技术领域本发明涉及一种用于检测眼病的试剂盒及其检测方法。
背景技术：
甲状腺相关眼病(thyroidassociatedophthalmopathy,TAO)是内分泌科常见疾病之一，也是目前世界上治疗最为困难的疾病之一。TAO病程较长，各年龄段均可发生，以女性多发。轻者可影响生活、工作质量，损伤外貌，重者可导致视力下降，甚至失明，给患者带来了沉重的经济及心理负担。近年来，由于生活方式的改变，工作压力的增加，社会环境状况的变化，食用加碘盐的普及，以及不正规用药等因素，TAO的发病率明显上升，住院率高。目前由于本病原因未明，临床主要以激素、免疫抑制剂、生长激素类似物、抗甲状腺药物、眶内放射、眼眶减压术等综合治疗为主，但由于种种原因，效果并不尽人意，迄今为止尚无任何一种药物能有效治疗TAO，并获长期缓解。因此，研究治疗甲状腺相关眼病的药物是亟待解决的技术问题。而检测所述疾病更是本领域积极研究的方向。近年来的研究表明，细胞间粘附分子-1的表达与自身免疫甲状腺病免疫病理过程密切相关。甲状腺炎患者的甲状腺组织内浸润淋巴细胞、内皮细胞的sICAM-1和sICAM-1表达异常活跃。另外，发现伴有突眼的患者血清sICAM-1水平异常增高，这是因为患者眼球后组织强烈表达sICAM-1，所以血清sICAM-1升高的水平多与眶周炎症浸润程度密切相关。此外，研究还发现，在药物的治疗过程中，甲状腺功能和临床症状的好转与血清sICAM-1水平的下降并不同步，往往甲状腺功能的恢复在很大程度上要早于sICAM-1的恢复。综上所述，可溶性细胞间粘附分子-1的浓度变化可能对于判断GD的自身免疫紊乱水平、停药与否和是否复发等具有重要意义。细胞间粘附分子-1的表达与甲状腺相关眼病有直接关联，因此，检测细胞间粘附分子-1的表达情况，可以直接用于鉴定甲状腺相关眼病。然而传统的检测细胞间粘附分子-1的表达情况具有操作复杂，费时的缺点。核酸适体(Aptamer,又称适配体,适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生物革El标的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术(Systemat1cEvolut1onofL1gandsbyExponent1alenr1chment,SELEX)从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核酸适体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有很多优良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速的穿透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性，在生物检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种特异结合sICAM-1的核酸适体及其试剂盒。本发明提供的核酸适体，是序列表的序列1-15所示的单链DNA。所述核酸适体与sICAM-1蛋白具有较好的亲和能力。还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种：a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；d)将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；e)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。所述核酸适体可用于制备检测sICAM-1的试剂盒。利用本发明的核酸适体，可以捕获血液中的sICAM-1，从而用于甲状腺相关眼病筛查。利用本发明的核酸适体，部分代替单克隆抗体捕获sICAM-1进行检测，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。本发明具有很高的应用价值。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、核酸适体的筛选和制备设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括39个核苷酸的随机核酸文库如下：5’-ACGACTAACGTGTAACAG(N39)CAGTGCATGATGCTACGAA-3’；N39代表39个随机核苷酸。将单链DNA文库扩增为双链DNA,产物经2％琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75μgRNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ugsICAM-1蛋白(通过陈志鸿等，人细胞间黏附分子-1的真核细胞表达与鉴定中公开的方法，表达得到的目的蛋白)，37℃孵育30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(6mol/L尿素，0.55mol/L醋酸铵，l.5mmol/LEDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行10轮。得到了15个适配子，其序列分别为SEQIDNO:1-15所示。具体序列如下所示：sICAM-1-1：ACGACTAACGTGTAACAGTCCAAGTATTCATACATACCATAAATTCATTGTCATTAACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:1)sICAM-1-2：ACGACTAACGTGTAACAGCAGACACCATATATACTATCTACTACCACATACCTCTACCAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:2)sICAM-1-3：ACGACTAACGTGTAACAGCTAACTTCTTATAACTTAAGATACTTCTTCCAAACAACACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:3)sICAM-1-4：ACGACTAACGTGTAACAGTACATCACTCTAATCTTCACGCCTCAGTTACATTCCCTTCAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:4)sICAM-1-5：ACGACTAACGTGTAACAGATGTATATTCCTTATATGACTATAATTCTTACCTATAAACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:5)sICAM-1-6：ACGACTAACGTGTAACAGACCTCTATCTCACTCTTCCCTTTCGCCTACACATCCGAACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:6)sICAM-1-7：ACGACTAACGTGTAACAGAGATTCACTAATATTTCTTCGCCTCGCCATACTTAAGATCAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:7)sICAM-1-8：ACGACTAACGTGTAACAGTACCCATCCACCTTCTTACTACTGCTCTCTCAATCTACACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:8)sICAM-1-9：ACGACTAACGTGTAACAGACAGATACATTCATATCAAGTTACACATCTCCATGTTAACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:9)sICAM-1-10：ACGACTAACGTGTAACAGCAGAACACAAATCTATACAAATCAGCATCACACTCATACCAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:10)sICAM-1-11：ACGACTAACGTGTAACAGATACCAATCGCCACCTACACTTACATCTAGACACTCTATCAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:11)sICAM-1-12：ACGACTAACGTGTAACAGTATCTACACATAGATCCTCCACTTAATAACAATCTGTCACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:12)sICAM-1-13：ACGACTAACGTGTAACAGATACCTCATCAGATATTACATTCGCCAATATTTCTCTATCAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:13)sICAM-1-14：ACGACTAACGTGTAACAGTCTATAACGCCTAACTACACCACTCCACTCATTATAATACAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:14)sICAM-1-15：ACGACTAACGTGTAACAGATCTATTTCACCATTAAGAACCATATCGCATCACCCTTCCAGTGCATGATGCTACGAA(SEQIDNO:15)实施例2sICAM-1蛋白结合适配子的性能测定将RNA适配子分别取2.0μg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37℃消化lh，纯化回收去磷酸化的RNA；通过T4多核苷酸激酶标记[γ-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。10nmol放射性标记的RNA适配子分别与不同浓度(1-200nM)的sICAM-137℃孵育30min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与sICAM-1的解离常数。结果如下：名称解离常数Kd(单位nM)sICAM-1-18.8sICAM-1-28.9sICAM-1-39.0sICAM-1-47.9sICAM-1-58.3sICAM-1-68.2sICAM-1-78.9sICAM-1-89.3sICAM-1-98.7sICAM-1-108.1sICAM-1-118.0sICAM-1-129.4sICAM-1-137.8sICAM-1-148.6sICAM-1-158.9PBS空白对照无结合能力实施例3所述适配子特异性分析以及稳定性分析分别采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，霍乱弧菌VgrG3C蛋白，大肠杆菌外膜蛋白A，Lp-PLA2蛋白,与15条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与sICAM-1结合保持较高的特异性。将所述的适配子，取0.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置二周。通过RT-PCR检测，发现二周的放置其结构稳定，没有被降解。实施例4所述适配子疾病的诊断将15个适配子分别与10个甲状腺相关眼病患者以及正常人的血液混合30min，通过生物素分离，定量分析其中的sICAM-1蛋白的含量，通过分析发现，10个甲状腺相关眼病患者中sICAM-1蛋白的含量相对于正常人显著增加。以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表〈110〉李倩〈120〉一种用于检测眼病的试剂盒及其检测方法〈160〉14〈210〉1〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-1：ACGACTAACGTGTAACAGTCCAAGTATTCATACATACCATAAATTCATTGTCATTAACAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉2〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-2：ACGACTAACGTGTAACAGCAGACACCATATATACTATCTACTACCACATACCTCTACCAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉3〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-3：ACGACTAACGTGTAACAGCTAACTTCTTATAACTTAAGATACTTCTTCCAAACAACACAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉4〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-4：ACGACTAACGTGTAACAGTACATCACTCTAATCTTCACGCCTCAGTTACATTCCCTTCAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉5〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-5：ACGACTAACGTGTAACAGATGTATATTCCTTATATGACTATAATTCTTACCTATAAACAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉6〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-6：ACGACTAACGTGTAACAGACCTCTATCTCACTCTTCCCTTTCGCCTACACATCCGAACAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉7〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-7：ACGACTAACGTGTAACAGAGATTCACTAATATTTCTTCGCCTCGCCATACTTAAGATCAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉8〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-8：ACGACTAACGTGTAACAGTACCCATCCACCTTCTTACTACTGCTCTCTCAATCTACACAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉9〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-9：ACGACTAACGTGTAACAGACAGATACATTCATATCAAGTTACACATCTCCATGTTAACAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉10〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-10：ACGACTAACGTGTAACAGCAGAACACAAATCTATACAAATCAGCATCACACTCATACCAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉11〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-11：ACGACTAACGTGTAACAGATACCAATCGCCACCTACACTTACATCTAGACACTCTATCAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉12〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-12：ACGACTAACGTGTAACAGTATCTACACATAGATCCTCCACTTAATAACAATCTGTCACAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉13〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-13：ACGACTAACGTGTAACAGATACCTCATCAGATATTACATTCGCCAATATTTCTCTATCAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉14〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-14：ACGACTAACGTGTAACAGTCTATAACGCCTAACTACACCACTCCACTCATTATAATACAGTGCATGATGCTACGAA〈210〉15〈211〉76〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉sICAM-1-15：ACGACTAACGTGTAACAGATCTATTTCACCATTAAGAACCATATCGCATCACCCTTCCAGTGCATGATGCTACGAA