一种肿瘤抑制基因或蛋白及其应用的制作方法

一种肿瘤抑制基因或蛋白及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种新的肿瘤抑制基因或蛋白及其在膀胱癌和肾癌中的临床和实验室研究的应用，特别是涉及CMTM8或其可变剪切体CMTM8-v2的基因或蛋白或它们的免疫性片段，CMTM8或/和CMTM8-v2或/和它们的免疫性片段在诱导膀胱肿瘤和肾肿瘤细胞凋亡中的应用、在制备治疗和/或抑制膀胱肿瘤和肾肿瘤的药物中的应用、包含CMTM8或/和CMTM8-v2的载体或药物组合物，以及应用于临床和实验室研究的检测CMTM8或/和CMTM8-v2或/和它们的免疫性片段的表达的试剂在膀胱肿瘤和肾肿瘤预后诊断和治疗方案确定中的应用。
【专利说明】一种肿瘤抑制基因或蛋白及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种肿瘤抑制基因或蛋白在肿瘤中的表达及其应用，具体地涉及 CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2的基因或蛋白或它们的免疫性片段在肾肿瘤及膀胱肿瘤 中的表达及其应用。

【背景技术】
[0002] 众所周知，凋亡在所有动物的发育和稳态中起十分重要的作用，决定一个细胞是 否处于凋亡状态的主要标志包括典型的细胞形态的改变以及一些生化和分子标志的改变。 就形态而言，凋亡细胞变圆、皱缩、脱落，染色体凝集并分布于核边缘。凋亡发生的主要生化 标志有：线粒体失去跨膜电位，质膜磷脂酰丝氨酸外翻，胱冬酶（caspase)的活化，蛋白质 如IAPs和聚ADP核糖聚合酶（PARP，Poly (ADP-ribose)polymerase)的酶切，基因组DNA的 片断化和线粒体质量以及f-肌动蛋白成分的改变等。
[0003] 在哺乳类动物中，胱冬酶是一组与细胞凋亡有关的蛋白酶。胱冬酶激活的一个主 要途径是细胞色素 c从线粒体的释放，胞浆中的细胞色素 c可与Apaf-I形成复合物，此复 合物可识别并酶切胱冬酶原-9,活化后的胱冬酶_9酶切并激活胱冬酶-3,从而引起细胞进 行一系列凋亡的形态改变。
[0004] 膀胱肿瘤和肾肿瘤对人类健康和生命构成重大威胁，肾肿瘤占成年人肿瘤发生率 的3-4%，据估计，2010年美国将约有58240例肾肿瘤新发病例，并将有13040例患者将死于 肾肿瘤。在过去30年里，肾肿瘤的发病率以每年3%的速度递增。
[0005] 膀胱肿瘤在世界范围内的发病率居恶性肿瘤的第九位，在男性排名第六位，女性 排在第十位之后。在我国，男性膀胱癌发病率位居全身肿瘤的第八位，女性排在第十二位以 后，发病率低于西方国家，但近年来，我国部分城市肿瘤发病率报告显示膀胱癌发病率有增 高趋势。
[0006] 膀胱癌和肾癌的治疗均首选手术治疗。但根据肿瘤的生物学特性，治疗方法有所 不同。
[0007] 目前用于膀胱癌治疗的方法是首选手术治疗，包括经尿道膀胱肿瘤切除术、经尿 道激光手术和光动力治疗。TUR-BT术后有10%?67%的患者会在12个月内复发，术后5 年内有24%-84%的患者复发。因此，所有非肌层浸润性膀胱癌患者术后均进行辅助性膀胱 灌注治疗。膀胱灌注化疗常用药物包括表柔比星、丝裂霉素、吡柔比星、阿霉素、羟基喜树碱 等。但是这些治疗方法的效果往往都不是很满意，患者应从性较差，并且复发率很高。术后 3年内复发率高达70%，而且复发者中约有三分之一的病例向更高级别和期别进展。
[0008] 肿瘤的治疗中，一个非常重要的问题是如何判断肿瘤的生物学特性。目前还没有 合适的生物学指标可以准确的预测膀胱癌的发展和预后。因此寻找具有早期诊断、有判断 预后价值的肿瘤标记物，并根据其生物学特点采取及时合理的治疗方法，提高膀胱癌患者 的总体生存率，一直是泌尿外科学者研究的重要课题。目前对膀胱癌预后因子的研究开发 虽已取得进展，但除了个别指标，对于多数指标的预后价值仍存在争议。
[0009] 随着现代生物技术特别是分子免疫学和分子生物学的发展以及对肿瘤发病机制 从细胞、分子水平的进一步认识，膀胱癌的分子生物学研究日益受到国内外学者的重视，并 且已有部分研究针对膀胱癌的分子治疗进行研究，包括免疫治疗，靶向治疗和基因治疗等。 [0010] 近年来，越来越多的证据显示，肿瘤的复发和进展与多种癌基因过度表达，以及肿 瘤抑制基因失活密切相关。目前对这些抑癌基因的研究还处于探索阶段，还需在膀胱癌大 样本中进行验证及在临床试验中进行有效性评估，以期寻找到更有利于膀胱癌早期诊断及 实现个体化治疗的抑癌基因，总之，进一步研究抑癌基因将有助于推进肿瘤研究，为临床诊 断和治疗提供新的方向和思路。
[0011] 目前用于肾癌治疗的方法是首选手术治疗。约30%的肾癌诊断时即发现远处转 移。术后患者约30%?40%发生远处转移。转移性肾癌对放化疗等治疗不敏感。预后较 差。中位生存期约13个月。尽管医疗技术、分子生物学水平的不断提高，使得肾癌的早期 诊断、治疗有了很大进展，但晚期肾癌的五年生存率仍未见明显改善。NCCN《肾癌临床实践 指南》认为肾癌术后目前尚无可推荐的标准辅助治疗方案。因此，开发针对肾癌的新的治疗 方法尤为迫切。
[0012] 近二十余年，基于免疫治疗的细胞因子、肿瘤抗原、树状突细胞的疫苗生物免疫治 疗在肾癌治疗中取得了许多进展。近年许多研究报道：包括干扰素、白细胞介素-2以及疫 苗、树突状细胞等进行了大量的临床试验，表现出很高的安全性和效果。尽管在这些试验中 取得了抗肿瘤免疫反应和显著临床成效，但回应率仍然偏低，仅仅少数患者表现出长期的 临床改善。
[0013] 人类基因组计划的研究成果给分子肿瘤学带来了巨大的影响，肿瘤的分子治疗已 开始进入临床。分子靶向治疗是指在肿瘤分子生物学的基础上，将与肿瘤相关的特异分子 作为靶点，再用针对靶分子特异制剂或药物进行治疗的手段。这种方法在取得明显疗效的 同时，又避免对正常细胞的损伤，具有高效、低毒的优点。
[0014] 分子靶向药物治疗使肾癌治疗变得更有针对性，有希望成为转移性肾癌的标准化 治疗，并可能用于早期肾癌的治疗，但同时面临着很多问题和挑战。如患者的适当选择，最 理想剂量和给药时间的确定，与免疫治疗等系统治疗联合应用的前景，能否作为局限型肾 癌术后标准辅助治疗方案，能否与传统抗体抗原等生物治疗及靶向基因治疗有效结合。
[0015] 故寻找能更好预测靶向治疗疗效的生物学标记物和影像学技术来指导个性化治 疗显得尤为迫切。毫无疑问肾癌治疗已进入了一个新时代，研究者需更加深人地研究肾癌 发生发展的分子通路，进行更为广泛的基础和临床研究，为肾癌治疗带来新的曙光。
[0016] 大型测序工作揭示了越来越多的驱动基因，影响肿瘤的发生和发展，为肿瘤的治 疗提供了更多的新靶点。可以预见，通过整合各种高通量平台，在不久的将来RCC病人肿瘤 的个体化治疗将会变成现实。基因疗法将会成为最有潜力的治疗手段。
[0017] 综上所述，对于膀胱肿瘤和肾肿瘤的治疗和诊断，成为现代医学需要解决的重要 课题。细胞凋亡异常是肿瘤发生、发展的重要因素，因此通过诱导肿瘤细胞凋亡来清除肿瘤 已成为当前肿瘤治疗的一个新的重要策略。
[0018] CMTM8 (CKLF-Like MARVEL Transmembrane Domain Containing8)的表达产物为 四次跨膜蛋白，具有MARVEL结构域（MAL and related proteins for vesicle trafficking and membrane link)。CMTM8功能研究证明CMTM8加速转铁蛋白受体、EGFR、c_MET的内化， 加速配体诱导的EGFR、c-MET从细胞表面的清除，抑制EGFR、c-MET活化信号及细胞增殖、 迁移、ERK磷酸化，并且超表达CMTM8可诱导肿瘤细胞凋亡。CMTM8-V2为CMTM8缺失exon2 的可变剪接体。CMTM8-V2诱导肿瘤细胞凋亡的功能与其全长分子类似。超表达CMTM8和 CMTM8-V2表达质粒过表达HeLa (宫颈癌细胞系，ATCC CCL2)和PC3细胞(前列腺癌细胞系， ATCC CRL-1435)可抑制其细胞生长并诱导细胞凋亡，并可使磷酸化的ERK1/2、磷酸化Akt 及其下游的磷酸化Bad明显降低。
[0019] 目前，CMTM8及其变异体CMTM8-V2表达与泌尿系统肿瘤发生发展的相关性和在膀 胱肿瘤、肾肿瘤发生发展中的作用及机制研究尚无任何报道。


【发明内容】

[0020] 本发明在一方面是提供CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2的蛋白或由它们衍生的 蛋白或上述蛋白的免疫性片段在肾肿瘤及膀胱肿瘤中的表达及其应用。
[0021] 本发明在另一方面是提供编码CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2的蛋白或由它们 衍生的蛋白或上述蛋白的免疫性片段的多核苷酸序列在肾肿瘤及膀胱肿瘤中的表达及其 应用。
[0022] 本发明在另一方面是提供CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2的基因或蛋白或它们 的免疫性片段在诱导肾肿瘤或膀胱肿瘤细胞凋亡中的应用。
[0023] 本发明在另一方面是提供CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2的基因或蛋白或它们 的免疫性片段在诊断和治疗肾肿瘤或膀胱肿瘤中的应用，以及在制备治疗和/或抑制肾肿 瘤或膀胱肿瘤的药物中的应用。
[0024] 本发明在另一方面是提供一种包含CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2的载体及其 在诊断和治疗肾肿瘤或膀胱肿瘤以及制备相应药物中的应用。
[0025] 本发明在另一方面是提供一种用于治疗和/或抑制肾肿瘤或膀胱肿瘤的药物组 合物。
[0026] 本发明在另一方面是提供一种试剂及其用于临床检测CMTM8或其可变剪切体 CMTM8-V2的基因和蛋白或它们的免疫性片段的表达以及在制备用于检测膀胱肿瘤和肾肿 瘤的组合物中的应用。

【专利附图】

【附图说明】
[0027] 图1.免疫组化研究CMTM8及CMTM8-V2在人膀胱癌组织中的表达情况。随机选取 了 34例人膀胱组织标本，其中正常膀胱粘膜组织8例，不同分期的肿瘤组织26例。从实验 结果中可以看到，CMTM8及CMTM8-V2在正常膀胱粘膜组织中表达呈强阳性（图片1 )，而在肿 瘤组织中，CMTM8及CMTM8-V2的表达水平明显下降，呈弱阳性或阴性，且随着肿瘤出现肌层 浸润，或肿瘤分级增加，CMTM8的表达水平下降（图片2, 3, 4)。
[0028] 图2A-2B.统计分析CMTM8及CMTM8-V2在人膀胱癌组织中的表达情况。利用统计 学分析免疫组化结果，显示CMTM8及CMTM8-V2在膀胱癌肿瘤组织中呈低表达，在正常组织 中高表达，差异具有显著性（P < 0. 05);在高级别低分化或肌层浸润性膀胱癌中低表达，在 低级别高分化或非肌层浸润性膀胱癌中相对高表达，差异具有显著性（P < 〇. 05)。
[0029] 图3A-3B. CMTM8及CMTM8-V2表达与患者生存率之间的关系。通过病案查询和电 话随访收集到从2004年到2010年的84例膀胱癌患者的资料和病理组织蜡块（图3A中表 2)。进行免疫组化实验后，Kaplan-Meier生存分析显示患者生存率与CMTM8及CMTM8-V2表 达水平呈明显相关（log-rank test, P=O. 011)(图3B)。为进一步验证实验结果，采用COX 多因素分析对实验结果进行检验，结果证实CMTM8及CMTM8-V2是膀胱癌患者生存率的独立 影响因素（HR, 0· 539;95%CI, 0· 296-0. 982;Ρ=0· 043)。
[0030] 图4. CMTM8及CMTM8-V2在膀胱癌细胞系中的表达。在体外实验中选取了两种细胞 系一MGH-Ul和RT112, MGH-Ul来源于高级别低分化尿路上皮癌，而RT112来源于低级别高 分化尿路上皮癌，通过细胞免疫化学检测了两种细胞的CMTM8及CMTM8-V2的表达后发现， MGH-Ul的CMTM8及CMTM8-V2的表达明显低于RT112。
[0031] 图5. Western blotting检测CMTM8及CMTM8-V2在膀胱癌细胞系中的表达。MGH-Ul 的CMTM8及CMTM8-V2的表达明显低于RT112。
[0032] 图6.实时定量PCR检测CMTM8及CMTM8-V2在膀胱癌细胞系中的表达。RT112细 胞系CMTM8及CMTM8-V2的mRNA表达量是MGH-Ul表达量的4. 344倍，进一步证实了两种不 同级别膀胱癌细胞系CMTM8表达的差异性。
[0033] 图7.构建CMTM8上调的膀胱癌细胞系。通过腺病毒感染构建CMTM8上调的T24 膀胱癌细胞系。并利用Western blotting实验检验转染后的CMTM8表达水平。上调后的 T24细胞CMTM8表达水平明显高于野生型T24细胞。
[0034] 图8和图9. CMTM8腺病毒感染的T24细胞系的细胞迁移能力明显降低。Boyden Chamber趋化小室检测CMTM8腺病毒感染的T24细胞的细胞迁移能力。空载体腺病毒感染 的T24细胞作为对照（Null)。37°C条件下趋化6小时后对迁移至趋化膜向下一面的细胞进 行染色（图8)和计数（图9)。图示中标尺代表100 μ m。CMTM8腺病毒明显抑制T24细胞对 于由SDF-I或者EGF诱导的迁移。
[0035] 图10. CMTM8腺病毒感染的T24细胞系的增值能力明显降低。MTT实验检测上调 CMTM8后的T24细胞增殖情况。将CMTM8腺病毒感染的T24细胞和感染空载体腺病毒的T24 细胞(作为对照Null)计数后分别平铺于96孔板中，分别在1天，2天，3天，4天，5天，加入 MTT溶液，4小时后用酶标仪检测OD值。实验结果证实，CMTM8腺病毒能够明显抑制T24细 胞的增殖。
[0036] 图11. CMTM8腺病毒与化疗药物表柔比星联合应用具有协同抗肿瘤作用。Annexin V实验检测CMTM8腺病毒与化疗药物表柔比星的协同作用。实验结果证实，一定剂量单纯的 CMTM8腺病毒和单纯应用化疗药物表柔比星均无明显的致膀胱癌细胞凋亡效果。而这一剂 量CMTM8腺病毒与表柔比星合用则可显著提高膀胱癌细胞的凋亡率。因此CMTM8腺病毒与 表柔比星联合应用具有协同抗肿瘤作用。
[0037] 图12. Western blot实验检测CMTM8及CMTM8-V2在癌旁组织中的表达水平明显 高于肿瘤组织。随机选取了 4例因患肾癌而行根治性肾切除术的病例，手术采集新鲜组织 标本后进行western blot实验检测CMTM8及CMTM8-V2的蛋白表达情况。结果显示CMTM8 及CMTM8-V2在癌旁组织中的表达水平明显高于肿瘤组织。"N"代表癌旁组织，"Ca"代表肿 瘤组织。
[0038] 图13A.免疫组化检测CMTM8及CMTM8-V2和E-cadherin在人原发性和转移性 肾透明细胞癌中的表达。44例人肾透明细胞癌病理组织标本，进行CMTM8及CMTM8-V2和 E-cadherin免疫组化检测。
[0039] 图13B-13C.统计分析CMTM8及CMTM8-V2在人肾透明细胞癌组织中的表达情况。 对44例人肾透明细胞癌病理组织标本的CMTM8及CMTM8-V2和E-cadherin免疫组化检测 进行了统计分析。从分析结果中可以看到，CMTM8及CMTM8-V2在高度恶性肾癌组织中表达 多呈弱阳性或阴性表达，而随着肿瘤恶性程度的降低，CMTM8及CMTM8-V2在肿瘤组织中的 表达水平呈较强阳。正上肾小管CMTM8及CMTM8-V2表达水平呈强阳性。
[0040] 图14A-14C. CMTM8及CMTM8-V2在人肾癌组织中的表达与生存相关性的统计分 析。进行免疫组化实验后，采用Kaplan-Meier生存分析，结果显示患者生存率与CMTM8及 CMTM8-V2表达水平呈明显相关（log-rank test, P=0. 011)(图14C，图14A中表5)。为进一 步验证实验结果，采用COX多因素分析对实验结果进行检验，结果证实CMTM8及CMTM8-V2 是膀胱癌患者生存率的独立影响因素（HR，0. 463; 95%CI，0. 271-0. 789; P=O. 005)(图14B中 表6)。

【具体实施方式】
[0041] 以下针对前述的
【发明内容】
就不同的实施方式并结合附图进行较为详细的描述。应 当理解，这些描述以及后面所列的具体实施例只是用来进一步说明本发明的技术内容，而 不是用来限制本发明的保护范围。
[0042] 根据本发明的一种实施方式，本发明提供了一种选自如下（a)、（b)、（C)或（d)所 示的蛋白或其免疫性片段在膀胱癌和肾癌中的应用：
[0043] (a)由SEQ ID NO : 2所示的氨基酸序列组成的蛋白；
[0044] (b)在（a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与（a) 具有相同功能的由（a)衍生的蛋白；
[0045] (c)由SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列组成的蛋白；或
[0046] (d)在（C)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与（C) 具有相同功能的由（C)衍生的蛋白。
[0047] 如SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列为本发明的CMTM8蛋白序列，共173个氨基酸。 CMTM8基因为编码本发明的SEQ ID NO :2的多核苷酸序列，其可以为SEQ ID NO :2所示氨 基酸的编码序列，除了上述氨基酸序列的编码序列之外，还可以包括非编码序列，例如内含 子、编码序列5'或3'端的非编码序列等在膀胱癌和肾癌中的应用。所述多核苷酸序列可 以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成的DNA。其中优选的基因为SEQ ID NO :1所示的多核苷酸序列，该序列全长1185个核苷酸，其包含编码CMTM8蛋白的序列 (例如编码序列（⑶S :核苷酸295-813)和5'非编码区（核苷酸1-294)及3'非编码区（核 苷酸814-1185)。或者，更优选一种分离的核苷酸序列在膀胱癌和肾癌中的应用，其只包含 CMTM8蛋白的编码序列，例如SEQ ID NO :1所示的编码序列：核苷酸295-813。CMTM8-V2蛋 白为如SEQ ID NO :4所述的氨基酸序列，其编码115个氨基酸。CMTM8-V2为CMTM8的可变 剪切体，其中剪切掉了第二个外显子，即CMTM8-v2 (SEQ ID NO :4)缺少CMTM8 (SEQ ID NO : 2)的氨基酸残基50 - 107。所述CMTM8-V2编码基因优选为SEQ ID NO :4所示氨基酸的编 码序列，例如本发明SEQ ID NO :3所示的多核苷酸序列，其相当于SEQ ID NO :1的核苷酸 295 - 441加616 - 813,即缺少SEQ ID NO :1的编码序列（CDS :核苷酸295-813)中的核 苷酸 442 - 615。
[0048] 本领域普通技术人员已知，本发明CMTM8的核苷酸序列可以完全相同于如SEQ ID NO :1所示的编码序列，CMTM8-V2的核苷酸序列可以完全相同于如SEQ ID NO :3所示的编 码序列，也可以由于遗传密码的简并性，不完全等同于上述核苷酸的编码序列。例如，根据 每个具体的原核宿主或者真核宿主所使用的密码子的频率不同，可以选择相应的密码子， 从而提高所述的多核苷酸在相应的宿主中表达效率。也可以为了获得比天然的核苷酸序列 具有更好性能的多核苷酸(如更长的半衰期)而转换密码子。本发明的CMTM8基因或蛋白的 免疫性片段包括本发明的CMTM8蛋白的免疫性片段或本发明的CMTM8基因的免疫性片段。 本发明的CMTM8蛋白的免疫性片段可以为CMTM8蛋白的任何具有免疫原性的片段，例如SEQ ID NO :2的氨基酸157-173所示的序列、SEQ ID NO :2的氨基酸1-21所示的序列、SEQ ID NO :2的氨基酸22-42所示的序列或SEQ ID NO :2的氨基酸127-143所示的序列。本发明 的CMTM8基因的免疫性片段可以为编码所述CMTM8蛋白的免疫性片段的核苷酸序列。
[0049] 本发明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2的多核苷酸序列或其免疫性片段可以 依据标准的PCR扩增技术将cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板，并选取合适的寡核苷酸 引物扩增得到。这样得到核苷酸可以克隆进合适的载体中，然后利用在所述载体中的复制 得到。也可以通过标准DNA合成技术得到，例如，使用可以按本领域熟知的固相亚磷酸酰胺 三酯法在DNA合成仪上合成。
[0050] 本发明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2的蛋白或其免疫性片段可以通过常规 方法获得，例如通过用CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2的基因或其免疫性片段转化宿主细 胞并在被转化的宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用适当的方法(如温度变动或化学特 质诱导)诱导启动子，然后继续培养。培养完成后，可用离心法收集细胞，并用任何已知的方 法，如冻融法、超声处理法、溶菌酶溶解法或机械破碎法破碎细胞。可以用各种已知的方法 从宿主细胞培养物中回收和纯化本发明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2的蛋白或其免 疫性片段，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸萃取法、超滤法、离子交换层析法、磷酸纤 维层析法、疏水相互作用层析法、凝胶过滤法、亲和层析法及高压液柱层析法。
[0051] 根据本发明的另外一种实施方式，本发明提供了 CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2 的基因或蛋白或它们的免疫性片段在诱导膀胱癌和肾癌细胞凋亡中的应用。细胞凋亡又 称程序性细胞死亡，是一种在特定时空主动发生的、受基因严密调控的细胞逐渐死亡的现 象。细胞凋亡在肿瘤发生、肿瘤治疗、胚胎发育、免疫反应、神经系统发育、组织代谢过程中 有重要的作用。由于本发明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2的基因或蛋白或它们的免 疫性片段能够诱导膀胱肿瘤细胞和肾肿瘤细胞凋亡，所以本发明的CMTM8或其可变剪切体 CMTM8-V2的基因或蛋白或它们的免疫性片段可以广泛用于临床膀胱肿瘤和肾肿瘤的治疗。
[0052] 细胞凋亡异常是肿瘤发生、发展的重要因素，因此通过诱导肿瘤细胞凋亡来清除 肿瘤已成为当前膀胱癌和肾癌肿瘤治疗的一个新的重要策略。在本发明的一个实施例中， 证明了本发明的CMTM8在膀胱癌肿瘤细胞中的表达能够诱导肿瘤细胞的凋亡，从而本发明 的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2或其免疫性片段可用于治疗和/或抑制膀胱肿瘤和肾 肿瘤。
[0053] 根据本发明的其他一种实施方式，本发明提供了 CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2 的基因或蛋白或它们的免疫性片段在制备治疗和/或抑制膀胱肿瘤和肾肿瘤的药物中的 应用。本发明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2的基因或蛋白或它们的免疫性片段在膀 胱肿瘤和肾肿瘤细胞的表达可以抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞的凋亡，而且CMTM8及 CMTM8-V2在膀胱癌和肾癌组织中的表达水平显著低于正常膀胱组织和肾组织。因此，本发 明的CMTM8及CMTM8-V2基因为新的肿瘤抑制基因。从而，本发明的CMTM8及CMTM8-V2基 因或蛋白或它们的免疫性片段可用于制备治疗和/或抑制膀胱肿瘤和肾肿瘤的药物。本发 明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2的基因和蛋白可以以基因和蛋白的形式直接包含在 用于治疗和/或抑制膀胱肿瘤和肾肿瘤的药物中利用其瞬时表达产物进行治疗，也可以以 包含在表达载体中的形式包含在用于治疗和/或抑制膀胱肿瘤和肾肿瘤的药物中利用瞬 时和稳定的表达广物进行治疗。
[0054] 本发明还提供一种用于治疗和/或抑制膀胱肿瘤和肾肿瘤的药物组合物，该药物 组合物含有CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2的基因或蛋白或它们的免疫性片段，和一种或 多种药用赋形剂或药用载体。药用赋形剂或药用载体指无毒固态、半固态或液态填充剂、 稀释剂、包囊材料或其他制剂辅料。所述药物组合物适于胃肠外、舌下、脑池内、阴道内、腹 膜内、直肠内、颊内、肿瘤内或表皮给药。胃肠外给药包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮 下、关节内注射和输注。适于胃肠外给药的药物组合物包括无菌水溶液或非水溶液、分散 液、悬浮液或乳液，以及用于在临使用前在无菌可注射溶液或分散液中配制的粉末。适宜的 水性或非水性载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、羧甲基纤 维素、植物油和可注射的有机酯如油酸乙酯。这些组合物还可以含有防腐剂、润湿剂、乳化 剂和分散剂等辅剂。加入等渗剂如糖类、氯化钠等可能是有利的。表皮给药包括在皮肤、 黏膜上、以及在肺和眼的表面给药。这样的药物组合物包括粉剂、软膏、滴剂、透皮贴剂、离 子电渗疗法装置以及吸入剂等。直肠或阴道给药的组合物优选为栓剂，它可以通过将本发 明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2序列或其免疫性片段或含有CMTM8或其可变剪切体 CMTM8-V2多核苷酸序列或其免疫性片段的载体与适宜的非刺激性药用赋形剂或药用载体 如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合制备，所述药用赋形剂或药用载体在室温为固态，在体温 下为液态，因此在直肠或阴道腔内熔化并释放出活性化合物。
[0055] 当以上述或其他方式进行治疗时，治疗有效量的本发明的CMTM8或其可变剪切体 CMTM8-V2可以是本发明CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2的基因或蛋白或它们的免疫片 段的纯净形式、药用盐形式，或选择性与药用赋形剂组合。对膀胱肿瘤和肾肿瘤患者的具 体治疗有效剂量取决于许多因素，包括所治疗的疾病和其严重程度；所用具体化合物的活 性；所用的特定组合物；患者的年龄、体重、性别、饮食和一般健康状况；给药时间；给药途 径；具体化合物的排泄速度；治疗的持续时间联合或同时服用的其他药物等，对于本发明 的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2来说，其治疗有效量一般为0. 1?1000 μ g/人/天。
[0056] 本发明还提供检测CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2的基因或蛋白或它们的免疫 片段的表达的试剂在制备用于检测膀胱肿瘤和肾肿瘤的组合物中的应用。所述试剂可以为 蛋白、核酸、碳水化合物等，优选为抗体、反义RNA或小干扰RNA (siRNA)。
[0057] 本发明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2的基因或蛋白或它们的免疫片段可以 作为膀胱肿瘤和肾肿瘤诊断指标。因此，可以利用限制性片段长度多态性分析（RFLP)、反转 录-聚合酶链式反应（RT-PCR)、荧光原位杂交法（FISH)等方法或它们的组合，检测体内因 本发明的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2表达不足或过量所致的病理状态。同样，也可以 使用本发明CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2蛋白的抗体，通过放射性免疫分析、竞争性结 合法、Western印迹分析法或酶联免疫吸附法（ELISA)达到相同的目的。
[0058] 实施例
[0059] 下面的实施例用来针对本发明的实施进行说明。应理解，本发明的范围不受这 些具体实施例的限制。除非另有说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常 按照常规条件，如Sambrook等人，分子克隆：实验手册（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0060] 实施例1膀胱癌手术蜡块CMTM8及CMTM8-V2免疫组织化学检测及统计学分析
[0061] -、方法：
[0062] 将收集的病理组织蜡块进行切片，石蜡切片的厚度为4μπι，然后脱蜡。脱蜡：组 织芯片置于二甲苯中浸泡20分钟，换新鲜二甲苯重复一次；水化：将脱腊后的组织切片于 100 %乙醇中浸泡5分钟χ2次，95 %乙醇、90 %乙醇、80 %乙醇、70 %乙醇、蒸馏水各浸泡3 分钟xl次；抗原修复：抗原修复液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，将抗原修复液微波高火加 热至沸腾，将切片放入，再用微波高火加热5分钟，补加蒸馏水恢复体积后再用微波高火加 热5分钟，自然冷却至室温；去除内源性过氧化物酶：新鲜配置3%Η 202，滴片，室温下避光孵 育10分钟；PBS洗5分钟χ3次，不时晃动；封闭：用10%正常羊血清PBS封闭液室温封闭 20分钟；一抗反应：滴片，加1:100的CMTM8或其可变剪切体CMTM8-V2兔多抗（以封闭液稀 释)，4°C过夜反应，以同样稀释度的正常兔IgG作为阴性对照；PBS洗5分钟χ3次，不时晃 动；二抗反应：HRP-抗兔IgG抗体1:1000PBS稀释，37°C反应30分钟；PBS洗5分钟χ3次， 不时晃动；DAB显色，滴片，镜下观察反应结果，苏木精复染细胞核后，中性树胶封片。由两 位病理科大夫分别评定染色阳性程度，如有评级不一致的，由两位病理科大夫协商后评定。
[0063] 所有数据均采用SPSS17. 0软件进行统计分析。正常膀胱组与膀胱癌组，高级别 膀胱癌与低级别膀胱癌，不同临床?μ分期之间均采用卡方检验进行统计学分析。采用 Kaplan-Meier生存分析检验患者生存与CMTM8及CMTM8-V2表达水平之间的相关性，COX多 因素回归分析检验CMTM8及CMTM8-V2表达水平是否是膀胱癌患者生存的独立影响因素。以 P < 0. 05为差异具有统计学意义。
[0064] 二、结果：
[0065] 如图1所示，CMTM8及CMTM8-V2的抗体对不同分化程度的膀胱癌组织着色不同， 包括癌旁组织，提示不同分化程度的膀胱癌表达不同水平的CMTM8及CMTM8-V2。从切片中 可以看出大致趋势：癌旁组织表达CMTM8及CMTM8-V2水平最高，随着膀胱癌恶性程度增高， CMTM8及CMTM8-V2的表达量越低。通过对几十例膀胱癌患者的膀胱组织石蜡切片进行统 计，结果如图2Α中表1所示，膀胱癌组织中CMTM8及CMTM8-V2的表达水平明显低于膀胱癌 旁组织，并且如图2Β所示，恶性程度越高，分化水平越低，CMTM8及CMTM8-V2表达水平越低。 通过对膀胱癌切片来源的患者进行生存率统计，结果如图3Α中表2和图3Β所示，CMTM8及 CMTM8-V2的表达跟患者的生存率呈正相关关系，其中在CMTM8及CMTM8-V2表达++与-和 +比，生存率存在显著差异。
[0066] 实施例2膀胱癌细胞系MGHU-I和RTl 12免疫细胞化学
[0067] 一、方法：
[0068] 将培养的MGHU-I和RTl 12细胞用胰酶消化，制成细胞悬液，注入铺有小玻片的六 孔板中，37°C 5%C02孵育箱中过夜培养。4%多聚甲醛固定30分钟。PBS洗两次各5分钟。 3%H202室温封闭30分钟，PBS洗3次，每次5分钟。PBS洗3次，每次5分钟。滴加正常山 羊血清封闭液，室温30分钟。甩去多余液体。滴加 CMTM8抗体，浓度1:600,4°C过夜。PBS 洗三次，每次5分钟。滴加羊抗兔来源二抗，室温30分钟。PBS洗3次，每次5分钟。滴加 试剂SABC，室温30分钟。PBS洗3次，每次5分钟。DAB显色。蒸馏水洗终止显色。苏木素 复染细胞核2分钟、盐酸酒精分化。脱水、透明、封片、镜检。
[0069] 二、结果：
[0070] 如图4所示，MGHU-I中CMTM8及CMTM8-V2的表达比在RT112中低，且已知MGHU-I 细胞系的恶性程度高于RT112细胞系，说明，CMTM8及CMTM8-V2在恶性程度较高的细胞系 中表达水平较低。
[0071] 实施例3CMTM8及CMTM8-V2在膀胱癌细胞系MGHU-I和RTl 12中mRNA表达水平检 测
[0072] -、方法：
[0073] 应用RT-PCR的方法检测膀胱癌细胞系MGHU-I和RTl 12的内源性CMTM8及 CMTM8-V2。首先，用TRIZ0L?试剂提取细胞总RNA。具体方法如下：收获对数生长期的细胞， 在35mm培养皿中加入Iml TRIZ0L?试剂，反复吹打破碎细胞，并将其转移到I. 5ml无 RNA酶 的离心管中，于室温静置5分钟，加入0. 2ml氯仿，猛烈振荡15秒，在4°C于不大于12000g 离心15分钟，收集上层水相，加入500 μ 1异丙醇来沉淀RNA，用70%乙醇洗一遍，于室温干 燥后，将沉淀得到的RNA复悬于DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的H2O中，通过分光光度计定量后 将所得RNA溶液用于逆转录。其次，通过逆转录合成单链cDNA，并进行PCR扩增，具体方法 如下：利用Invitrogen公司的SuperScriptII试剂盒，用2 μ g总RNA合成单链cDNA。PCR 反应所用引物序列如表7所示，反应条件如表8所示，GAPDH作为系统内参(对照)。
[0074] 表7. PCR反应所用的引物序列
[0075]

【权利要求】
1. 一种蛋白或其免疫性片段在肿瘤诊断和治疗中的应用，其中所述蛋白选自： (a) 由SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列组成的蛋白； (b) 在（a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与（a)具有 相同功能的由（a)衍生的蛋白， (c) 由SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列组成的蛋白；或 (d) 由（c)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与（c)具有 相同功能的由（c)衍生的蛋白； 其中所述肿瘤包括肾肿瘤或膀胱肿瘤。
2. 编码权利要求1所述的蛋白或其免疫性片段的多核苷酸序列在肿瘤诊断和治疗中 的应用，其中： 所述多核苷酸序列为SEQ ID NO :1所示的多核苷酸序列、SEQ ID NO :1的核苷酸 295-813所示的多核苷酸序列或SEQ ID NO :3的核苷酸1 一 345所示的多核苷酸序列； 所述免疫性片段为SEQ ID NO :2的氨基酸157-173所示的序列、SEQ ID NO :2的氨基 酸1-21所示的序列、SEQ ID NO :2的氨基酸22-42所示的序列或SEQ ID NO :2的氨基酸 127-143所示的序列； 其中所述肿瘤包括肾肿瘤或膀胱肿瘤。
3. 根据权利要求1所述的蛋白或其免疫性片段或根据权利要求2所述的多核苷酸序列 在诱导肿瘤细胞凋亡中的应用，其中所述肿瘤包括肾肿瘤或膀胱肿瘤。
4. 根据权利要求1所述的蛋白或其免疫性片段在制备治疗和/或抑制肿瘤的药物中的 应用，其中所述肿瘤包括肾肿瘤或膀胱肿瘤。
5. 根据权利要求2所述的多核苷酸序列在制备治疗和/或抑制肿瘤的药物中的应用， 其中所述肿瘤包括肾肿瘤或膀胱肿瘤。
6. 根据权利要求4或5所述的应用，其中所述蛋白或其免疫性片段或所述多核苷酸序 列包含于载体中；所述载体为质粒或病毒；所述病毒为腺病毒。
7. -种载体，其包含权利要求2所述的多核苷酸序列；所述载体为质粒或病毒；所述病 毒为腺病毒。
8. -种用于治疗和/或抑制肿瘤的药物组合物，其含有权利要求1所述的蛋白或其免 疫片段或权利要求2所述的多核苷酸序列或权利要求7所述的载体，和一种或多种药用赋 形剂或药用载体，其中所述肿瘤包括肾肿瘤或膀胱肿瘤。
9. 一种试剂在制备用于检测肿瘤的组合物中的应用，其中所述试剂用于检测权利要求 1所述的蛋白或其免疫性片段或权利要求2所述的多核苷酸序列的表达，所述肿瘤包括肾 肿瘤或膀胱肿瘤。
10. 根据权利要求9所述的应用，其中所述试剂为抗体、反义RNA或小干扰RNA。
【文档编号】G01N33/68GK104225575SQ201310226123
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月7日 优先权日:2013年6月7日
【发明者】许克新, 胡浩, 张石英, 裴晓磊, 宋泉声, 王应 申请人:北京大学人民医院, 北京大学