一种调控杜泊羊骨骼肌生长的myl4基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，提供了一种调控杜泊羊骨骼肌生长的MYL4基因cDNA序列的克隆方法，该基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。应用该基因可以通过对其表达调控进行操作，为实现培育生长速度快的绵羊品种奠定基础，具有重要的现实意义。
【专利说明】-种调控杜泊羊骨骼肌生长的MYL4基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种可以调控杜泊羊骨骼肌 生长的MYL4基因及其在绵羊育种中的应用。
【背景技术】
[0002] 肌球蛋白轻链4 (MYL4)为肌球蛋白轻链家族中的一员，是一种基本性轻链。研究 发现该基因在猪和小鼠骨骼肌发育中差异表达，并且在具有不同生长速度的品种猪的骨骼 肌间的表达也差异显著，因而认为该基因具有调控骨骼肌生长和发育的功能。目前，绵羊基 因组中公布了 MYL4基因的预测序列，还未见到该基因的确切序列报道，并且关于该基因对 肌肉生长和发育的调控机制还不十分清楚。
【发明内容】
[0003] 基于上述的原因，本发明提供了一种可以调控杜泊羊骨骼肌生长的MYL4基因，其 cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，除poly (A)外长为869bp ;该序列中的开放读码框编码193 个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。该基因具有调控骨骼肌生长的功能，应用该基 因可以通过对该基因的表达调控进行操作，为实现培育生长速度快的绵羊品种奠定基础， 具有重要的现实意义。
[0004] 本发明所提供的调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL4基因，其CDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，除poly(A)外长为869bp ;该序列中的开放读码框编码193个氨基酸，氨基酸序 列如SEQ ID NO. 2所示。
[0005] 上述的MYL4基因是通过如下方法获得的：
[0006] (1)杜泊羊肌肉总RNA的提取和反转录：
[0007] 采用TRIzol法提取杜泊羊肌肉组织总RNA，提取的RNA以Agilent 2100 Bioanalyzer进行检测，要求总RNA含量在10 μ g以上且RIN(RNA完整性指标）彡7. 5,并 根据现有技术经Roche公司的cDNA反转录试剂盒反转录合成cDNA第一链；
[0008] (2)MYL4基因 cDNA序列保守区的扩增：
[0009] 比对已有物种MYL4基因的cDNA序列，根据保守区设计上下游引物，以步骤⑴中 的cDNA第一链为模板进行PCR扩增克隆测序得到保守区序列；
[0010] ⑶应用3'降落巢式PCR法对MYL4基因 cDNA序列的3'端进行扩增：
[0011] 根据所得保守区序列设计MYL4基因的3'特异内侧和外侧引物；
[0012] 以3'特异外侧引物和3'通用外侧引物采用退火温度逐渐降落法对上述cDNA第 一链进行第一轮PCR扩增；
[0013] 然后以3'特异内侧引物和3'通用内侧引物采用同样的退火温度逐渐降落法对 第一轮PCR扩增产物进行第二轮PCR扩增；
[0014] 对第二轮PCR产物经克隆测序得到MYL4基因 cDNA序列的：V端序列；
[0015] (4)应用Y RACE法对MYL4基因 cDNA序列的5'端进行扩增：
[0016] 对杜泊羊肌肉组织经TRIzol法所提总RNA依次进行常规的去磷酸化处理、"去帽 子"反应、与接头序列连接并以TaKaRa公司的Y -Full RACE Kit With TAP试剂盒反转 录合成cDNA的第一链；
[0017] 根据所得保守区序列设计MYL4基因的5'特异外侧和特异内侧引物；
[0018] 以5'特异外侧和5'通用外侧引物进行第一轮PCR扩增；
[0019] 以Y特异内侧和Y通用内侧引物进行第二轮PCR扩增；
[0020] 内侧PCR产物经克隆测序得到MYL4基因 cDNA序列的Y端序列；
[0021] (5)全长序列拼接及克隆测序验证：
[0022] 根据重叠区域对上述步骤获得的cDNA的保守区、5'和3'所得序列进行拼接，获 得MYL4基因的全长cDNA序列；设计两端序列为上下游引物，PCR扩增并克隆测序得到MYL4 基因的全长cDNA序列，具有如SEQ ID NO. 1的核苷酸序列。
[0023] 对该cDNA序列进行生物信息学分析，得到该基因编码产生含有193个氨基酸的蛋 白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0024] 之后发明人利用qRT-PCR法测定MYL4基因在生长速度不同的杜泊羊和小尾寒羊 的心、肝、肌肉等组织中的表达量，发现该基因在杜泊羊背最长肌中表达但在小尾寒羊背最 长肌中不表达，表明该基因具有调控骨骼肌生长的功能。
[0025] 综上所述，本发明提供了一种可以调控绵羊骨骼肌生长的MYL4基因，应用该基因 可以通过对该基因的表达调控进行操作，为实现培育生长速度快的绵羊品种奠定基础，具 有重要的现实意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为本发明中杜泊羊MYL4基因 cDNA保守区扩增图，
[0027] 图中M为DL2000分子量标准；另一条为MYL4基因 cDNA保守区序列；
[0028] 图2为本发明中杜泊羊MYL4基因3'端扩增图，
[0029] 图中M为DL2000分子量标准；另一条为MYL4基因 cDNA的3'端序列；
[0030] 图3为本发明中杜泊羊MYL4基因 Y RACE扩增图，
[0031] 图中M为DL2000分子量标准；另一条为MYL4基因 cDNA的5'端序列；
[0032] 图4为本发明中杜泊羊MYL4基因 cDNA全长序列扩增图，
[0033] 图中M为DL2000分子量标准；另一条为MYL4的全长cDNA序列；
[0034] 图5为本发明中MYL4在小尾寒羊和杜泊羊不同组织中的表达水平柱状图，
[0035] 图中A、B、C、D表示杜泊羊各组织间的差异显著性，a、b表示小尾寒羊各组织间的 差异显著性（P〈〇. 05) ;MYL4在杜泊羊的背最长肌中表达而在小尾寒羊背最长肌中不表达。
【具体实施方式】
[0036] 以下结合附图对本发明的上述
【发明内容】
作进一步的详细描述。应理解，这些实施 例仅为了说明本发明而不是为了限制本发明的保护范围。
[0037] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的实验条 件或常规方法，如Sambrook等编著的分子克隆实验手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件。
[0038] 实施例I :杜泊羊背最长肌组织总RNA的提取及反转录
[0039] 取杜泊羊背最长肌约20g，使用康为世纪公司的总RNA提取试剂盒（No. CW0580)提取肌肉组织的总RNA ;将提取的RNA采用Roche公司的cDNA反转录试剂盒 (No. 05081955001)反转录合成cDNA第一链，-20°C保存备用。
[0040] 实施例2 :cDNA保守区序列的克隆与测序
[0041] (1)引物的设计：从NCBI上下载人、猪、牛、鼠等各物种MYL4基因的cDNA序列， 以DNAMN 6. 0软件进行比对获得保守区序列，设计该基因 cDNA的保守区引物为：Fl : GATAGACTTCACTGCTGACCAG，如 SEQ ID NO. 3 所示，和 F2 :CCCAGACATGATGTGCTTG，如 SEQ ID NO. 4所示；
[0042] (2) PCR扩增：以实施例1获得的cDNA第一链为模板，采用TIANGEN的PCR MasterMix试剂盒（KT201)进行PCR扩增；50μ 1扩增体系中包含：PCR MasterMix 25μ 1 ; Fl(10X)2y I ;F2(10X)2y I ;cDNA 第一链 2μ 1。扩增条件为：94°C，5min ;(94°C 30s， 58°C 30s，72°C lmin)35cycles ;72°C，10min。扩增结果见附图 I ;
[0043] (3)扩增条带的回收：PCR扩增产物经I %琼脂糖的TAE凝胶进行电泳凝，切取相 应条带；采用AxyPr印DNA凝胶回收试剂盒（#0691)对PCR产物进行纯化回收；
[0044] (4)回收产物与载体连接：载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8 ;根据扩增产物回 收后凝胶电泳情况将回收产物稀释至标准浓度，依PMD18-T载体试剂盒说明书（No. 6011) 进行连接反应。
[0045] (5)连接产物的转化：取适量连接产物，依TIANGEN公司的大肠杆菌感受态细胞 DH5a (CB101)使用说明进行转化及细菌的培养操作；
[0046] (6)菌液PCR鉴定：吸取1?2 μ 1菌液作模板，依据⑵中PCR扩增体系和条件 进行扩增，1 %琼脂糖凝胶电泳检测目的条带；
[0047] (7)克隆产物的测序分析：如果凝胶检测含有目的条带且较纯，则吸取Iml菌液测 序分析，得到长为475bp的一条保守区目标序列。
[0048] 实施例3 :cDNA 3'端序列的克隆与测序
[0049] 采用降落巢式PCR法克隆cDNA序列的3'端，具体步骤如下：
[0050] (1)引物的设计与合成：根据实施例2所得MYL4基因 cDNA保守区的测序结 果，设计两条上游嵌套式引物，3 ' GSP :CCTGCCCATCCTCCAGCACATCTC，如 SEQ ID NO. 5 所示，和 3 ' NGSP :GGGAGAGAAGATGAGTGAGGCTG，如 SEQ ID NO. 6 所示；并合成两条下 游 3 '通用引物，3 ' -UP :GACTCGAGTCGATCGA，如 SEQ ID NO. 7 所示，和 OligodT-AP : GACTCGAGTCGATCGA(T)18jnSEQIDN0.8K*。
[0051] ⑵反转录合成cDNA第一链：取IOOpg?1μ g实施例1中提取的RNA，加入 OligodT-AP为反转录引物反转录合成cDNA第一链；
[0052] (3)夕卜侧PCR扩增：以3 ' GSP和OligodT-AP为上下游引物，依实施例2中PCR 反应试剂盒体系进行，扩增程序为：98°C，30s ;(98°C，10s ;70°C，30s ;72°C，30s)3cycles ; (98 °C,l〇s ；68 〇C,30s；72 °C, 30s)4cycles ； (98 °C,l〇s ；66 〇C,30s；72 °C, 30s) 5cycles ； (98 °C, 10s ；64 °C, 30s ；72 °C, 30s) 6cycles ； (98 °C, 10s ；62 °C, 30s ；72 °C, 30s) 8cycles ； (98〇C, 10s ；60°C, 30s ；72〇C, 30s) IOcycles ；72〇C, IOmin ；4°C ；
[0053] (4)内侧PCR扩增：以3' NGSP和3' -UP为上下游引物，步骤⑶的扩增产物稀 释30倍为模板，依上述步骤（3)中反应条件和扩增程序进行目的条带的扩增，扩增结果见 附图2;
[0054] (5)PCR产物的克隆测序：扩增条带的回收、与载体连接、连接产物的转化及测序 同实施例2,得到长为319bp的一条序列。
[0055] 实施例4 :cDNA 5'端序列的克隆与测序
[0056] 采用5' RACE法克隆5'端序列，步骤如下：
[0057] (1)引物的设计与合成：根据实施例3所得MYL4基因 cDNA保守区的测序结果， 设计两条下游嵌套式引物,5 ^ GSP :TTGGTAACTCACCTGGGCTAAG，如SEQ ID NO. 9所示，和 5' NGSP :GTCCGGTCAAACAACGAAAAAGC，如 SEQ ID NO. 10 所示；并合成两条上游 5'通用引 *，5,-0uterPrimer:CATGGCTACATGCTGACAGCCTAjnSEQIDN0.1lK*jP5，-Inner Primer :CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG，如 SEQ ID NO. 12 所示。
[0058] (2)mRNA的去磷酸化处理 [0059] ①配制去磷酸反应液：
[0060]
【权利要求】
1. 一种调控杜泊羊骨骼肌生长的MYL4基因，其特征在于：具有如SEQ ID NO. 1所示的 cDNA序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所不。
2. 根据权利要求1所述的MYL4基因，其特征在于：其来源于杜泊羊骨骼肌的肌球蛋白 轻链4。
3. 权利要求1所述的调控骨骼肌生长的MYL4基因，在绵羊育种中的应用。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：通过对MYL4基因的调控实现培育生长速 度快的绵羊育种。
【文档编号】A01K67/027GK104293795SQ201410475790
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月17日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】王建民, 张春兰, 刘冠卿, 刘昭华, 纪志宾, 秦孜娟 申请人:山东农业大学