一种提高小麦幼胚再生率的组织培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高小麦幼胚再生率的组织培养方法。本发明所提供的提高小麦幼胚再生率的组织培养方法，包括如下步骤：1）将待培养的小麦幼胚置于愈伤组织诱导培养基上进行培养，得到胚性愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基中含有终浓度为50-200mg/L阿拉伯半乳聚糖蛋白；2）将所述胚性愈伤组织转移到分化培养基上进行培养，得到再生小麦植株。本发明通过在SD2愈伤组织诱导培养基中添加AGP，发现小麦幼胚再生率明显提高，且对再生容易的小麦品种如扬麦18、京冬18和再生较难的小麦品种如济麦22、宁春4号均有效果，这对于利用基因工程途径和细胞工程途径改良优良小麦品种具有重要意义。
【专利说明】—种提高小麦幼胚再生率的组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物组织培养领域，涉及一种提高小麦幼胚植株再生率的组织培养方法。
【背景技术】
[0002]高效组织培养植株再生是开展小麦细胞工程育种和转基因育种的关键环节。目前，小麦再生体系研究中利用的外植体多为胚性或处于分化过程中的组织和器官，如幼胚、成熟胚、幼穗、花药、小孢子、顶端分生组织等，以根、叶片、胚芽鞘等分化程度较高的器官为外植体的研究也有报道。大多数研究表明，小麦幼胚培养相比其他外植体组织培养而言，其愈伤组织诱导率和植株再生率均比较高。为了提高小麦幼胚培养再生植株的效率，国内外学者详细研究了影响小麦幼胚培养的因素，包括基因型、植物激素、幼胚大小、培养基组成、碳源、有机添加物、氧气浓度、干燥处理和培养程序等。同时，发现小麦供体植株生长的环境条件，如温度、光照、营养、湿度等，通过影响小麦幼胚的生理状态也影响其再生效果。
[0003]阿拉伯半乳聚糖蛋白(Arabinogalactan proteins, AGP)是广泛分布在高等植物细胞壁、细胞膜上的一类主要由蛋白质和碳水化合物组成的糖蛋白，在植物生长发育，特别在胚胎发生过程中起重要作用。研究发现，从云杉(Picea abies)种子中提取的AGP能够促进其悬浮细胞体细胞胚的发育，从胡萝卜种子中提取得的AGP可以促进其胚性细胞的增加。在培养基中添加AGP结合剂β-Glc Yariv，再生性能较好的菊苣品系其叶片再生性能完全受到抑制，β-Glc Yariv移除后菊苣叶片叶片又恢复再生能力，且AGP基因在胚性细胞形成过程中的表达上调。培养基中添加10mg/L AGP对油菜、大白菜小孢子胚胎发生及胚性细胞分化过程有促进作用，降低了胚状体褐化和死亡现象，显著提高了成苗率。培养基中添加10mg/L AGP对小麦小孢子胚状体发生同样具有促进作用，降低了小孢子死亡率和白化苗发生率。但是，关于AGP在小麦幼培养`中的作用及其适宜浓度还没有报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种提高小麦幼胚植株再生率的组织培养方法。
[0005]本发明所提供的提高小麦幼胚植株再生率的组织培养方法，具体可包括如下步骤:
[0006](I)将待培养的小麦幼胚置于愈伤组织诱导培养基上进行培养，得到胚性愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基中含有终浓度为50-200mg/L阿拉伯半乳聚糖蛋白(Arabinogalactan proteins, AGP)；
[0007](2)将所述胚性愈伤组织转移到分化培养基上进行培养，得到再生小麦植株。
[0008]在所述方法中，所述小麦幼胚可为心形期幼胚，具体为开花授粉后13-14天，直径为1.0-1.2mm的小麦幼胚。
[0009]在本发明中，所述愈伤组织诱导培养基具体为在SD2培养基中加入终浓度为50-200mg/L阿拉伯半乳聚糖蛋白后得到的培养基。[0010]在所述方法中，所述愈伤组织诱导培养基中的所述阿拉伯半乳聚糖蛋白是在所述SD2培养基冷却至65°C左右时加入的。
[0011]其中，所述SD2培养基组成为:MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、VBJ.0mg/L、谷氨酰胺 150mg/L、2,4-D2.0mg/L、鹿糖 30g/L、植物凝胶(Phytagel)2.4g/L,pH 值 6.0。以上各浓度均为相应物质在所述SD2培养基中的终浓度。
[0012]具体而言，所述SD2培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下:NH4N031650mg/L、KN031900mg/L、CaCl2.2H20440mg/L、MgSO4.7H20370mg/L、KH2P041700mg/L、KI0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4.4H2022.3mg/L、ZnSO4.7H208.6mg/L、Na2MoO4.2H200.25mg/L、CuSO4 *5H200.025mg/L,CoCl2 *6H200.025mg/L, FeSO4 *7H2027.8mg/L、Na2-EDTA *2H2037.3mg/L、鹿糖 30g/L、维生素 B1Img/l谷氨酰胺 150mg/L、2,4-D2.0mg/L、植物凝胶(Phytagel)2.4g/L，pH 值为 6.0ο
[0013]在所述方法中，所述分化培养基可为FHCK培养基。
[0014]其中，所述FHCK培养基的组成为:MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、MS维生素、蔗糖20g/L、植物凝胶(Phytagel)2.4g/L，pH值6.0。以上各浓度均为相应物质在所述FHCK培养基中的终浓度。
[0015]具体而言，所述FHCK培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下:NH4N031650mg/L、KN031900mg/L、CaCl2.2H20440mg/L、MgSO4.7H20370mg/L、KH2P041700mg/L、KI0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4.4H2022.3mg/L、ZnSO4.7H208.6mg/L、Na2MoO4.2H200.25mg/L、CuSO4 *5H200.025mg/L,CoCl2 *6H200.025mg/L, FeSO4 *7H2027.8mg/L、Na2-EDTA *2H2037.3mg/L、维生素 Bilmg/UVujj0.5mg/L、烟酸 0.5mg/L、甘氨酸 2mg/L、肌醇 100mg/L、鹿糖 20g/L、植物凝胶(Phytagel) 2.4g/L, pH 值为 6.0。
[0016]在所述方法的步骤(I)中，将所述待培养的小麦幼胚置于所述愈伤组织诱导培养基上(盾片朝上)进行培养，其培养条件具体可为:黑暗、温度24-26°C (如25°C)、时间20-25天(如21天)。
[0017]在所述方法的步骤(2)中，将所述胚性愈伤组织转移到所述分化培养基上进行培养，其培养条件具体可为:光照10小时/天、光强3500LX、温度24-26°C (如25°C)、时间15-25 天(如 21 天)。
[0018]进一步，在所述方法中，所述愈伤组织诱导培养基中所述阿拉伯半乳聚糖蛋白的终浓度为50-100mg/L。
[0019]在所述方法中，所述小麦的品种具体可为如下中的至少一种:扬麦18、中国春、济麦22、京冬18、川农16和宁春4号。
[0020]更加具体的，当所述小麦为扬麦18时，所述愈伤组织诱导培养基中所述阿拉伯半乳聚糖蛋白的终浓度以50-200mg/L为好；当所述小麦为济麦22或宁春4号时，所述愈伤组织诱导培养基中所述阿拉伯半乳聚糖蛋白的终浓度以50-100mg/L为好；当所述小麦为中国春或川农16时，所述愈伤组织诱导培养基中所述阿拉伯半乳聚糖蛋白的终浓度以100mg/L为好；当所述小麦为京冬18时，所述愈伤组织诱导培养基中所述阿拉伯半乳聚糖蛋白的终浓度以50mg/L为好。
[0021]本发明的再一个目的是提供一种培养基。
[0022]本发明所提供的培养基为在所述SD2培养基中加入终浓度为50_200mg/L阿拉伯半乳聚糖蛋白后得到的培养基。
[0023]所述培养基可用于提高所述小麦幼胚组织培养植株再生率。
[0024]在本发明中，以上所有的所述阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGP)均具体为Sigma公司产品(G9752)。
[0025]以上所有的所述“在所述SD2培养基中加入终浓度为50_200mg/L阿拉伯半乳聚糖蛋白”，均为:向所述SD2培养基中加入浓度为50mg/mL阿拉伯半乳聚糖蛋白水溶液(AGP储藏液)，使SD2培养基中所述阿拉伯半乳聚糖蛋白的终浓度为50-200mg/L。
[0026]现有的小麦幼胚培养方法中没有在愈伤组织诱导培养基中添加AGP的步骤，本发明在小麦幼胚培养愈伤组织诱导培养基中添加不同浓度AGP，在适宜AGP浓度下显著提高了多个小麦基因型幼胚培养植株再生率，具有很好的实际应用价值。
[0027]实验证明,利用本 发明方法对小麦品种扬麦18的幼胚在添加不同浓度AGP (Omg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L和500mg/L)的SD2愈伤组织诱导培养基上进行培养。结果发现，AGP 浓度 50mg/L、100mg/L、200mg/L 时再生率分别为 283.16%、183.67%、254.44%,与不添加AGP的对照(再生率为141.18%)相比有显著提高，AGP浓度500mg/L时再生率为148.96%，与不添加AGP的对照无显著差异，表明AGP对于小麦幼胚再生的适宜用量为50-200mg/L。本发明的发明人进一步利用该方法对小麦品种中国春、济麦22、京冬18、川农16和宁春4号的幼胚在添加AGP50mg/L、100mg/L的SD2愈伤组织诱导培养基上进行培养，以不添加AGP的SD2培养基为对照，结果发现，愈伤组织诱导培养基中添加50mg/L AGP显著提高了济麦22、京冬18和宁春4号幼胚的再生率，愈伤组织诱导培养基中添加100mg/L AGP显著提高了中国春、济麦22、川农16和宁春4号幼胚的再生率。以上结果表明小麦幼胚愈伤组织诱导培养基中添加适宜浓度50-100mg/L AGP对提高小麦幼胚再生率具有普遍作用，不同小麦品种适宜添加的AGP浓度略有不同。
[0028]综合而言，本发明通过在SD2愈伤组织诱导培养基中添加AGP，发现小麦幼胚再生率明显提高，且对再生容易的小麦品种如扬麦18、京冬18和再生较难的小麦品种如济麦
22、宁春4号均有效果，这对于利用基因工程途径和细胞工程途径改良优良小麦品种具有
重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1为不同浓度的AGP对小麦品种扬麦18幼胚再生的影响。其中，A表不在含AGP50mg/L培养基上的再生效果；B表示在含AGP100mg/L培养基上的再生效果；(:表示在含AGP200mg/L培养基上的再生效果；D表示在含AGP500mg/L培养基上的再生效果；E表示在含AGP0mg/L培养基上的再生效果。
[0030]图2为不同小麦品种在适宜浓度AGP下的再生效果比较。其中，A表示中国春在对照培养基(AGP0mg/L)上的再生效果；B表示中国春在含AGP100mg/L培养基上的再生效果；C表示济麦22在对照培养基(AGP0mg/L)上的再生效果；D表示济麦22在含AGP50mg/L培养基上的再生效果；E表示京冬18在对照培养基(AGP0mg/L)上的再生效果；F表示京冬18在含AGP50mg/L培养基上的再生效果；G表示川农16在对照培养基(AGPOmg/L)上的再生效果；H表不川农16在含AGP100mg/L培养基上的再生效果；1表不宁春4号在对照培养基(AGP0mg/L)上的再生效果J表示宁春4号在含AGP100mg/L培养基上的再生效果。【具体实施方式】
[0031]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0032]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033]小麦幼胚的定义:小麦子房授粉后发育13-14天的小麦幼嫩籽粒上剥取的小麦未成熟胚。
[0034]小麦品种扬麦18、中国春、济麦22、京冬18、川农16和宁春4号:中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心无偿向社会提供。
[0035]小麦品种中国春、宁春4号:记载于“石珍源等.小麦大龄幼胚再生性能改进与农杆菌转化.中国农业科学，2011，44 (2):225-232” 一文中；
[0036]小麦品种扬麦18:记载于“李欣等.十二个小麦新品种成熟胚再生性能与农杆菌侵染敏感性评价.中国农业科技导报,2012，14(2):40-46”一文中；
[0037]小麦品种济麦22:记载于 “Tao et al.1mprovement of Plant Regenerationfrom Immature Embryos of Wheat Infected Agrobacterium tumefaciens.AgriculturalSciences in China，2011，10 (3): 317-326” 一文中；
[0038]小麦品种点冬18:记载于“单福华等.国审冬小麦新品种点冬18的选育.北点农业，2012,6:20-21” 一文中；
[0039]小麦品种川农16:记载于“李伟等.小麦新品种川农16的分子鉴定.麦类作物学报，2004，24(1):6-10” 一文中；
[0040]其中，小麦品种中国春、济麦2`2和宁春4号属于幼胚再生力较低的小麦基因型，详见参考文献“She et al.Efficient Regeneration Porential is Closely Related toAuxin Exposure Time and Catalase Metabolism During the Somatic Embryogenesisof Immature Embryos in Triticum aestivum L.Molecular Biotechnology,2013,54:451-460”。
[0041]SD2培养基:溶剂为水，溶质及其浓度如下:NH4N031650mg/L、KN031900mg/L、CaCl2.2H20440mg/L、MgSO4.7H20370mg/L、KH2PO41700mg/L、KI0.83mg/L、H3B036.2mg/L、MnSO4.4H2022.3mg/L、ZnSO4.7H208.6mg/L、Na2MoO4.2H200.25mg/L、CuSO4.5H200.025mg/L、CoCl2.6H200.025mg/L, FeSO4.7H2027.8mg/L、Na2-EDTA.2H2037.3mg/L、蔗糖 30g/L、维生素 B1ImgZU谷氨酰胺 150mg/L、2,4-D2.0mg/L、植物凝胶(Phytagel )2.4g/L,pH 值为 6.0。采用121°C高压湿热灭菌15分钟。
[0042]FHCK培养基:溶剂为水，溶质及其浓度如下:NH4N031650mg/L、KN031900mg/L、CaCl2.2H20440mg/L、MgSO4.7H20370mg/L、KH2PO41700mg/L、KI0.83mg/L、H3B036.2mg/L、MnSO4.4H2022.3mg/L、ZnSO4.7H208.6mg/L、Na2MoO4.2H200.25mg/L、CuSO4.5H200.025mg/UCoCl2.6H200.025mg/L, FeSO4.7H2027.8mg/L、Na2-EDTA.2H2037.3mg/L、维生素 BJmg/L、VB60.5mg/L、烟酸 0.5mg/L、甘氨酸 2mg/L、肌醇 100mg/L、鹿糖 20g/L、植物凝胶(Phytagel)
2.4g/L，pH值为6.0。采用121°C高压湿热灭菌15分钟。
[0043]阿拉伯半乳聚糖蛋白(Arabinogalactanproteins, AGP):Sigma 公司产品(G9752)，准确称取Ig AGP，溶解在20ml蒸馏水中，配制浓度为50mg/ml的储藏液，用
0.25 μ m规格的微孔滤膜过滤灭菌，4°C冷柜中低温避光保存。使用时，在SD2培养基高压湿热灭菌后在室温下冷却至65°C左右，根据处理加入不同用量经过滤灭菌的AGP储藏液。
[0044]实施例1、SD2培养基中添加不同浓度AGP对小麦扬麦18幼胚再生效果的影响
[0045]本实施例中，以小麦品种扬麦18为试验对象，其小麦幼胚的组织培养步骤如下:
[0046]一、小麦幼穗的获得
[0047]将小麦品种扬麦18种植在中国农业科学院作物科学研究所温室(2011年9月)，开花授粉后13-14天(2012年I月)，收集小麦扬麦18未成熟麦穗，此时幼胚为心形期幼胚，其直径为1.0-1.2mm。
[0048]二、小麦未成熟籽粒灭菌
[0049]从步骤一所得的小麦品种扬麦18未成熟麦穗上取其未成熟籽粒,70% (体积分数)酒精表面消毒I分钟，15% (体积分数)次氯酸钠灭菌15-20分钟，无菌水冲洗4-5次。
[0050]三、组织培养
[0051]1、诱导培养产生胚性愈伤组织
[0052]用灭过菌的手术刀片在未成熟籽粒上切去胚尖，然后将小麦幼胚取出，盾片朝上接种至添加不同终浓度AGP (50mg/L、100mg/L、200mg/L和500mg/L)的SD2培养基上，每个培养皿接种30-35枚小麦幼胚，以不添加AGP的SD2培养基为对照，25°C、黑暗条件下培养21天诱导胚性愈伤组织。
[0053]2、分化培养得到小麦再生植株
[0054]将步骤I获得的胚性愈伤组织转移到FHCK培养基上培养21天(光照时间为每天10小时，光照强度为3500LX，温度为25°C)，分化得到小麦再生绿芽。
[0055]其间，记录接种幼胚数，统计愈伤组织数、胚性愈伤组织数、分化愈伤数、再生芽数、胚性愈伤组织诱导率、分化愈伤率、再生率。实验设3次重复，结果取平均值。
[0056]胚性愈伤组织诱导率(%)=(胚性愈伤组织数+接种幼胚数)XlOO
[0057]分化愈伤率(%)=(分化愈伤数+接种幼胚数)XlOO
[0058]再生率(%)=(再生芽数+接种幼胚数)X 100
[0059]四、不同浓度AGP对小麦幼胚再生效果的比较
[0060]小麦品种扬麦18幼胚经在含不同浓度AGP培养基上培养后的再生结果如表I和图1所示。从表中可以看出，AGP浓度50mg/L、100mg/L、200mg/L时再生率分别为283.16%、183.67%、254.44%，与不添加AGP的对照(再生率为141.18%)相比有显著提高，差异达显著水平(P〈0.05)。AGP浓度500mg/L时再生率为148.96%，与不添加AGP的对照(再生率为141.18%)几乎相同，表明AGP对于小麦幼胚再生的适宜用量为50-200mg/L。
[0061]表I不同浓度AGP对小麦品种扬麦18幼胚培养再生效果的影响
[0062]
【权利要求】
1.一种提高小麦幼胚再生率的组织培养方法，包括如下步骤: (1)将待培养的小麦幼胚置于愈伤组织诱导培养基上进行培养，得到胚性愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基中含有终浓度为50-200mg/L阿拉伯半乳聚糖蛋白； (2)将所述胚性愈伤组织转移到分化培养基上进行培养，得到再生小麦植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述小麦幼胚为心形期幼胚。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述愈伤组织诱导培养基为在SD2培养基中加入终浓度为50-200mg/L阿拉伯半乳聚糖蛋白后得到的培养基。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述分化培养基为FHCK培养基。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:步骤(I)中，将所述待培养的小麦幼胚置于所述愈伤组织诱导培养基上进行培养，培养条件为:黑暗、温度24-26°C、时间20-25 天。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:步骤(2)中，将所述胚性愈伤组织转移到所述分化培养基上进行培养，培养条件为:光照10小时/天、光强3500Lx、温度24-26°C、时间 15-25 天。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于:所述愈伤组织诱导培养基中所述阿拉伯半乳聚糖蛋白的终浓度为50`-100mg/L。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于:所述小麦的品种为如下中的至少一种:扬麦18、中国春、济麦22、京冬18、川农16和宁春4号。
9.培养基，其特征在于:所述培养基为在SD2培养基中加入终浓度为50-200mg/L阿拉伯半乳聚糖蛋白后得到的培养基。
10.权利要求9所述培养基在提高小麦幼胚组织培养植株再生率中的应用。
【文档编号】A01H4/00GK103444532SQ201310397451
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月4日 优先权日:2013年9月4日
【发明者】叶兴国, 王新敏, 张伟, 王轲, 杜丽璞, 赵佩, 徐惠君 申请人:中国农业科学院作物科学研究所