪所接收。PCR进行一个循环，合成了 N条新链的同时，就水解了 N条探针，亦释放了相应数量的荧光基团。仪器所接收到荧光信号的强度与PCR反应产物的量呈对应关系。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。如果以每一个PCR循环结束时所测得的荧光值为纵坐标，以PCR循环数为横坐标作图，即可得到一条连接每一个循环后荧光值的曲线一称为扩增曲线。当检测标本中含有所要检测病原体的核酸序列时，所得到的曲线呈“S”型；而当标本中不含病原体，则PCR过程不发生，探针不被水解，不产生荧光信号，其扩增曲线为一水平线。PCR扩增信号进入相对稳定对数增长期的最下限，通常设定在S型扩增曲线的增长拐点处附近，称为阈值线(Threshold)；而扩增曲线与阈值线交叉点的循环数称为Ct值。 样本中病原体的浓度越高，Ct值就越小。以此方法测定未知标本中的病原体核酸，不仅能快速定性，还因为荧光PCR本身先进的荧光信号检测系统和强大的信息处理能力，可以实现对病原体核酸的定量。实时荧光PCR技术具有高灵敏度和高特异性的优点，还可做到实时定量，具有快速、特异、敏感和较强防止交叉污染的特点，可检测到很微量的细菌。本发明的优点在于，与病原分离培养相比，1、实时荧光PCR更快、更便捷，细菌分离培养方法至少需要10天且培养条件苛刻，需要严格的厌氧培养，而荧光PCR仅需4小时； 2、由于病原为厌氧菌，如果采样及运输时间过长则对于少量感染的样品容易出现培养失败的现象，而荧光PCR检测的是核酸，在特异性相当的情况下可以有效地提高检测的敏感性。本发明在我国首次将实时荧光PCR技术应用于猪痢疾检测，提供了针对猪痢疾短 /密螺旋体特异性引物序列、探针序列、试剂盒和检测方法。与传统的病原分离方法相比具有快速高效的特点。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一组作为引物或探针使用的、检测猪痢疾的寡核苷酸序列。本发明要解决的第二个技术问题是提供一种特异、灵敏、高效的检测猪痢疾的试剂盒。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案
一组检测猪痢疾的寡核苷酸序列，为序列表SEQ ID No 1至序列表SEQ ID No 3所示的寡核苷酸序列；其中SEQ ID No :1和SEQ ID No 2为检验猪痢疾的引物对，SEQ ID No 3为猪痢疾的探针序列。详见表1。
表1.引物和探针序列
名称序列(5’ -3’)序列表编号引物IATGGTGCTATTGTAGTWGATACTSEQIDNO 1引物IIACCCATTCTTACAGCATTWGTSEQIDNO 2探针[FAM]-CTAAAGATC+CTGA+TG+TATTTGC-[TAMRA]SEQIDNo 3
注胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T) ；W代表A/T ； 其中，引物I和引物II分别为检测猪痢疾的正义引物和反义引物，探针为猪痢疾检测荧光探针，加号“ + ”后面的碱基需用LNA进行修饰，即第10、14、16位的碱基用LNA进行修饰，探针的5’端标记报告荧光基团FAM (6 一羧基荧光素)，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA。一种检测猪痢疾的实时荧光PCR试剂盒，保存于-20°c，由以下试剂组成
1)DNA提取液I:5mL/管X5管；其配制方法为PEG 8000 20. 74g，加NaCl 17. 53g，用三蒸水定容至IOOmL,分装5. OmL/管；
2)DNA 提取液 II 500 μ L / 管 X 1 管；其配制方法为 1. 0 mol/L Tris-Cl 2. OmL, 2. 0 mol/L KCl 5. OmL, 0. 5 mol/L EDTA 0. 5mL, NP-40 1.0 mL,用三蒸水定容至 lOOmL，分装 500 μ L/ 管；
3)PCR反应液，750μ LXl 管，包括1XPCR 缓冲液、3. OmM MgCl2、0. 2mM dNTP、 0. 2μΜ引物I、0. 2 μ M引物II和0.1 μ M探针；其中，引物I的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示，引物II的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :2所示，探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 3所示，探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA ； 第10、14、16位的碱基用LNA进行修饰；
4)Taq DNA 聚合酶 5 U/ μ L，15 μ LX 1 管；
5)无DNA酶的灭菌纯化水，ImLX1管；
6)阴性对照ImLX1管=DEPC水；
7)阳性对照lmLX1管；为猪痢疾短/密螺旋体nox基因片段，Ct值为20. 0 28. 0， 所述nox基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 4所示。本发明还提供了一种利用上述试剂盒检测猪痢疾的方法，包括如下步骤
1)提取样品DNA；
2)对提取的样品DNA进行PCR扩增
引物 I :5，-ATGGTGCTATTGTAGTWGATACT-3‘ (SEQ ID NO 1) 引物 II :5，-ACCCATTCTTACAGCATTWGT-3‘ (SEQ ID NO 2) 荧光探针为 5，-[FAM] CTAAAGATC+CTGA+TG+TATTTGC[TAMRA]-3‘ ； (SEQ ID NO 3) 第一步94°C 3 min, 1个循环；
第二步 94°C 10 sec, 55°C 5 sec,60°C 30 sec (收集荧光信号)，40 个循环。3)结果分析条件设定，读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。质控标准，阴性对照无以值并且无扩增曲线。阳性对照的以值应<30.0，并出现特定的扩增曲线。如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。结果描述及判定，阴性，无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无猪痢疾短/密螺旋体；阳性，Ct值<30.0，且出现特定的扩增曲线， 表示样本中存在猪痢疾短/密螺旋体。本发明中发明人以实时荧光PCR对模板进行检测，验证了该方法的特异性。实时荧光PCR与传统的分离培养法的比较实验的结果也表明，两种方法在检测上并没有明显差已升。本发明以通过对稀释的模板检测，开展了敏感性实验。实验结果显示，最低可以检测到IO2拷贝/反应的DNA模板量，具有较高的灵敏度。用该方法对7个猪场采集的318份猪粪拭子进行检测。实验结果表明，该方法是一种特异、灵敏、高效的检测方法。由此我们也可以得出结论，在大批量样本检测中，完全可以用实时荧光PCR方法，以达到减少工作量，提高工作效率，减少检测成本的目的。本发明的优点是实时荧光PCR技术被应用到猪痢疾检测中，进一步提高了检测的特异性、灵敏度，减少了工作量，提高了工作效率，而且还可以对目的片段进行定量检测。 通过反应条件的优化，该实时荧光PCR最低可检测至IO2拷贝/反应的细菌量。该方法还对7个猪场采集的318份猪粪拭子进行检测。实验结果表明，该方法是一种特异、灵敏、高效的检测方法。这项技术在进出境样品检疫和临床疫病的监控和诊断中都具有极大的应用前景。下面结合说明书附图和具体实施方式
对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
图1为实时荧光PCR反应体系优化后，得到的特异性扩增曲线；其中，1 阳性对照；2 阴性对照；
图2A为检测猪痢疾的实时荧光PCR检测试剂盒B. h七个标准菌株的特异性试验试验结果；其中，1 阳性对照；2 阴性对照；3-9 :B.h (ATCC编号依次为49526,27164,31287, 49527、49886、31212、49887)；
图2B为检测猪痢疾的实时荧光PCR检测试剂盒肠道致病菌特异性试验结果；其中，1 阳性对照；5 阴性对照；2 沙门氏菌；3 :B. i (ATCC编号:29796) ；4 猪链球菌(已灭活)； 6 大肠杆菌；
图3为检测猪痢疾的实时荧光PCR检测试剂盒的灵敏性检测结果；其中，1-7 =IO6-L 0 拷贝/微升(依次作10倍梯度稀释)；8 阴性对照。
具体实施例方式本发明所用 Brachyspira hyodysenteriae (B. h)、Brachyspira innocens (B. )Λ 大肠杆菌和沙门氏菌，均为北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心保存，灭活的猪链球菌由中国兽医药品监察所提供。实施例1 :Taqman探针和引物的设计与合成
根据Genbank中登录的猪痢疾密螺旋体的相关基因序列，用DNAMAN软件进行比对分析，分别选择nox基因高度保守的区域，用Express V2. 0软件，设计出针对猪痢疾密螺旋体的探针和引物。同表1。弓丨物和探针由上海旭冠生物技术有限公司合成。实施例2 猪痢疾短/密螺旋体DNA的提取用DNA提取试剂提取猪痢疾短/密螺旋体DNA。
具体操作如下
①取η个1. 5 mL灭菌离心管，其中η为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。②每管加入200 μ L DNA提取液I，然后分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照各200 μ L，一份样本换用一个吸头；混勻器上震荡混勻5 S。于4 °C 25°C条件下，13000 r/min 离心 10 min。③尽可能吸弃上清且不碰沉淀，再加入10 μ L DNA提取液II，混勻器上震荡混勻5 S。于 4°C 25°C条件下，2000 r/min 离心 10 S。④100 °C干浴或沸水浴IOmin ;5000 r/min离心5s,充分振荡一下，5000 r/min 再次离心k，加入90 μ L无DNA酶的灭菌纯化水，充分振荡后，5000 r/min离心5 min,上清即为提取的DNA，冰上保存备用。⑤提取的DNA须在2 h内进行PCR扩增或放置于_80 V冰箱。实施例3 实时荧光PCR的建立
一、对探针和引物浓度、镁离子浓度和酶浓度分别进行了优化，建立了实时荧光PCR 的反应体系。按照实施例2方法获得猪痢疾短/密螺旋体DNA，模板浓度约为IO4-IO6拷贝/微升，进行实时荧光PCR，优化反应体系。(1)探针和引物浓度的优化
对探针和引物分别进行优化。从0.1 μΜ至0.8 μΜ以0. 1 μΜ间距递增的引物浓度和从0.1 μΜ至0.5 μΜ以0. 1 μΜ间距递增的探针浓度交叉配比，进行实时荧光PCR，以选择最适的引物和探针浓度。反应体系件见表2，所用引物和探针序列见表1 表2引物探针优化PCR反应体系
权利要求
1.一组检测猪痢疾的寡核苷酸序列，其特征在于，其寡核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1M SEQ ID NO :3，其中SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO 2分别为检测猪痢疾的引物I和引物II，序列SEQ ID NO 3为检测猪痢疾的荧光探针。
2.根据权利要求1所述的检测猪痢疾的寡核苷酸序列，其特征在于所述探针序列SEQ ID NO 3的5’端标记报告荧光基团FAM，3，端标记淬灭荧光基团TAMRA，第10、14、16位的碱基用LNA进行修饰。
3.—种检测猪痢疾的试剂盒，其特征在于，由以下组分组成(1)DNA提取液I其配制方法为PEG 8000 20.74g，加NaCl 17.53 g，用三蒸水定容至 IOOmL ；(2)DNA 提取液 II 其配制方法为 1.0 mol/L Tris-Cl 2. OmL, 2. 0 mol/L KCl 5. OmL, 0. 5 mol/L EDTA 0. 5mL, NP-40 1. 0 mL,用三蒸水定容至 IOOmL ；(3)PCR反应液，包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、引物I、引物II和探针；(4)Taq DNA 聚合酶；(5)无DNA酶的灭菌纯化水；(6)阴性对照=DEPC水；(7)阳性对照为猪痢疾短/密螺旋体nox基因片段，所述nox基因片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 4所示；其中，引物I的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示，引物2的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO :2所示，探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :3所示，探针的5，端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA，第10、14、16位的碱基用LNA进行修饰。
4.根据权利要求3所述的检测猪痢疾的试剂盒，其特征在于所述PCR反应液为 IXPCR缓冲液、3. OmM MgCl2、0. 2mM dNTP、0. 2 μ M 引物 I、0. 2 μ M 弓|物 II 禾口 0.1 μ M探针。
5.一种检测猪痢疾的实时荧光PCR方法，其特征在于，包括如下步骤(1)提取样品DNA；(2)进行实时荧光PCR反应；(3)反应条件扩增条件为94°C/3min，1 个循环；94°C/lOsec，55°C/5sec，60°C/30 sec, 40个循环，每个循环结束时收集荧光；(4)阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整，质控标准，阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照的Ct 值应< 30. 0，并出现特定的扩增曲线，如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效；结果描述及判定，阴性，无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无猪痢疾短/密螺旋体，阳性，Ct值< 30. 0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在猪痢疾短/密螺旋体。
全文摘要
本发明公开了一种检测猪痢疾的实时荧光PCR试剂盒及核苷酸序列。所述一组检测猪痢疾的寡核苷酸序列，为序列表SEQIDNo1至序列表SEQIDNo3所示的寡核苷酸序列。本发明还提供了一种含有上述寡核苷酸序列的检测试剂盒。本发明的优点是实时荧光PCR技术被应用到猪痢疾的检测中，进一步提高了检测的特异性、灵敏度，减少了工作量，提高了工作效率，而且还可以对目的片段进行定量检测。通过反应条件的优化，该实时荧光PCR最低可检测至102拷贝/反应的病原量。该方法还对来自七个猪场的318份临床样品进行了检测。实验结果表明，该方法是一种特异、灵敏、高效的检测方法。这项技术在进出境样品检疫和临床疫病的监控和诊断中都具有极大的应用前景。
文档编号G01N21/64GK102373276SQ20111033047
公开日2012年3月14日 申请日期2011年10月27日 优先权日2011年10月27日
发明者乔彩霞, 凌凤俊, 吴丹, 安健, 张伟, 张利峰, 张鹤晓, 李宁, 柏亚铎, 汪琳, 蒲静, 谷强, 赖平安, 高志强 申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局, 中国兽医药品监察所, 北京农学院