本发明涉及食品安全检测免疫分析技术领域，具体而言，涉及一种克百威分析测定试剂盒及其应用。
背景技术：
农兽药是农业生产不可或缺的重要生产资料,对保障农业及粮食生产与安全发挥着重要作用。化学农兽药在可预见的将来,仍是农产品质量和安全保障不可或缺的手段。食品中农兽药残留及其安全性评估受到科学研究工作者和公众的广泛关注。但是如果长期不合理使用会带来环境污染，生态破坏以及对人体健康有危害等问题。因此建立高效快速低成本的土壤和水中的农药残留成为重中之重。基于农药能有效除虫害，草害作用，农药的使用量也在大量增加，田间所施的农药，大部分会进入到水、土壤和大气中去，人们平常喷洒的农药，大部分会在土壤中形成农药残留，而且有些农药的残留量比较大容易蓄积并且难分解，如此日积月累最终危害的是人类自身的安全，尤其是高毒性、难于降解农药的使用已经到了威胁生态环境和人类身体健康的地步，为了保证农产品的食用安全，各个国家(美国，欧盟，日本等)先后制定了农药在不同食品中的限量标准。克百威(Carbofuran)是一种高效广谱的氨基甲酸酯类杀虫剂，被广泛用于粮食、蔬菜、水果及经济作物等的害虫防治。克百威对胆碱酯酶的抑制不可逆,对人、畜、禽、鱼等的毒性极高。其在酸性土壤中很难降解，易污染土壤和水源，尤其是在蔬菜和粮食作物上的大量使用，形成农药残留，对公众的健康和环境构成直接威胁。因此，建立高效快速的克百威检测技术，对加强环境和农副产品中克百威残留的监测及快速诊断具有重要意义。
免疫分析方法的作用和地位目前已得到国内外学者的广泛认可，免疫分析方法的研究也是检测方法研究最热门的领域之一。在免疫分析方法领域中，我国在酶联免疫分析方法方面开展了较为深入的研究，包括半抗原合成、抗体制备、标记物偶联、反应体系中各种理化性质对免疫分析方法的影响及半抗原结构与其所制备得到抗体之间的构效关系等方面。近年来，我国学者在荧光免疫分析、化学发光免疫分析、生物传感器和生物条形码免疫分析方法方面也开展了较多的研究工作。
目前纳米技术引起了人们的广泛关注。纳米材料具有表面效应、小尺寸效应、量子效应、宏观量子隧道效应和独特的生物相容性，对生物分子有很强的吸附功能，可以与蛋白质、核酸等非共价结合。基于纳米粒子的生物条形码免疫分析方法，利用生物条形码信号放大作用及磁性纳米粒子的分离富集作用，其最低检出限相对于ELISA方法提高了几个数量级，致使其诞生以来，便获得科学界的高度关注。
然而，目前现有技术中，还缺乏一种高灵敏度的应用生物条形码技术检测克百威的方法。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明将新型酶标胶体金复合探针与克百威的免疫分析学有机结合，提供了一种能够简便、快速、灵敏、特异、稳定检测克百威的试剂盒，该试剂盒适于在食品安全检测中有效地推广应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种克百威分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有：
克百威标准品、克百威纳米探针、克百威酶标胶体金复合探针、催化底物以及终止液；
所述克百威纳米探针由磁性纳米粒子和克百威完全抗原偶联而成；
所述克百威酶标胶体金复合探针由抗克百威抗体以及HRP包被胶体金颗粒得到；所述HRP与链霉亲和素组成复合物，以生物素修饰的单链DNA为媒介包被至所述胶体金颗粒上。
优选的，所述催化底物为TMB显色液(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)。
克百威(Carbofuran)分子式：C12H15NO3；CAS号：1563-66-2。
为了提高检测灵敏度，本发明利用生物条形码技术构建了一种新型多功能酶标胶体金复合探针，并发展基于该纳米金复合探针的免疫方法。农药单克隆抗体、单链DNA、HRP共组装到纳米金表面构建多功能酶标胶体金复合探针。其中，单克隆抗体用于免疫反应，生物素修饰单链DNA作为纳米金与HRP之间的桥梁，HRP作为信号分子。经单链DNA的桥接作用，一个多功能纳米金复合探针携带约多个个HRP分子。通过免疫竞争反应，每个免疫复合物所对应的HRP分子数得以增加，信号强度得以放大，能够检测低至13.4ng L-1的克百威农药，同时保持良好的特异性。
该试剂盒的使用效果具有简便、快速、灵敏、特异、稳定等优点。并且，根据本发明的检测系统为开放式操作，简便快速，特别适合广大的质检机构推广使用，为食品安全检测提供一种非常有价值的检测手段。
优选的，如上所述的试剂盒，所述克百威完全抗原由克百威和载体蛋白偶联而成。
更优选的，所述载体蛋白为鸡卵白蛋白。
鸡卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)也称鸡卵清白蛋白，由386个氨基酸组成，分子量约43Kd。OVA作为惰性蛋白，它能维持胶体金的胶体稳定，起着有分散胶体金颗粒的骨架作用。
载体蛋白也可选用酪蛋白(Casein)或牛血清白蛋白(BSA)等。
优选的，如上所述的试剂盒，所述磁性纳米粒子的粒径为18～22nm。
磁性纳米粒子的粒径对克百威完全抗原的偶联数量有着很大的影响，从而影响着最终反应的灵敏度。
优选的，如上所述的试剂盒，所述胶体金颗粒的粒径为13～15nm。
本申请的技术要点是通过形成克百威纳米探针-克百威酶标胶体金复合探针的结合，与克百威-克百威酶标胶体金复合探针的结合进行竞争，并且前者的结合应该可以均一的分离。灵敏度提高的关键在于被检物的有效回收和作为每个被检物识别结合位点对应的HRP的有效释放。HRP催化底物得到的信号值对应被检物的量(克百威纳米探针对被检克百威的竞争性结合的抑制率)，因此可以通过HRP间接定量痕量的被检物。克百威纳米探针-克百威酶标胶体金复合探针的结合实质是克百威纳米探针中的克百威完全抗原与克百威酶标胶体金复合探针中的抗克百威抗体的结合，而二者的结合强度与抗体/抗原的量密切相关，抗体/抗原的量则与胶体金颗粒/磁性纳米粒子的粒径密切相关。
优选的，如上所述的试剂盒，所述抗克百威抗体为单克隆抗体。
单克隆抗体由于可以通过细胞株进行生产，各批次之间性质稳定，且特异性强，因而更适合试剂盒产品。
优选的，如上所述的试剂盒，所述克百威酶标胶体金复合探针具体由以下方法制备得到：
1)、取胶体金溶液调pH至8.8～9.2后向其中加入抗克百威抗体，搅拌混合，静置25～35min；然后加入生物素修饰的单链DNA链，8～12℃静置36～44h；再调整pH至7.3～7.5，加入NaCl至浓度0.08～0.12mol/L，8000～11000r/min离心8～12min，弃上清，得到含寡核苷酸的胶体金；
2)、用牛血清白蛋白浓度为0.8～1.2％的磷酸盐缓冲溶液重悬所述含寡核苷酸的胶体金，孵育1～3h；再加入链霉亲和素-HRP，室温反应1～3h，离心弃上清，得到所述克百威酶标胶体金复合探针。
进一步优选的，在加入NaCl至既定浓度时，在120～180min内分2～4次等量加入，每次间隔40～60min；更优选的，在加入NaCl至既定浓度时，在140～160min内分3次等量加入，每次间隔50min。
加入NaCl的过程即DNA的老化过程。纳米金和DNA都带负电，所以会相互排斥，加入NaCl可以屏蔽掉纳米金表面的一些电荷，减少纳米粒子间的排斥。但过高浓度的NaCl会导致盐离子强度过大，易引起DNA团聚，所以将其逐步加入，防止瞬间离子强度的过大。
如上所述的克百威分析测定试剂盒在克百威定性定量分析中的应用。
利用磁分离系统分离免疫结合的抗原抗体复合物，采用热变性技术促使胶体金纳米探针释放HRP，并利用HRP对底物催化得到信号值的方法测定克百威含量，实现对克百威农药的定量检测。
优选的，如上所述的克百威定性定量分析的方法，该方法包括：
a)、将克百威标准品、提取与净化后的待测样品分别与等体积的克百威酶标胶体金复合探针和克百威纳米探针混合孵育；
b)、洗涤孵育产物并去杂化得到竞争复合物；
c)、使用催化底物与所述竞争复合物共孵育，然后加入终止液终止反应，酶标仪测定；
d)、以克百威标准品的浓度为横坐标，各浓度所对应的灰度抑制率为纵坐标，建立标准曲线，并根据标准曲线计算各样品中的克百威浓度。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)、本发明可以特异地定量检测克百威含量。具有简便、快速、灵敏、特异、稳定等优点。并且，根据本发明的检测系统为开放式操作，简便快速，特别适合广大的质检机构推广使用，为食品安全检测提供一种非常有价值的检测手段。
2)、根据本发明的试剂盒，磁性纳米探针中的克百威半抗原与检测样品中的克百威竞争新型酶标胶体金复合探针的克百威单抗形成直接竞争体系，因此本法采用的竞争反应体系，即确保检测的灵敏度，也可有效保证检测结果的良好重现性。另外，这种模式还便于操作和生产。
3)、本发明的试剂盒使用的是酶催化底物TMB显色，灵敏度大大提高，可为蔬菜水果中克百威的检测提供更为灵敏、快速、可靠的依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中以克百威标准品的浓度为横坐标，各浓度所对应的抑制率为纵坐标，建立的标准曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
克百威分析测定试剂盒的制备方法
S11、克百威酶标胶体金复合探针的制备
金纳米颗粒合成方法
向硅化好的烧杯中分别加入98mL去离子水，再分别入2mL 50mM氯金酸原液，使氯金酸的浓度为1mM，在磁力搅拌器上1000rpm/min搅拌、250℃加热，液体沸腾后继续煮沸2min；吸取10mL 38.8mM柠檬酸三钠，迅速一次性加入烧杯中，保持搅拌速度和加热温度不变，继续煮沸6min，可发现溶液颜色由无色逐渐变成紫色，再变成酒红色，根据加入柠檬酸三钠还原剂量的不同最终变成不同的颜色，待液体冷却后用去离子水补回原体积，于4℃密闭保存，合成的金纳米颗粒的粒径控制在13～15nm。
分别取一定体积胶体金、用0.1mol/L K2CO3调节至pH9.0；静置15min，加入一定量的克百威单克隆抗体,在搅拌下将胶体金和抗体混合,静置30min。然后加入生物素修饰的单链DNA链，10℃静置40h，再以PBS调整至pH 7.4，提高NaCl浓度，NaCl分3次加入，每隔1个小时加入一次，至终浓度0.1mol/L，10 000r/min离心10min,即得到含寡核苷酸的胶体金。然后再加入5％牛血清白蛋白(BSA)，使其最终浓度为1％。将链霉亲和素-HRP加入单克隆抗体修饰的胶体金中，室温反应两个小时，离心得到新型酶标胶体金纳米复合探针。
S12、克百威磁性纳米探针的制备
1)、鸡卵白蛋白(OVA)标记克百威半抗原的制备
辣根过氧化物酶标记克百威半抗原的制备，具体方法如下：
取半抗原0.25mmol,溶于1mL DMF，搅拌下加入60μl正三丁胺和30μl氯甲酸乙酯，室温搅拌反应1h。取反应液300μl缓慢滴加到6mL溶有120mg OVA的CBS缓冲溶液(0.01mol/L)中，室温搅拌反应2h后，装入透析袋，先用蒸馏水透析3次，然后用0.01mol/L的PBS透析3d，每天换透析液3-4次。取出分装保存于-20℃的冰箱中。
2)、磁性纳米粒子合成方法
磁性微球的形成过程：取8.1g FeCl3·6H2O和3.3g FeCl2·4H2O加入150mL去离子水，配成溶液，然后移入三口烧瓶中。在N2保护环境中与剧烈搅拌状态下向Fe2+和Fe3+的混合溶液中18mL质量分数为25％的浓氨水，溶液中开始生成棕褐色的Fe3O4粒子，调节溶液的pH值在9～11之间，此刻反应温度为70℃，在反应的过程中要保证一定的搅拌速度，反应的离子方程式为：
Fe2++2Fe3++8OH-＝Fe3O4+4H2O
Fe3O4/油酸的合成：在剧烈搅拌状态下将5.0g油酸(C18H34O2)加入Fe3O4的液体中，然后在N2保护环境下，温度为70℃水浴中反应一个小时，使油酸均匀的包覆在粒子表面。反应结束后，得到黑色溶胶状物质，利用外加磁场将所得的沉淀从反应体系中分离出来，用乙醇洗涤3次除去多余的油酸，再用去离子水洗涤至pH＝7，此时得到油酸均匀包覆的Fe3O4粒子。
单层羧基功能化的Fe3O4粒子合成：采用高锰酸钾氧化油酸法合成壬二酸(HOOC(CH2)7COOH)形成羧基化磁性纳米粒子。加入160mL浓度为10mg/mL的KMnO4溶液在剧烈搅拌状态，温度为50℃条件下反应8h，反应结束后利用外加磁场将所得沉淀从反应介质中分离出来，并先后用去离子水洗涤3次，所得产物在40℃下真空干燥，将干燥后的粒子溶于水溶液便得到稳定的羧基化磁性纳米粒子。磁性纳米粒子的粒径控制在18～22nm。
3)、磁性微球和OVA-半抗原的连接
a)、微球的活化。用pH＝6.0，15mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(MES)作为活化缓冲溶液，取1mL磁珠于2.0mL离心管中，加入活化缓冲溶液后，将上清液吸掉；再用活化缓冲液重新洗涤磁珠2遍，再分别加入碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺，在漩涡振荡器上混合均匀，室温活化30min。
b)、微球与OVA-半抗原偶联。用pH＝7.4，0.01mol/L的磷酸盐吐温(PBST，1％Tween-20)溶液作偶联缓冲液，用活化缓冲液重新洗涤已经活化的磁珠3遍，再用偶联缓冲液洗涤磁珠2遍；然后用偶联缓冲液重悬磁珠，再加入OVA-半抗原，使得磁珠表面活化的羧基与OVA的氨基于37C下反应1h，将OVA-半抗原偶联于磁珠表面，得到免疫磁珠。
c)、封闭。用偶联缓冲液洗涤偶联后磁珠2遍，加入含有2％BSA的偶联缓冲液封闭磁珠60min。最终得到免疫磁性探针。
S13、克百威标准品的制备
用克百威纯品配制(10.0ng L-1-40μg L-1)，共7瓶。
所述克百威纯品纯度不低于90％。
S14、反应体系工作浓度选定
经优化选定磁性纳米探针稀释倍数为100倍，胶体金纳米探针稀释倍数为20倍。
S15、半成品及成品组成
上述步骤所得部分分装即为半成品，抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装为克百威分析测定试剂盒，组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。
综上，在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选试验和质量鉴定，包括抗体和克百威半抗原的活性，胶体金颗粒的粒径，磁性纳米颗粒的粒径和磁性等。然后通过对试剂盒的反应模式、反应时间、偶联效率、催化时间，等一系列的条件进行了优化，建立了高灵敏度及良好重现性的克百威酶标胶体金复合探针放大免疫分析方法。
实施例2
本发明的试剂盒使用方法
以上实施案例1制备的克百威酶标胶体金复合探针放大免疫分析试剂盒的具体操作如下：
S21、自4℃冰箱中取出试剂盒，室温平衡10分钟；
S22、反应孔中分别加各浓度克百威标准品(10.0ng L-1-40μg L-1)和经前处理后得到的样品各20μL，设一个重复，然后每孔加入磁性纳米探针20μL，用微量振荡器充分振荡混匀，然后置于温度为37℃，相对湿度为70％的恒温恒湿培养箱中温育1h.；
S23、用PBST液洗涤三次，去杂化得到竞争复合物；
S24、50μL反应底物TMB加入竞争反应复合物中，37℃反应15min，然后加入50μL终止液以终止反应，放入酶标仪中进行测定；
S25、以克百威标准品的浓度为横坐标，各浓度所对应的灰度抑制率为纵坐标，建立标准曲线，并根据标准曲线计算各样品中的克百威浓度。
实验例1
本发明试剂盒的方法学检定结果
按照本领域中常见的检定规程对实施案例1中制备的试剂盒进行鉴定，结果见表1。
表1本发明试剂盒的方法学检定结果
以上结果表明“克百威胶体金复合探针结合HRP免疫分析测定试剂盒”的准确性、特异性、精密性、灵敏度和稳定性是完全符合条件的。
实验例2
克百威添加回收率试验
为了检验克百威胶体金复合探针结合HRP免疫分析测定试剂盒的实际应用性能，我们将克百威标准溶液加入到自来水中来模拟被克百威的水样，通过标准添加回收实验来测定自来水中克百威的浓度，添加浓度为10ng/mL、50ng/mL和100ng/mL的克百威，检测结果见表2。
表2样品中克百威的添加回收率
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。