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本发明涉及一种组合物，其包含协同有效量的(i)表达融合蛋白的重组产孢子外壁(exosporium)的芽孢杆菌属(bacillus)细胞，以及(ii)至少一种杀真菌剂，所述融合蛋白包含：(x)至少一种植物生长刺激蛋白或肽，和(y)将所述融合蛋白定位至芽孢杆菌属细胞的孢子外壁的靶向序列；所述杀真菌剂选自本文所公开特定的杀真菌剂，其表现出改进植物生长和/或健康的能力，和/或对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性。此外，本发明涉及该组合物的用途以及一种用于增强植物生长、促进植物健康和/或减少植物和植物部位整体损害的方法。
背景技术：
在作物保护中，持续需要改进植物健康和/或生长的应用。更健康的植物通常会使植物或其产品的产量更高和/或质量更好。
为了促进植物健康，在全世界范围内使用基于无机和有机物质的肥料。肥料可以是单一物质或组合物，并且用于向植物提供养分。肥料施用的一个重大突破是在1840年左右由justusvonliebig所开发的氮基肥料。然而，肥料可导致土壤酸化和土壤中养分平衡的不稳定，包括矿物质的消耗以及盐和重金属的富集。另外，过量的肥料使用可导致土壤动物区系的改变以及污染的地表水和地下水。此外，有害健康的物质如硝酸盐可能在植物和水果中富集。
另外，在全世界范围内使用杀虫剂和杀真菌剂以防治害虫。合成的杀虫剂或杀真菌剂通常是非特异性的，并且因此可作用于除靶生物体之外的生物体，包括其他天然存在的有益生物体。由于其化学性质，它们还可能是有毒且非生物可降解的。全世界的消费者日渐意识到与化学品残留物相关的潜在环境和健康问题(特别是在食品方面)。这导致消费者对于减少使用化学(即，合成的)农药或至少降低其量的压力日益增大。因此，需要管理食物链需求，同时仍能够有效防治害虫。
使用合成杀虫剂或杀真菌剂所引起的另一个问题是，重复和专一性地施用一种杀虫剂或杀真菌剂通常导致抗性动物害虫或微生物的选择。通常，这类菌株对具有相同作用模式的其他活性成分也产生交叉抗性。因此，不再可能使用所述活性化合物来有效防治病原体。然而，开发具有新的作用机制的活性成分是困难且昂贵的。
使用生物防治剂(bca)——其作为植物健康增强剂和/或植物保护剂——是肥料和合成农药的替代物。在某些情况下，bca的有效性与传统杀虫剂和杀真菌剂不在同一水平上，尤其是在严重感染压力的情况下。因此，在某些情况下，生物防治剂、其突变体及由其产生的代谢物(特别是在低施用率下)并不完全令人满意。因此，不断需要开发新的增强植物健康的组合物和/或植物保护组合物(包括与合成的杀真菌剂和杀虫剂结合使用的生物防治剂)，以力求满足上述需求。
技术实现要素：
鉴于此，本发明的目的特别是提供组合物，其具有增强的改进植物生长和/或增强植物健康的能力或其表现出增强的对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性。
因此，已发现这些目的由如下文所定义的本发明的组合物来实现。通过施用a)表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞，以及b)至少一种本文所公开的特定杀真菌剂，所述融合蛋白包括：(i)至少一种选自以下的植物生长刺激蛋白或肽：产生或活化植物生长刺激化合物中所涉及的酶，降解或修饰细菌、真菌或植物养分来源的酶，以及保护植物免受病原体或害虫侵袭的蛋白或肽，和(ii)将所述融合蛋白定位至芽孢杆菌属细胞的孢子外壁的靶向序列，能够优选以超加性的方式增加(i)植物生长、植物产量和/或植物健康和/或(ii)对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性。
在本文中提及靶向序列、孢子外壁蛋白、孢子外壁蛋白片段、融合蛋白和表达这类融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞不应被认为是独立的实施方案。相反，在整个本申请中，提及靶向序列、孢子外壁蛋白、孢子外壁蛋白片段、融合蛋白和表达这类融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞应被认为是仅以与一种或多种本文所述的特定杀真菌剂组合(且优选是协同组合)的方式被公开并要求保护。此外，提及“本文所公开的特定杀真菌剂”旨在包括以下段落[000185]-[000187]中所述的杀真菌剂。
本发明涉及一种组合物，其包含协同有效量的a)表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞，以及b)至少一种本文所公开的特定的杀真菌剂，所述融合蛋白包含：(i)至少一种选自以下的植物生长刺激蛋白或肽：产生或活化植物生长刺激化合物中所涉及的酶，降解或修饰细菌、真菌或植物养分来源的酶，或保护植物免受病原体侵袭的蛋白或肽，和(ii)将所述融合蛋白定位至芽孢杆菌属细胞的孢子外壁的靶向序列。
在一些实施方案中，所述靶向序列包含：与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；包含seqidno:1的氨基酸1-35的靶向序列；包含seqidno:1的氨基酸20-35的靶向序列；包含seqidno:1的氨基酸22-31的靶向序列；包含seqidno:1的氨基酸22-33的靶向序列；包含seqidno:1的氨基酸20-31的靶向序列；包含seqidno:1的靶向序列；或包含与seqidno:2具有至少85％同一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白。
在一些实施方案中，所述产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞是蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)家族成员的细胞。所述重组蜡样芽孢杆菌家族成员可为炭疽芽孢杆菌(bacillusanthracis)、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)、蕈状芽孢杆菌(bacillusmycoides)、假蕈状芽孢杆菌(bacilluspseudomycoides)、bacillussamanii、bacillusgaemokensis、韦氏芽孢杆菌(bacillusweihenstephensis)、bacillustoyoiensis中任一种或其组合。在其他实施方案中，重组芽孢杆菌属细胞为苏云金芽孢杆菌bt013a的细胞。
在某些方面，所述融合蛋白包含在产生或活化植物生长刺激化合物中所涉及的酶，所述酶选自3-羟基丁酮还原酶、吲哚-3-乙酰胺水解酶、色氨酸单加氧酶、乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶、丙酮酸脱羧酶、双乙酰还原酶、丁二醇脱氢酶、氨基转移酶、色氨酸脱羧酶、胺氧化酶、吲哚-3-丙酮酸脱羧酶、吲哚-3-乙醛脱氢酶、色氨酸侧链氧化酶、腈水解酶(nitrilehydrolase)、腈水解酶(nitrilase)、肽酶、蛋白酶、磷酸腺苷异戊烯转移酶、磷酸酶、腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶、cyp735a、5'核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、玉米素顺-反异构酶、玉米素o-葡萄糖基转移酶、β-葡糖苷酶、顺-羟化酶、ck顺-羟化酶、ckn-葡萄糖基转移酶、2,5-核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、嘌呤核苷磷酸化酶、玉米素还原酶、羟胺还原酶、2-酮戊二酸双加氧酶、赤霉素2b/3b水解酶、赤霉素3-氧化酶、赤霉素20-氧化酶、脱乙酰壳多糖酶、壳多糖酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶以及参与产生结瘤(nod)因子的酶。
在其他方面，所述融合蛋白包含降解或修饰细菌、真菌或植物养分来源的酶，所述酶选自纤维素酶、脂肪酶、木质素氧化酶、蛋白酶、糖苷水解酶、磷酸酶、固氮酶、核酸酶、酰胺酶、硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、淀粉酶、氨氧化酶、木质酶、葡糖苷酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、果胶酶、葡聚糖酶、硫酸酯酶、尿素酶、木聚糖酶和铁载体。
在其他方面，所述融合蛋白包含保护植物免受病原体侵袭的蛋白或肽，所述蛋白或肽具有抗细菌活性、抗真菌活性或抗细菌和抗真菌活性。这种蛋白可包括细菌素、溶菌酶、溶菌酶肽、铁载体、非核糖体活性肽、伴清蛋白、白蛋白、乳铁蛋白、乳铁蛋白肽、tasa或抗生蛋白链菌素。
在一些实施方案中，所述至少一种杀真菌剂选自双苯三唑醇(bitertanol)、联苯吡菌胺(bixafen)、糠菌唑(bromuconazole)、多菌灵(carbendazim)、氯环丙酰胺(carpropamid)、苯氟磺胺(dichlofluanid)、咪唑菌酮(fenamidone)、环酰菌胺(fenhexamid)、三苯基乙酸锡(fentinacetate)、毒菌锡(fentinhydroxide)、氟吡菌胺(fluopicolide)、氟吡菌酰胺(fluopyram)、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、氟喹唑(fluquinconazole)、乙磷酸(fosetyl)、异菌脲(iprodione)、异丙菌胺(iprovalicarb)、异噻菌胺(isotianil)、苯氧菌胺(metominostrobin)、呋酰胺(ofurace)、戊菌隆(pencycuron)、戊苯吡菌胺(penflufen)、丙氯灵(prochloraz)、霜霉威(propamocarb)、丙森锌(propineb)、丙硫菌唑(prothioconazole)、嘧霉胺(pyrimethanil)、螺环菌胺(spiroxamine)、戊唑醇(tebuconazole)、甲苯磺菌胺(tolylfluanid)、三唑酮(triadimefon)、三唑醇(triadimenol)、咪唑嗪(triazoxide)、肟菌酯(trifloxystrobin)、n-[5-氯-2-(三氟甲基)苄基]-n-环丙基-3-(二氟甲基)-5-氟-1-甲基-1h-吡唑-4-甲酰胺以及2,6-二甲基-1h,5h-[1,4]二硫己烷[2,3-c:5,6-c']联吡咯-1,3,5,7(2h,6h)-四酮。
在其他实施方案中，所述至少一种杀真菌剂选自多菌灵、氟喹唑、异噻菌胺、戊菌隆、戊苯吡菌胺、丙硫菌唑、戊唑醇和肟菌酯。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含协同有效量的a)表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞，以及b)至少一种杀真菌剂，所述融合蛋白包含：(i)至少一种选自以下的植物生长刺激蛋白或肽：产生或活化植物生长刺激化合物中所涉及的酶和降解或修饰细菌、真菌或植物养分来源的酶或至少一种保护植物免受病原体侵袭的蛋白或肽，和(ii)将所述融合蛋白定位至芽孢杆菌属细胞的孢子外壁的靶向序列；所述杀真菌剂选自多菌灵、氟喹唑、异噻菌胺、戊菌隆、戊苯吡菌胺、丙硫菌唑、氟吡菌酰胺、戊唑醇和肟菌酯。
在上述实施方案的一个具体方面，(i)所述至少一种杀真菌剂为多菌灵；(ii)所述靶向序列包含与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；(iii)所述植物生长刺激蛋白或肽包含内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶，优选分别与seqidno:107、108和109具有至少95％序列同一性；以及(iv)所述重组蜡样芽孢杆菌家族成员细胞包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌的细胞。在另一个具体的实施方案中，所述重组蜡样芽孢杆菌家族成员细胞为苏云金芽孢杆菌bt013a的细胞。
在上述实施方案的一个具体方面，(i)所述至少一种杀真菌剂为氟喹唑；(ii)所述靶向序列包含与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；(iii)所述植物生长刺激蛋白或肽包含内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶，优选分别与seqidno:107、108和109具有至少95％序列同一性；以及(iv)所述重组蜡样芽孢杆菌家族成员细胞包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌的细胞。在另一个具体的实施方案中，所述重组蜡样芽孢杆菌家族成员细胞为苏云金芽孢杆菌bt013a的细胞。
在上述实施方案的一个具体方面，(i)所述至少一种杀真菌剂为异噻菌胺；(ii)所述靶向序列包含与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；(iii)所述植物生长刺激蛋白或肽包含内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶，优选分别与seqidno:107、108和109具有至少95％序列同一性；以及(iv)所述重组蜡样芽孢杆菌家族成员细胞包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌的细胞。在另一个具体的实施方案中，所述重组蜡样芽孢杆菌家族成员细胞为苏云金芽孢杆菌bt013a的细胞。
在上述实施方案的一个具体方面，(i)所述至少一种杀真菌剂为戊菌隆；(ii)所述靶向序列包含与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；(iii)所述植物生长刺激蛋白或肽包含内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶，优选分别与seqidno:107、108和109具有至少95％序列同一性；以及(iv)所述重组蜡样芽孢杆菌家族成员细胞包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌的细胞。在另一个具体的实施方案中，所述重组蜡样芽孢杆菌家族成员细胞为苏云金芽孢杆菌bt013a的细胞。
在上述实施方案的一个具体方面，(i)所述至少一种杀真菌剂为戊苯吡菌胺；(ii)所述靶向序列包含与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；(iii)所述植物生长刺激蛋白或肽包含内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶，优选分别与seqidno:107、108和109具有至少95％序列同一性；以及(iv)所述重组蜡样芽孢杆菌家族成员细胞包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌的细胞。在另一个具体的实施方案中，重组蜡样芽孢杆菌家族成员细胞为苏云金芽孢杆菌bt013a的细胞。
在上述实施方案的一个具体方面，(i)所述至少一种杀真菌剂为丙硫菌唑；(ii)所述靶向序列包含与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；(iii)所述植物生长刺激蛋白或肽包含内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶，优选分别与seqidno:107、108和109具有至少95％序列同一性；以及(iv)所述重组蜡样芽孢杆菌家族成员细胞包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌的细胞。在另一个具体的实施方案中，所述重组蜡样芽孢杆菌家族成员细胞为苏云金芽孢杆菌bt013a的细胞。
在上述实施方案的一个具体方面，(i)所述至少一种杀真菌剂为氟吡菌酰胺；(ii)所述靶向序列包含与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；(iii)所述植物生长刺激蛋白或肽包含内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶，优选分别与seqidno:107、108和109具有至少95％序列同一性；以及(iv)所述重组蜡样芽孢杆菌家族成员细胞包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌的细胞。
在上述实施方案的一个具体方面，(i)所述至少一种杀真菌剂为肟菌酯；(ii)所述靶向序列包含与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；(iii)所述植物生长刺激蛋白或肽包含内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶，优选分别与seqidno:107、108和109具有至少95％序列同一性；以及(iv)所述重组蜡样芽孢杆菌家族成员细胞包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌的细胞。在另一个具体的实施方案中，所述重组蜡样芽孢杆菌家族成员细胞为苏云金芽孢杆菌bt013a的细胞。
在上述实施方案的一个具体方面，(i)所述至少一种杀真菌剂为戊唑醇；(ii)所述靶向序列包含与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％；(iii)所述植物生长刺激蛋白或肽包含内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶，优选分别与seqidno:107、108和109具有至少95％序列同一性；以及(iv)所述重组蜡样芽孢杆菌家族成员细胞包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌的细胞。在另一个具体的实施方案中，所述重组蜡样芽孢杆菌家族成员细胞为苏云金芽孢杆菌bt013a的细胞。
在一些方面，所述组合物还包含至少一种选自以下的助剂：填充剂、溶剂、自发促进剂、载体、乳化剂、分散剂、防霜剂、增稠剂和佐剂。
在其他方面，本发明涉及用本文所公开的任何组合物处理的种子。
此外，本发明涉及所公开的组合物作为杀真菌剂和/或杀虫剂的用途。在某些方面，所公开的组合物用于减少由昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体引起的植物和植物部位的整体损害以及采收的果实或蔬菜的损失。在其他方面，所公开的组合物用于增强植物生长和/或促进植物健康。
另外，本发明涉及一种处理植物、植物部位(如种子、根、根茎、球茎、鳞茎或块茎)，和/或植物或植物部位生长的地点或其附近(如土壤)以增强植物生长和/或促进植物健康的方法，所述方法包括以下步骤：同时或依次地向植物、植物部位和/或植物的地点施用协同有效量的a)表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞，以及b)至少一种杀真菌剂，所述融合蛋白包含：(i)至少一种选自以下的植物生长刺激蛋白或肽：产生或活化植物生长刺激化合物中所涉及的酶，降解或修饰细菌、真菌或植物养分来源的酶，以及保护植物免受病原体侵袭的蛋白或肽，和(ii)将所述融合蛋白定位至芽孢杆菌属细胞的孢子外壁的靶向序列；所述杀真菌剂选自本文所公开的特定的杀真菌剂，其表现出对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种减少由昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体引起的植物和植物部位的整体损害，以及减少采收果实或蔬菜的损失的方法，其包括以下步骤：同时或依次地向植物、植物部位(如种子、根、根茎、球茎、鳞茎或块茎)，和/或植物或植物部位生长的地点或其附近(如土壤)施用协同有效量的a)表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞，以及b)至少一种杀真菌剂，所述融合蛋白包含：(i)至少一种选自以下的植物生长刺激蛋白或肽：产生或活化植物生长刺激化合物中所涉及的酶，降解或修饰细菌、真菌或植物养分来源的酶，以及保护植物免受病原体侵袭的蛋白或肽，和(ii)将所述融合蛋白定位至芽孢杆菌属细胞的孢子外壁的靶向序列；所述杀真菌剂选自本文所公开的特定杀真菌剂，其表现出抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性。
在以上段落中，术语“包含(comprise)”或其任何派生词(例如包含(comprising)、包含(comprises))可以用“由...组成”或其适用的相应派生词替换。
附图说明
图1示出了炭疽芽孢杆菌sterne菌株bcla的氨基-末端部分的氨基酸序列与蜡样芽胞杆菌家族成员的各种孢子外壁蛋白的相应区域的比对。
具体实施方式
通常，“杀虫的”意指物质提高植物害虫的死亡率或抑制其生长速率的能力。该术语在本文中用于描述物质表现出抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的活性的特性。就本发明而言，术语“害虫”包括昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体。
所指示的nrrl或atcc登录号的变体还可被定义为这样的菌株，其基因组序列与所示nrrl或atcc登录号的基因组具有大于85％、更优选大于90％或更优选大于95％的序列同一性。多核苷酸或多核苷酸区(或多肽或多肽区)与另一序列具有一定的“序列同一性”百分比(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)意指，当进行对比时，该百分比的碱基(或氨基酸)在比较这两个序列时是相同的。该对比和同源性百分比或序列同一性可使用本领域中已知的软件程序确定，例如记载于currentprotocolsinmolecularbiology(f.m.ausubel,etal.,eds.,1987)增刊30，第7.7.18节，表7.7.1.中的那些。
nrrl是美国农业研究菌种保藏中心(agriculturalresearchserviceculturecollection)的缩写，其地址为美国伊利诺伊州，皮奥里亚市，北部大学街1815号，美国农业部农业研究服务局，农业应用研究国家中心，邮编61604。
attc是美国典型菌种保藏中心(americantypeculturecollection)的缩写，其地址为美国弗吉尼亚州，马纲萨斯市，大学林荫大道10801号，atcc专利保藏中心，邮编10110。
本文所述的具有前缀为nrrl或atcc的登录号的所有菌株已经按照国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约保藏在上述各保藏机构。
“产生或活化植物生长刺激化合物中所涉及的酶”包括在刺激植物生长或改变植物结构的化合物的生物合成途径中催化任何步骤的任何酶；或将刺激植物生长或改变植物结构的化合物的无活性或活性较小的衍生物催化转化为所述化合物的活性或更大活性形式的任何酶。这类化合物包括但不限于，例如小分子植物激素如生长素和细胞分裂素、生物活性肽以及由根际中的细菌或真菌合成的小植物生长刺激分子(例如，2,3-丁二醇)。
本文使用的“植物免疫系统增强蛋白或肽”包括对植物免疫系统具有有益作用的任何蛋白或肽。
本文使用的术语“植物生长刺激蛋白或肽”包括在暴露于蛋白或肽的植物中增加植物生长的任何蛋白或肽。
术语“促进植物生长”和“刺激植物生长”在本文中可互换使用，并且是指增强或增加植物的高度、重量、叶尺寸、根尺寸或茎尺寸中的至少一个，增加植物的蛋白质产量或增加植物的谷物产量的能力。
本文使用的“保护植物免受病原体侵袭的蛋白或肽”包括使暴露于所述蛋白或肽的植物较不易受病原体感染的任何蛋白或肽。
本文使用的“增强植物的胁迫抗性的蛋白或肽”包括使暴露于所述蛋白或肽的植物对胁迫更具有抗性的任何蛋白或肽。
术语“植物结合蛋白或肽”是指能特异性地或非特异性地结合至植物的任何部位(例如，植物的根或地上部分如叶子、茎、花或果实)或结合至植物物质的任何肽或蛋白。
本文使用的术语“靶向序列”是指使更长的多肽或蛋白定位至蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁的多肽序列。
表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞
融合蛋白包含使所述融合蛋白靶向至蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段以及：(a)植物生长刺激蛋白或肽；(b)保护植物免受病原体侵袭的蛋白或肽；(c)增强植物胁迫抗性的蛋白或肽；(d)植物结合蛋白或肽；或(e)植物免疫系统增强蛋白或肽。当在蜡样芽孢杆菌家族成员细菌中表达时，这些融合蛋白被靶向至孢子的孢子外壁层，并且被物理定向以使得蛋白或肽呈现在孢子的外部。
此芽孢杆菌属孢子外壁呈现(bemd)系统可用于向植物(例如，向植物叶子、果实、花、茎或根)或向植物生长介质如土壤递送肽、酶及其他蛋白质。以此方式递送至土壤或另一植物生长介质中的肽、酶和蛋白质在土壤中存留且表现出活性的时间延长。将本文所述的表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞引入土壤或植物的根际中，使得在许多不同土壤条件下有益增强植物生长。使用bemd以产生这些酶使得它们在植物生命的最初几个月持续对植物和根际施加它们的有益结果。
靶向序列、孢子外壁蛋白和孢子外壁蛋白片段
为了便于参考，本文中提及的肽和蛋白序列的seqidno.列于下表1中。
表1.肽序列和蛋白序列
aa＝氨基酸
*炭疽芽孢杆菌sterne菌株bcla与苏云金芽孢杆菌bcla具有100％序列同一性。因此，seqidno:1、2和59还分别表示苏云金芽孢杆菌bcla的氨基酸1-41、全长苏云金芽孢杆菌bcla和苏云金芽孢杆菌bcla的氨基酸1-196。同样，seqidno:60还表示甲硫氨酸残基加苏云金芽孢杆菌bcla的氨基酸20-35。
**蕈状芽孢杆菌假设蛋白tigr03720与蕈状芽孢杆菌假设蛋白wp003189234具有100％序列同一性。因此，seqidno:57和58还分别表示蕈状芽孢杆菌假设蛋白wp003189234的氨基酸1-136和全长蕈状芽孢杆菌假设蛋白wp003189234。
芽孢杆菌属是杆状细菌属。细菌的蜡样芽孢杆菌家族包括以下物种：炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌、bacillussamanii、bacillusgaemokensis、bacillustoyoiensis以及韦氏芽孢杆菌。在胁迫环境条件下，蜡样芽孢杆菌家族细菌经历孢子形成并形成椭圆形内生孢子，所述内生孢子可长时间保持休眠状态。内生孢子的最外层称为孢子外壁并包含由毛发样突出物的外部绒毛包围的基底层。毛发样绒毛上的丝主要由胶原样糖蛋白bcla形成，而基底层由许多不同蛋白构成。另一种胶原相关蛋白bclb也存在于孢子外壁中并暴露于蜡样芽孢杆菌家族成员的内生孢子上。
已显示bcla——表面绒毛的主要成分——附着于孢子外壁上，其氨基-末端(n-末端)位于基底层处且其羧基-末端(c-末端)由孢子向外延伸。
先前发现来自bcla和bclb的n-末端区域的某些序列可用于将肽或蛋白靶向至蜡样芽孢杆菌内生孢子的孢子外壁(参见美国专利申请公开no.2010/0233124和2011/0281316，以及thompsonetal.,“targetingofthebclaandbclbproteinstothebacillusanthracissporesurface,”molecularmicrobiology，70(2)：421-34(2008)，其全文各自以引用的方式纳入本文)。还发现炭疽芽孢杆菌的beta/bas3290蛋白定位至孢子外壁。
特别地，发现来自炭疽芽孢杆菌sterne菌株的bcla的氨基酸20-35足以靶向至孢子外壁。bcla的氨基酸1-41(seqidno:1)与具有相关序列的若干其他蜡样芽胞杆菌家族孢子外壁蛋白和蜡样芽胞杆菌家族蛋白的相应n-末端区域的序列比对示于图1中。由图1可见，在对应于bcla的氨基酸20-41的区域中的所有蛋白中存在高同源性区域。然而，在这些序列中，对应于bcla的氨基酸36-41的氨基酸含有二级结构且不是融合蛋白定位至孢子外壁所必需的。bcla的保守靶向序列区域(seqidno:1的氨基酸20-35)以粗体示于图1中，并且对应于定位至孢子外壁所需的最小靶向序列。在靶向序列内跨越bcla的氨基酸25-35的更高保守区域以下划线标注于图1的序列中，并且是exsfa/bxpb/exsfb和同源物的识别序列，所述exsfa/bxpb/exsfb和同源物在孢子外壁表面上引导并组装所述蛋白。图1中的seqidno:3、5和7的氨基酸序列分别是炭疽芽孢杆菌sterne菌株beta/bas3290的氨基酸1-33、甲硫氨酸继之以炭疽芽孢杆菌sterne菌株bas4623的氨基酸2-43以及炭疽芽孢杆菌sterne菌株bclb的氨基酸1-34。(对于bas4623，发现用甲硫氨酸替代天然蛋白位置1处存在的缬氨酸产生更佳表达。)如从图1可以看出，这些序列各自含有对应于bcla的氨基酸20-35(seqidno:1；以粗体显示)的保守区域，以及对应于bcla的氨基酸20-35的更高保守区域(加下划线)。
来自蜡样芽孢杆菌家族成员的其他蛋白也含有保守靶向区域。具体地，在图1中，seqidno:9是炭疽芽孢杆菌sterne菌株bas1882的氨基酸1-30，seqidno:11是韦氏芽孢杆菌kbab42280基因产物的氨基酸1-39，seqidno:13是韦氏芽孢杆菌kbab43572基因产物的氨基酸1-39，seqidno:15是蜡样芽孢杆菌vd200孢子外壁前导肽的氨基酸1-49，seqidno:17是蜡样芽孢杆菌vd166孢子外壁前导肽的氨基酸1-33，seqidno:19是蜡样芽孢杆菌vd200假设蛋白ikg_04663的氨基酸1-39，seqidno:21是韦氏芽孢杆菌kbab4yvtnβ-螺旋桨蛋白的氨基酸1-39，seqidno:23是韦氏芽孢杆菌kbab4假设蛋白bcerkbab4_2363的氨基酸1-30，seqidno:25是韦氏芽孢杆菌kbab4假设蛋白bcerkbab4_2131的氨基酸1-30，seqidno:27是韦氏芽孢杆菌kbab4含有三螺旋重复的胶原的氨基酸1-36，seqidno:29是蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyco0001_21660的氨基酸1-39，seqidno:31是蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_22540的氨基酸1-30，seqidno:33是蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_21510的氨基酸1-21，seqidno:35是苏云金芽孢杆菌35646胶原三螺旋重复蛋白的氨基酸1-22，seqidno:43是蜡样芽孢杆菌假设蛋白wp_69652的氨基酸1-35，seqidno:45是蜡样芽孢杆菌孢子外壁前导wp016117717的氨基酸1-41，seqidno:47是蜡样芽孢杆菌孢子外壁肽wp002105192的氨基酸1-49，seqidno:49是蜡样芽孢杆菌假设蛋白wp87353的氨基酸1-38，seqidno:51是蜡样芽孢杆菌孢子外壁肽02112369的氨基酸1-39，seqidno:53是蜡样芽孢杆菌孢子外壁蛋白wp016099770的氨基酸1-39，seqidno:55是苏云金芽孢杆菌假设蛋白yp006612525的氨基酸1-36，seqidno:57是蕈状芽孢杆菌假设蛋白tigr03720的氨基酸1-136。如图1所示，这些蛋白的n-末端区域各自含有与bcla(seqidno:1)的氨基酸20-35保守的区域以及对应于bcla的氨基酸25-35的更高保守区域。
包含氨基酸20-35的bcla的任何部分都可用作靶向序列。另外，全长孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段可用于将融合蛋白靶向至孢子外壁。因此，全长bcla或包含氨基酸20-35的bcla片段可用于靶向至孢子外壁。例如，全长bcla(seqidno:2)或bcla的缺乏羧基-末端的中等大小的片段如seqidno:59(bcla的氨基酸1-196)可用于将融合蛋白靶向至孢子外壁。中等大小的片段(如seqidno:59的片段)具有比全长bcla更少的二级结构，并且且已被发现适于用作靶向序列。所述靶向序列还可包含短得多的bcla的部分，该部分包括氨基酸20-35，如seqidno:1(bcla的氨基酸1-41)、seqidno:1的氨基酸1-35、seqidno:1的氨基酸20-35或seqidno:60(连接有甲硫氨酸残基的bcla的氨基酸20-35)。仅包括氨基酸20-35中的一些的甚至更短的bcla片段也表现出将融合蛋白靶向至孢子外壁的能力。例如，靶向序列可包含seqidno:1的氨基酸22-31、seqidno:1的氨基酸22-33或seqidno:1的氨基酸20-31。
或者，下述的包括对应于bcla的氨基酸20-35的氨基酸的任何部分都可用作靶向序列：beta/bas3290、bas4623、bclb、bas1882、kbab42280基因产物、kbab43572基因产物、蜡样芽孢杆菌vd200孢子外壁前导肽、蜡样芽孢杆菌vd166孢子外壁前导肽、蜡样芽孢杆菌vd200假设蛋白ikg_04663、韦氏芽孢杆菌kbab4yvtnβ-螺旋桨蛋白、韦氏芽孢杆菌kbab4假设蛋白bcerkbab4_2363、韦氏芽孢杆菌kbab4假设蛋白bcerkbab4_2131、韦氏芽孢杆菌kbab4含有三螺旋重复的胶原、蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyco0001_21660、蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_22540、蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_21510、苏云金芽孢杆菌35646胶原三螺旋重复蛋白、蜡样芽孢杆菌假设蛋白wp_69652、蜡样芽孢杆菌孢子外壁前导wp016117717、蜡样芽孢杆菌孢子外壁肽wp002105192、蜡样芽孢杆菌假设蛋白wp87353、蜡样芽孢杆菌孢子外壁肽02112369、蜡样芽孢杆菌孢子外壁蛋白wp016099770、苏云金芽孢杆菌假设蛋白yp006612525或蕈状芽孢杆菌假设蛋白tigr03720。如从图1可以看出，beta/bas3290的氨基酸12-27、bas4623的氨基酸23-38、bclb的氨基酸13-28、bas1882的氨基酸9-24、kbab42280基因产物的氨基酸18-33、kbab43572基因产物的氨基酸18-33、蜡样芽孢杆菌vd200孢子外壁前导肽的氨基酸28-43、蜡样芽孢杆菌vd166孢子外壁前导肽的氨基酸12-27、蜡样芽孢杆菌vd200假设蛋白ikg_04663的氨基酸18-33、韦氏芽孢杆菌kbab4yvtnβ-螺旋桨蛋白的氨基酸18-33、韦氏芽孢杆菌kbab4假设蛋白bcerkbab4_2363的氨基酸9-24、韦氏芽孢杆菌kbab4假设蛋白bcerkbab4_2131的氨基酸9-24、韦氏芽孢杆菌kbab4含有三螺旋重复的胶原的氨基酸15-30、蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyco0001_21660的氨基酸18-33、蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_22540的氨基酸9-24、蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_21510的氨基酸1-15、苏云金芽孢杆菌35646胶原三螺旋重复蛋白的氨基酸1-16、蜡样芽孢杆菌假设蛋白wp_69652的氨基酸14-29、蜡样芽孢杆菌孢子外壁前导wp016117717的氨基酸20-35、蜡样芽孢杆菌孢子外壁肽wp002105192的氨基酸28-43、蜡样芽孢杆菌假设蛋白wp87353的氨基酸17-32、蜡样芽孢杆菌孢子外壁肽02112369的氨基酸18-33、蜡样芽孢杆菌孢子外壁蛋白wp016099770的氨基酸18-33、苏云金芽孢杆菌假设蛋白yp006612525的氨基酸15-30以及蕈状芽孢杆菌假设蛋白tigr03720的氨基酸115-130对应于bcla的氨基酸20-35。因此，这些蛋白的包含以上所列的对应氨基酸的任何部分都可用作靶向序列。
此外，包含bcla的氨基酸20-35或任意的以上所列的对应氨基酸的任何氨基酸序列都可用作靶向序列。
因此，靶向序列可包含seqidno:1的氨基酸1-35、seqidno:1的氨基酸20-35、seqidno:1、seqidno:60、seqidno:1的氨基酸22-31、seqidno:1的氨基酸22-33或seqidno:1的氨基酸20-31。或者，靶向序列由seqidno:1的氨基酸1-35、seqidno:1的氨基酸20-35、seqidno:1或seqidno:60组成。或者，靶向序列可由seqidno:1的氨基酸22-31、seqidno:1的氨基酸22-33或seqidno:1的氨基酸20-31组成。或者，孢子外壁蛋白可包含全长bcla(seqidno:2)，或孢子外壁蛋白片段可包含缺乏羧基-末端的bcla的中等大小的片段，如seqidno:59(bcla的氨基酸1-196)。或者，孢子外壁蛋白片段可由seqidno:59组成。
靶向序列还可包含seqidno:3的氨基酸1-27、seqidno:3的氨基酸12-27或seqidno:3，或孢子外壁蛋白可包含全长beta/bas3290(seqidno:4)。还发现连接有甲硫氨酸残基的beta/bas3290的氨基酸12-27可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含seqidno:61。靶向序列还可包含seqidno:3的氨基酸14-23、seqidno:3的氨基酸14-25或seqidno:3的氨基酸12-23。
靶向序列还可包含seqidno:5的氨基酸1-38、seqidno:5的氨基酸23-38或seqidno:5，或孢子外壁蛋白可包含全长bas4623(seqidno:6)。
或者，靶向序列可包含seqidno:7的氨基酸1-28、seqidno:7的氨基酸13-28或seqidno:7，或孢子外壁蛋白可包含全长bclb(seqidno:8)。
靶向序列还可包含seqidno:9的氨基酸1-24、seqidno:9的氨基酸9-24或seqidno:9，或孢子外壁蛋白可包含全长bas1882(seqidno:10)。连接有甲硫氨酸残基的bas1882的氨基酸9-24也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含seqidno:69.
靶向序列还可包含seqidno:11的氨基酸1-33、seqidno:11的氨基酸18-33或seqidno:11，或孢子外壁蛋白可包含全长韦氏芽孢杆菌kbab42280基因产物(seqidno:12)。连接有甲硫氨酸残基的韦氏芽孢杆菌kbab42280基因产物的氨基酸18-33也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含seqidno:62。
靶向序列还可包含seqidno:13的氨基酸1-33、seqidno:13的氨基酸18-33或seqidno:13，或孢子外壁蛋白可包含全长韦氏芽孢杆菌kbab43572基因产物(seqidno:14)。连接有甲硫氨酸残基的韦氏芽孢杆菌kbab43572基因产物的氨基酸18-33也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含seqidno:63。
或者，靶向序列可包含seqidno:15的氨基酸1-43、seqidno:15的氨基酸28-43或seqidno:15，或孢子外壁蛋白可包含全长蜡样芽孢杆菌vd200孢子外壁前导肽(seqidno:16)。
靶向序列还可包含seqidno:17的氨基酸1-27、seqidno:17的氨基酸12-27或seqidno:17，或孢子外壁蛋白可包含全长蜡样芽孢杆菌vd166孢子外壁前导肽(seqidno:18)。连接有甲硫氨酸残基的蜡样芽孢杆菌vd166孢子外壁前导肽的氨基酸12-27也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含seqidno:64。
靶向序列还可包含seqidno:19的氨基酸1-33、seqidno:19的氨基酸18-33或seqidno:19，或孢子外壁蛋白可包含全长蜡样芽孢杆菌vd200假设蛋白ikg_04663(seqidno:20)。
或者，靶向序列包含seqidno:21的氨基酸1-33、seqidno:21的氨基酸18-33或seqidno:21，或孢子外壁蛋白可包含全长韦氏芽孢杆菌kbab4yvtnβ-螺旋桨蛋白(seqidno:22)。连接有甲硫氨酸残基的韦氏芽孢杆菌kbab4yvtnβ-螺旋桨蛋白的氨基酸18-33也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含seqidno:65。
靶向序列还可包含seqidno:23的氨基酸1-24、seqidno:23的氨基酸9-24或seqidno:23，或孢子外壁蛋白可包含全长韦氏芽孢杆菌kbab4假设蛋白bcerkbab4_2363(seqidno:24)。连接有甲硫氨酸残基的韦氏芽孢杆菌kbab4假设蛋白bcerkbab4_2363的氨基酸9-24也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含seqidno:66。
靶向序列包含seqidno:25的氨基酸1-24、seqidno:25的氨基酸9-24或seqidno:25，或孢子外壁蛋白可包含全长韦氏芽孢杆菌kbab4假设蛋白bcerkbab4_2131(seqidno:26)。连接有甲硫氨酸残基的韦氏芽孢杆菌kbab4假设蛋白bcerkbab4_2131的氨基酸9-24也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含seqidno:67。
或者，靶向序列包含seqidno:27的氨基酸1-30、seqidno:27的氨基酸15-30或seqidno:27，或孢子外壁蛋白可包含全长韦氏芽孢杆菌kbab4含有三螺旋重复的胶原(seqidno:28)。
靶向序列还可包含seqidno:29的氨基酸1-33、seqidno:29的氨基酸18-33或seqidno:29，或孢子外壁蛋白可包含全长蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyco0001_21660(seqidno:30)。
靶向序列还可包含seqidno:31的氨基酸1-24、seqidno:31的氨基酸9-24或seqidno:31，或孢子外壁蛋白可包含全长蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_22540(seqidno:32)。连接有甲硫氨酸残基的蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_22540的氨基酸9-24也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含seqidno:68。
或者，靶向序列包含seqidno:33的氨基酸1-15、seqidno:33，或孢子外壁蛋白包含全长蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_21510(seqidno:34)。
靶向序列还可包含seqidno:35的氨基酸1-16、seqidno:35，或孢子外壁蛋白可包含全长苏云金芽孢杆菌35646胶原三螺旋重复蛋白(seqidno:36)。
靶向序列可包含seqidno:43的氨基酸1-29、seqidno:43的氨基酸14-29或seqidno:43，或孢子外壁蛋白可包含全长蜡样芽孢杆菌假设蛋白wp_69652(seqidno:44)。
或者，靶向序列可包含seqidno:45的氨基酸1-35、seqidno:45的氨基酸20-35或seqidno:45，或孢子外壁蛋白可包含全长蜡样芽孢杆菌孢子外壁前导wp016117717(seqidno:46)。连接有甲硫氨酸残基的蜡样芽孢杆菌孢子外壁前导wp016117717的氨基酸20-35也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含seqidno:70。
靶向序列可包含seqidno:47的氨基酸1-43、seqidno:47的氨基酸28-43或seqidno:47，或孢子外壁蛋白可包含全长蜡样芽孢杆菌孢子外壁肽wp002105192(seqidno:48)。
靶向序列可包含seqidno:49的氨基酸1-32、seqidno:49的氨基酸17-32或seqidno:49，或孢子外壁蛋白可包含全长蜡样芽孢杆菌假设蛋白wp87353(seqidno:50)。
或者，靶向序列可包含seqidno:51的氨基酸1-33、seqidno:51的氨基酸18-33或seqidno:51，或孢子外壁蛋白可包含全长蜡样芽孢杆菌孢子外壁肽02112369(seqidno:52)。
靶向序列可包含seqidno:53的氨基酸1-33、seqidno:53的氨基酸18-33或seqidno:53，或孢子外壁蛋白可包含全长蜡样芽孢杆菌孢子外壁蛋白wp016099770(seqidno:54)。
或者，靶向序列可包含seqidno:55的氨基酸1-30、seqidno:55的氨基酸15-30或seqidno:55，或孢子外壁蛋白可包含全长苏云金芽孢杆菌假设蛋白yp006612525(seqidno:56)。
靶向序列还可包含seqidno:57的氨基酸1-130、seqidno:57的氨基酸115-130或seqidno:57，或孢子外壁蛋白可包含全长蕈状芽孢杆菌假设蛋白tigr03720(seqidno:58)。
另外，从图1中的序列比对可以容易地看出，虽然bcla的氨基酸20-35是保守的，并且氨基酸25-35是更保守的，但在此区域中仍可发生一定程度的变异，而不影响靶向序列将蛋白靶向至孢子外壁的能力。图1列出每个序列的对应氨基酸各自与bcla的氨基酸20-35的同一性百分比(“20-35％同一性”)以及与bcla的氨基酸25-35的同一性百分比(“25-35％同一性)。因此，例如，与bcla的氨基酸20-35相比，beta/bas3290的对应氨基酸具有约81.3％同一性，bas4623的对应氨基酸具有约50.0％同一性，bclb的对应氨基酸具有约43.8％同一性，bas1882的对应氨基酸具有约62.5％同一性，kbab42280基因产物的对应氨基酸具有约81.3％同一性，kbab43572基因产物的对应氨基酸具有约81.3％同一性。其余序列在此区域上的序列同一性列于图1中。
相对于bcla的氨基酸25-35，beta/bas3290的对应氨基酸具有约90.9％同一性，bas4623的对应氨基酸具有约72.7％同一性，bclb的对应氨基酸具有约54.5％同一性，bas1882的对应氨基酸具有约72.7％同一性，kbab42280基因产物的对应氨基酸具有约90.9％同一性，kbab43572基因产物的对应氨基酸具有约81.8％同一性。其余序列在此区域上的序列同一性列于图1中。
因此，靶向序列可包含与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％。或者，靶向序列由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列由16个氨基酸组成并且与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约43％的同一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约54％。
靶向序列还可包含与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约50％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％。或者，靶向序列由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列由16个氨基酸组成并且与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约50％的同一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％。
靶向序列还可包含与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约50％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％。或者，靶向序列由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列由16个氨基酸组成并且与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约50％的同一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％。
靶向序列还可包含与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约56％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％。或者，靶向序列由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列由16个氨基酸组成并且与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约56％的同一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％。
或者，靶向序列可包含与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约62％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％。靶向序列还可由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列由16个氨基酸组成并且与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约62％的同一性，其中与seqidno:1的氨基酸25-35的同一性为至少约72％。
靶向序列可包含与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少68％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。或者，靶向序列由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列由16个氨基酸组成且与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少68％的同一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。
靶向序列还可包含与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约75％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％。或者，靶向序列由以下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由16个氨基酸组成且与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约75％的同一性，其中与seqidno:1的氨基酸25-35的同一性为至少约72％。
靶向序列还可包含与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约75％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。或者，靶向序列由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列由16个氨基酸组成并且与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约75％的同一性，其中与seqidno:1的氨基酸25-35的同一性为至少约81％。
靶向序列还可包含与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约81％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。或者，靶向序列由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列由16个氨基酸组成并且与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约81％的同一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。
靶向序列可包含与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约81％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约90％。或者，靶向序列由以下氨基酸序列组成：所述氨基酸序列由16个氨基酸组成且与seqidno:1的氨基酸20-35具有至少约81％的同一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约90％。
技术人员会认识到以上序列的变体也可用作靶向序列，只要靶向序列包含bcla的氨基酸20-35，beta/bas3290、bas4263、bclb、bas1882、kbab42280基因产物或kbab3572基因产物的对应氨基酸，或存在包含任何以上所列的与bcla的氨基酸20-35和25-35的序列同一性的序列。
进一步发现，缺乏与bcla的氨基酸25-35具有同源性的区域的某些蜡样芽胞杆菌家族孢子外壁蛋白也可用于将肽或蛋白靶向至蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子外壁。具体地，融合蛋白可包含含有seqidno:71的孢子外壁蛋白(蕈状芽孢杆菌inha)、含有seqidno:72的孢子外壁蛋白(炭疽芽孢杆菌sternebas1141(exsy))、含有seqidno:73的孢子外壁蛋白(炭疽芽孢杆菌sternebas1144(bxpb/exsfa))、含有seqidno:74的孢子外壁蛋白(炭疽芽孢杆菌sternebas1145(coty))、含有seqidno:75的孢子外壁蛋白(炭疽芽孢杆菌sternebas1140)、含有seqidno:76的孢子外壁蛋白(炭疽芽孢杆菌h9401exsfb)、含有seqidno:77的孢子外壁蛋白(苏云金芽孢杆菌hd74inha1)、含有seqidno:78的孢子外壁蛋白(蜡样芽孢杆菌atcc10876exsj)、含有seqidno:79的孢子外壁蛋白(蜡样芽孢杆菌exsh)、含有seqidno:80的孢子外壁蛋白(炭疽芽孢杆菌amesyjca)、含有seqidno:81的孢子外壁蛋白(炭疽芽孢杆菌yjcb)、含有seqidno:82的孢子外壁蛋白(炭疽芽孢杆菌sternebclc)、含有seqidno:83的孢子外壁蛋白(苏云金芽孢杆菌血清变型konkukian菌株97-27酸性磷酸酶)或含有seqidno:84的孢子外壁蛋白(苏云金芽孢杆菌hd74inha2)。在本文所述的融合蛋白中纳入包含seqidno:71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83或84的孢子外壁蛋白将导致靶向至蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁。
此外，与上述的任何全长孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段具有高度序列同一性的孢子外壁蛋白也可用于将肽或蛋白靶向至蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁上。因此，融合蛋白可包含含有与seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、59、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83和84中的任一个具有至少85％同一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白。或者，融合蛋白可包含与seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、59、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83和84中的任一个具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的孢子外壁蛋白。
或者，融合蛋白可包含由与seqidno:59具有至少85％同一性的氨基酸序列组成的孢子外壁蛋白片段。或者，融合蛋白可包含由与seqidno:59具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列组成的孢子外壁蛋白片段。
在本文所述的任意的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段中，所述靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段可在其羧基末端包含氨基酸序列gxt，其中x为任何氨基酸。
在本文所述的任意的靶向序列、孢子外壁蛋白以及孢子外壁蛋白片段中，所述靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段可在靶向序列的对应于seqidno:1的氨基酸20的位置处包含丙氨酸残基。
融合蛋白
融合蛋白可包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段以及至少一种植物生长刺激蛋白或肽。所述植物生长刺激蛋白或肽可包含肽激素、非激素肽、产生或活化植物生长刺激化合物中所涉及的酶或降解或修饰细菌、真菌或植物养分来源的酶。所述靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段可以为上述任意的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段。
融合蛋白可包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段以及至少一种保护植物免受病原体侵袭的蛋白或肽。所述靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段可以为上述任意的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段。
融合蛋白可使用本领域中已知的标准克隆和分子生物学方法制得。例如，编码蛋白或肽的基因(例如，编码植物生长刺激蛋白或肽的基因)可通过聚合酶链式反应(pcr)来扩增并且连接到编码上述任何靶向序列的dna，以形成编码融合蛋白的dna分子。编码融合蛋白的dna分子可被克隆到任何适合的载体(例如质粒载体)中。载体适当地包含多个克隆位点，编码融合蛋白的dna分子可容易地插入所述克隆位点中。载体还适当地含有可选择的标记，如抗生素抗性基因，以使可以容易地鉴定和分离用载体转化、转染或配对的细菌。当载体是质粒时，所述质粒还适当地包含复制起点。编码融合蛋白的dna适当地在孢子形成启动子(例如，来自蜡样芽孢杆菌家族成员的天然bcla启动子)的控制下，所述孢子形成启动子将引起融合蛋白在蜡样芽孢杆菌家族成员内生孢子的孢子外壁上的表达。或者，编码融合蛋白的dna可整合到蜡样芽孢杆菌家族成员宿主的染色体dna中。
融合蛋白还可包含其他多肽序列，所述多肽序列不是所述靶向序列、孢子外壁蛋白、孢子外壁蛋白片段，或植物生长刺激蛋白或肽、保护植物免受病原体侵袭的蛋白或肽、提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽或植物结合蛋白或肽的一部分。例如，融合蛋白可包括标签或标记以促进融合蛋白的纯化或可视化(例如，多组氨酸标签或荧光蛋白如gfp或yfp)或表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞孢子的可视化。
使用本文所述的靶向序列、孢子外壁蛋白以及孢子外壁蛋白片段增强了融合蛋白在孢子外壁上的表达，这是由于在这些序列的氨基-末端中缺乏二级结构，这允许融合蛋白的天然折叠和活性的保留。适当的折叠可通过在靶向序列、孢子外壁蛋白、孢子外壁蛋白片段和融合伴侣(partner)蛋白之间纳入短的氨基酸接头来进一步增强。
因此，本文所述的任何融合蛋白可在靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段与植物生长刺激蛋白或肽、保护植物免受病原体侵袭的蛋白或肽、提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽或植物结合蛋白或肽之间包含氨基酸接头。
所述接头可包含聚丙氨酸接头或聚甘氨酸接头。还可使用包含丙氨酸残基与甘氨酸残基的混合物的接头。例如，当靶向序列包含seqidno:1时，融合蛋白可具有以下结构中的一种：
无接头：seqidno:1-融合伴侣蛋白
丙氨酸接头：seqidno:1-an-融合伴侣蛋白
甘氨酸接头：seqidno:1-gn-融合伴侣蛋白
混合丙氨酸和甘氨酸接头：seqidno:1-(a/g)n-融合伴侣蛋白
其中an、gn和(a/g)n分别是任意数量的丙氨酸、任意数量的甘氨酸、或任意数量的丙氨酸与甘氨酸的混合物。例如，n可为1至25，且优选为6至10。当接头包含丙氨酸残基与甘氨酸残基的混合物时，可使用甘氨酸残基与丙氨酸残基的任何组合。在以上结构中，“融合伴侣蛋白”代表植物生长刺激蛋白或肽、保护植物免受病原体侵袭的蛋白或肽、提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽或植物结合蛋白或肽。
可选地或另外地，所述接头可包含蛋白酶识别位点。纳入蛋白酶识别位点使得能够在暴露于识别所述蛋白酶识别位点的蛋白酶时靶向移除植物生长刺激蛋白或肽、保护植物免受病原体侵袭的蛋白或肽、提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽或植物结合蛋白或肽。
植物生长刺激蛋白和肽
如上所述，融合蛋白可包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段以及至少一种植物生长刺激蛋白或肽。例如，所述植物生长刺激蛋白或肽可包括肽激素、非激素肽、产生或活化植物生长刺激化合物中所涉及的酶或降解或修饰细菌、真菌或植物养分来源的酶。
例如，当植物生长刺激蛋白或肽包括肽激素时，所述肽激素可包括植物磺肽素(phytosulfokine)(例如植物磺肽素-α)、clavata3(clv3)、系统素、zmlgf或scr/sp11。
当植物生长刺激蛋白或肽包括非激素肽时，所述非激素肽可包括rkn16d10、hg-syv46、enod40肽、蜂毒肽、肥大脱粒肽、mas7、rhpp、polaris或kunitz胰蛋白酶抑制剂(kti)。
植物生长刺激蛋白或肽可包括产生或活化植物生长刺激化合物中所涉及的酶。产生或活化植物生长刺激化合物中所涉及的酶可以是在刺激植物生长或改变植物结构的化合物的生物合成途径中催化任何步骤的任何酶，或将刺激植物生长或改变植物结构的化合物的无活性或活性较小的衍生物催化转化为化合物的活性或更大活性形式的任何酶。
植物生长刺激化合物可包括由根际中的细菌或真菌产生的化合物，例如2,3-丁二醇。
或者，植物生长刺激化合物可包括植物生长激素，例如细胞分裂素或细胞分裂素衍生物、乙烯、生长素或生长素衍生物、赤霉酸或赤霉酸衍生物、脱落酸或脱落酸衍生物、或茉莉酸或茉莉酸衍生物。
当植物生长刺激化合物包括细胞分裂素或细胞分裂素衍生物时，所述细胞分裂素或细胞分裂素衍生物可包括激动素、顺-玉米素、反-玉米素、6-苄氨基嘌呤、二羟基玉米素、n6-(d2-异戊烯基)腺嘌呤、玉米素核苷、n6-(d2-异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-顺-玉米素核苷、顺-玉米素核苷、反-玉米素核苷、2-甲硫基-反-玉米素核苷、玉米素核苷-5-单磷酸、n6-甲氨基嘌呤、n6-二甲氨基嘌呤、2'-脱氧玉米素核糖核苷、4-羟基-3-甲基-反-2-丁烯基氨基嘌呤、邻拓扑林(ortho-topolin)、间拓扑林、苄基腺嘌呤、邻甲基拓扑林、间甲基拓扑林或其组合。
当植物生长刺激化合物包括生长素或生长素衍生物时，所述生长素或生长素衍生物可包括活性生长素、无活性生长素、缀合生长素、天然存在的生长素或合成生长素或其组合。例如，所述生长素或生长素衍生物可包括吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-乙醛肟、吲哚-3-乙酰胺、吲哚-3-乙腈、吲哚-3-乙醇、吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-乙醛肟、吲哚-3-丁酸、苯乙酸、4-氯吲哚-3-乙酸、葡萄糖缀合的生长素或其组合。
产生或活化植物生长刺激化合物中所涉及的酶可包括3-羟基丁酮还原酶、吲哚-3-乙酰胺水解酶、色氨酸单加氧酶、乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶、丙酮酸脱羧酶、双乙酰还原酶、丁二醇脱氢酶、氨基转移酶(例如色氨酸氨基转移酶)、色氨酸脱羧酶、胺氧化酶、吲哚-3-丙酮酸脱羧酶、吲哚-3-乙醛脱氢酶、色氨酸侧链氧化酶、腈水解酶(nitrilehydrolase)、腈水解酶(nitrilase)、肽酶、蛋白酶、磷酸腺苷异戊烯转移酶、磷酸酶、腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶、cyp735a、5'核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、玉米素顺-反异构酶、玉米素o-葡萄糖基转移酶、β-葡糖苷酶、顺-羟化酶、ck顺-羟化酶、ckn-葡萄糖基转移酶、2,5-核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、嘌呤核苷磷酸化酶、玉米素还原酶、羟胺还原酶、2-酮戊二酸双加氧酶、赤霉素2b/3b水解酶、赤霉素3-氧化酶、赤霉素20-氧化酶、脱乙酰壳多糖酶、壳多糖酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶或参与产生结瘤因子的酶(例如，noda、nodb或nodi)。
当所述酶包括蛋白酶或肽酶时，所述蛋白酶或肽酶可以是裂解蛋白、肽、原蛋白或前原蛋白以产生生物活性肽的蛋白酶或肽酶。所述生物活性肽可以是发挥生物活性的任何肽。
生物活性肽的实例包括rkn16d10和rhpp。
裂解蛋白、肽、原蛋白或前原蛋白以产生生物活性肽的蛋白酶或肽酶可包括枯草杆菌蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、蛋白酶、内肽酶、外肽酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、链霉蛋白酶、羧化酶、丝氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。
蛋白酶或肽酶可裂解富含蛋白质的粗粉(例如，大豆粉或酵母提取物)中的蛋白质。
植物生长刺激蛋白还可包括降解或修饰细菌、真菌或植物养分来源的酶。这类酶包括纤维素酶、脂肪酶、木质素氧化酶、蛋白酶、糖苷水解酶、磷酸酶、固氮酶、核酸酶、酰胺酶、硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、淀粉酶、氨氧化酶、木质酶、葡糖苷酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、果胶酶、葡聚糖酶、硫酸酯酶、尿素酶、木聚糖酶或铁载体。当被引入植物生长介质中或施用于植物、种子或植物或植物种子周围的区域时，包含降解或修饰细菌、真菌或植物养分来源的酶的融合蛋白可有助于加工植物附近的养分并增强植物或植物附近的有益的细菌或真菌对养分的摄取。
适合的纤维素酶包括内切纤维素酶(例如，内切葡聚糖酶如枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)内切葡聚糖酶、苏云金芽孢杆菌内切葡聚糖酶、蜡样芽孢杆菌内切葡聚糖酶或克劳氏芽孢杆菌(bacillusclausii)内切葡聚糖酶)、外切纤维素酶(例如，里氏木霉(trichodermareesei)外切纤维素酶)以及β-葡糖苷酶(例如，枯草芽孢杆菌β-葡糖苷酶、苏云金芽孢杆菌β-葡糖苷酶、蜡样芽孢杆菌β-葡糖苷酶或克劳氏芽孢杆菌β-葡糖苷酶)。
脂肪酶可包括枯草芽孢杆菌脂肪酶、苏云金芽孢杆菌脂肪酶、蜡样芽孢杆菌脂肪酶或克劳氏芽孢杆菌脂肪酶。
在一个实施方案中，脂肪酶包括枯草芽孢杆菌脂肪酶。所述枯草芽孢杆菌脂肪酶可使用以下引物进行pcr扩增：ggatccatggctgaacacaatcc(正向，seqidno:37)和ggatccttaattcgtattctggcc(反向，seqidno:38)。
在另一个实施方案中，纤维素酶为枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶。所述枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶可使用以下引物进行pcr扩增：ggatccatgaaacggtcaatc(正向，seqidno:39)和ggatccttactaatttggttctgt(反向，seqidno:40)。
在另一个实施方案中，融合蛋白包含大肠杆菌(e.coli)蛋白酶ptrb。所述大肠杆菌蛋白酶ptrb可使用以下引物进行pcr扩增：ggatccatgctaccaaaagcc(正向，seqidno:41)和ggatccttagtccgcaggcgtagc(反向，seqidno:42)。
在某些实施方案中，融合蛋白含有源自seqidno:104中的核苷酸序列的内切葡聚糖酶。
可以融合至靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段以及任选的接头序列(如多聚-a接头)的示例性内切葡聚糖酶的氨基酸序列为以seqidno:107提供的融合蛋白。
在其他实施方案中，融合蛋白含有源自seqidno:105中所示的核苷酸序列的磷脂酶。
可以融合至靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段以及任选的接头序列(如多聚-a接头)的示例性磷脂酶的氨基酸序列为以seqidno:108提供的融合蛋白。
在其他实施方案中，所述融合蛋白含有源自seqidno:106中所示的核苷酸序列的脱乙酰壳多糖酶。可以融合至融合蛋白中的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段以及任选的接头序列(如多聚-a接头)的示例性脱乙酰壳多糖酶的氨基酸序列以seqidno:109提供。
为了产生融合构建体，可以通过重叠延伸(soe)技术使用剪接将基因融合至编码bcla的头35个氨基酸(seqidno:1的氨基酸1-35)的苏云金芽孢杆菌dna的天然bcla启动子。将正确扩增子克隆到大肠杆菌/芽孢杆菌属穿梭载体php13中，并且通过dna测序对正确的克隆进行筛选。将正确的克隆电穿孔至苏云金芽孢杆菌(cry-、质粒-)中并且针对氯霉素抗性进行筛选。将正确的转化体在30℃下于脑心浸液肉汤中生长过夜，置于营养琼脂板上，并且在30℃下孵育3天。通过在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中洗涤将表达融合构建体的孢子(bemd孢子)从所述板上收集下来，并通过离心和在pbs中额外的洗涤而纯化。
在这类融合蛋白中，内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶可以包含编码分别与seqidno:107、108或109具有至少85％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。
在这类融合蛋白中，内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶可以包含分别与seqidno:107、108或109具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在这类融合蛋白中，内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶可以包含分别与seqidno:107、108或109具有至少95％同一性的氨基酸序列。
在这类融合蛋白中，内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶可以包含分别与seqidno:107、108或109具有至少98％同一性的氨基酸序列。
在这类融合蛋白中，内切葡聚糖酶、磷脂酶或脱乙酰壳多糖酶可以包含分别与seqidno:107、108或109具有至少99％同一性的氨基酸序列。
适合的木质素氧化酶包括木质素过氧化物酶、漆酶、乙二醛氧化酶、木质酶以及锰过氧化物酶。
蛋白酶可包括枯草杆菌蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、蛋白酶、肽酶、内肽酶、外肽酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、链霉蛋白酶、羧化酶、丝氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。
磷酸酶可包括磷酸单酯水解酶、磷酸单酯酶(例如phoa4)、磷酸二酯水解酶、磷酸二酯酶、三磷酸单酯水解酶、磷酰酸酐水解酶、焦磷酸酶、肌醇六磷酸酶(例如，枯草芽孢杆菌ee148肌醇六磷酸酶或苏云金芽孢杆菌bt013a肌醇六磷酸酶)、三偏磷酸酶或三磷酸酶。
固氮酶可包括nif家族固氮酶(例如，马赛类芽孢杆菌(paenibacillusmassiliensis)nifbdehknxv)。
保护植物免受病原体侵袭的蛋白和肽
融合蛋白可包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，以及至少一种保护植物免受病原体侵袭的蛋白或肽。
所述蛋白或肽可包括刺激植物免疫应答的蛋白或肽。例如，刺激植物免疫应答的蛋白或肽可包括植物免疫系统增强蛋白或肽。所述植物免疫系统增强蛋白或肽可为对植物的免疫系统具有有益作用的任何蛋白或肽。适合的植物免疫系统增强蛋白和肽包括过敏蛋白(harpin)、α-弹性蛋白、β-弹性蛋白、系统素、苯丙氨酸解氨酶、激发素、防御素、隐地蛋白、鞭毛蛋白以及鞭毛蛋白肽(例如flg22)。
或者，保护植物免受病原体侵袭的蛋白或肽可为具有抗细菌活性、抗真菌活性、或抗细菌和抗真菌活性的蛋白或肽。此类蛋白和肽的实例包括细菌素、溶菌酶、溶菌酶肽(例如lysm)、铁载体、非核糖体活性肽、伴清蛋白、白蛋白、乳铁蛋白、乳铁蛋白肽(例如lfcinb)、抗生蛋白链菌素以及tasa。
保护植物免受病原体侵袭的蛋白或肽还可为具有杀虫活性、杀蠕虫活性，抑制昆虫或蠕虫捕食，或其组合的蛋白或肽。例如，保护植物免受病原体侵袭的蛋白或肽可包括杀虫细菌毒素(例如，vip杀虫蛋白)、内毒素、cry毒素(例如，来自苏云金芽孢杆菌的cry毒素)、蛋白酶抑制剂蛋白或肽(例如，胰蛋白酶抑制剂或慈菇蛋白酶抑制剂)、半胱氨酸蛋白酶或壳多糖酶。当cry毒素是来自苏云金芽孢杆菌的cry毒素时，cry毒素可以是cry5b蛋白或cry21a蛋白。cry5b和cry21a兼具杀虫和杀线虫活性。
保护植物免受病原体侵袭的蛋白可包括酶。适合的酶包括蛋白酶和内酯酶。所述蛋白酶和内酯酶可特异性针对细菌信号传导分子(例如，细菌内酯高丝氨酸信号传导分子)。
当酶是内酯酶时，所述内酯酶可包括1,4-内酯酶、2-吡喃酮-4,6-二羧酸内酯酶、3-氧代己二酸烯醇-内酯酶、放线菌素内酯酶、脱氧柠檬酸酯(deoxylimonate)a-环-内酯酶、葡糖酸内酯酶l-鼠李糖-1,4-内酯酶、柠檬苦素-d-环-内酯酶、类固醇-内酯酶、三乙酸-内酯酶或木糖酸-1,4-内酯酶。
所述酶还可以是特异性针对细菌或真菌的细胞组分的酶。例如，所述酶可包括β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、脱乙酰壳多糖酶、壳多糖酶、脱乙酰壳多糖酶样酶、溶细胞酶、肽酶、蛋白酶(proteinase)、蛋白酶(protease)(例如，碱性蛋白酶、酸性蛋白酶或中性蛋白酶)、变溶菌素、葡萄球菌溶血素(stapholysin)或溶菌酶。
提高植物胁迫抗性的蛋白和肽
融合蛋白可包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段以及至少一种提高植物胁迫抗性的蛋白或肽。
例如，提高植物胁迫抗性的蛋白或肽包括降解胁迫相关化合物的酶。胁迫相关化合物包括但不限于氨基环丙烷-1-羧酸(acc)、活性氧种类、一氧化氮、氧脂素以及酚类物质(phenolics)。具体的活性氧种类包括羟基、过氧化氢、氧以及超氧化物。降解胁迫相关化合物的酶可包括超氧化物歧化酶、氧化酶、过氧化氢酶、氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶、过氧化物酶、抗氧化酶或抗氧化肽。
提高植物胁迫抗性的蛋白或肽还可包括保护植物免受环境胁迫的蛋白或肽。所述环境胁迫可包括，例如，干旱、洪水、热、冰冻、盐、重金属、低ph、高ph或其组合。例如，保护植物免受环境胁迫的蛋白或肽可包括冰核蛋白、脯氨酰肽酶、苯丙氨酸解氨酶、异分支酸合酶、异分支酸丙酮酸裂解酶或胆碱脱氢酶。
植物结合蛋白和肽
融合蛋白可包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段以及至少一种植物结合蛋白或肽。植物结合蛋白或肽可为能够特异性地或非特异性地结合至植物的任何部位(例如，植物根部或植物的地上部分如叶、茎、花或果实)或植物物质的任何蛋白或肽。因此，例如，植物结合蛋白或肽可以是根结合蛋白或肽或叶结合蛋白或肽。
适合的植物结合蛋白和肽包括粘附素(例如根钙粘素(rhicadhesin))、鞭毛蛋白、omptin、外源凝集素、棒曲霉素、生物膜结构蛋白(例如tasa或yuab)、菌毛蛋白、卷曲蛋白(curlusprotein)、intimin、侵袭素、凝集素以及非菌毛(afimbrial)蛋白。
表达融合蛋白的重组芽孢杆菌属
本文所述的融合蛋白可由重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞表达。所述融合蛋白可以是上述的任何融合蛋白。
重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞可共表达上述的任何融合蛋白中的两种或更多种。例如，重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞可共表达至少一种包含植物结合蛋白或肽的融合蛋白，与至少一种包含植物生长刺激蛋白或肽的融合蛋白、至少一种包含保护植物免受病原体侵袭的蛋白或肽的融合蛋白，或至少一种提高植物胁迫抗性的蛋白或肽。
重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞可包括炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌、bacillussamanii、bacillusgaemokensis、韦氏芽孢杆菌、bacillustoyoiensis或其组合。例如，重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞可包括蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌。具体地，重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞可包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌。
为了产生表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞，可使用本领域中已知的标准方法(例如通过电穿孔)将任何蜡样芽孢杆菌家族成员与编码融合蛋白的载体缀合、用所述载体转导或转化。然后，可通过本领域中已知的任何方法筛选细菌以鉴定转化体。例如，当载体包含抗生素抗性基因时，可就抗生素抗性对细菌进行筛选。或者，可将编码融合蛋白的dna整合到蜡样芽孢杆菌家族成员宿主的染色体dna中。然后，可将重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞暴露于将诱发孢子形成的条件中。用于诱导孢子形成的适合的条件是本领域已知的。例如，可将重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞铺于琼脂板上，并且在约30℃的温度下孵育若干天(例如，3天)。
还可适当地使用以上任何种类的失活菌株、无毒菌株或遗传操作的菌株。例如，可使用缺乏cry毒素的苏云金芽孢杆菌。可选地或另外地，一旦表达融合蛋白的重组蜡样芽孢杆菌家族孢子已经产生，便可使它们失活以防止一旦使用时的进一步萌芽。可使用本领域中已知的使细菌孢子失活的任何方法。合适的方法包括但不限于，热处理、γ辐射、x-射线辐射、uv-a辐射、uv-b辐射、化学处理(例如，用戊二醛、甲醛、过氧化氢、乙酸、漂白剂或其任何组合处理)或其组合。或者，可使用源自非产毒菌株或遗传上或物理上失活菌株的孢子。
具有植物生长促进作用和/或其他有益属性的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞
许多蜡样芽孢杆菌家族成员菌株具有固有的有益属性。例如，一些菌株具有植物生长促进作用。本文所述的任何融合蛋白都可在这类菌株中表达。
例如，重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞可包括细菌的植物生长促进菌株。
细菌的植物生长促进菌株可包括产生杀虫毒素(例如，cry毒素)、产生杀真菌化合物(例如，β-1,3-葡聚糖酶、脱乙酰壳多糖酶、溶细胞酶或其组合)、产生杀线虫化合物(例如，cry毒素)、产生杀细菌化合物、对一种或多种抗生素有抗性、包含一个或多个自主复制质粒、结合至植物根部、定殖于植物根部、形成生物膜、溶解养分、分泌有机酸或其任何组合的细菌的菌株。
例如，当重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞包括细菌的植物生长促进菌株时，细菌的植物生长促进菌株可包括蕈状芽孢杆菌bt155(nrrlno.b-50921)、蕈状芽孢杆菌ee118(nrrlno.b-50918)、蕈状芽孢杆菌ee141(nrrlno.b-50916)、蕈状芽孢杆菌bt46-3(nrrlno.b-50922)、蜡样芽孢杆菌家族成员ee128(nrrlno.b-50917)、苏云金芽孢杆菌bt013a(nrrlno.b-50924)或蜡样芽孢杆菌家族成员ee349(nrrlno.b-50928)。苏云金芽孢杆菌bt013a还称为苏云金芽孢杆菌4q7。这些菌株各自于2014年3月10日保藏于美国农业部(usda)农业研究服务局(ars)(其地址为美国伊利诺伊州，皮奥里亚市，北部大学街1815号，邮编61604)，并且由括号中提供的nrrl保藏号来鉴定。
这些植物生长促进菌株分离自各种茁壮的植物的根际并且通过生物化学测定由其16srrna序列来鉴定。通过常规的生物化学和形态指标，将菌株至少鉴定为它们的属名。用于经确认的革兰氏阳性菌株如芽孢杆菌属的生物化学测定包括在pea培养基和营养琼脂上的生长，显微镜检查，在5％和7.5％nacl培养基上的生长，在ph5和ph9下的生长，在42℃和50℃下的生长，用纤维二糖、乳糖、甘油、葡萄糖、蔗糖、d-甘露醇以及淀粉发酵时产生酸的能力；荧光颜料产生；明胶水解；硝酸盐还原；过氧化氢酶产生、淀粉水解；氧化酶反应、尿素酶产生以及活力。
例如，包含细菌的植物生长促进菌株的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞可包括蕈状芽孢杆菌bt155、蕈状芽孢杆菌ee141或苏云金芽孢杆菌bt013a。重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞可表达本文所述的任何融合蛋白，例如，包含seqidno:60的靶向序列和非激素肽(例如，kunitz胰蛋白酶抑制剂(kti))，产生或活化植物生长刺激化合物中所涉及的酶(例如，脱乙酰壳多糖酶)，植物结合蛋白或肽(例如，tasa)；保护植物免受病原体侵袭的蛋白或肽(例如，tasa)，或降解或修饰细菌、真菌或植物养分来源的酶(例如，磷酸酶如phoa或肌醇六磷酸酶，或内切葡聚糖酶)的融合蛋白。
启动子
在本文所述的任何重组蜡样芽孢杆菌家族成员中，融合蛋白可在融合蛋白的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段的天然启动子的控制下表达。例如，当融合蛋白包含源自炭疽芽孢杆菌sternebcla的靶向序列(例如，seqidno:1的氨基酸20-35、seqidno:1的氨基酸1-35、seqidno:1或seqidno:60)时或当融合蛋白包含全长bcla(seqidno:2)或全长bcla的片段(例如，seqidno:59)时，融合蛋白可在通常与炭疽芽孢杆菌sterne的基因组中的bcla基因相关的启动子(例如，seqidno:85的启动子)的控制下表达。
或者，融合蛋白可在高表达孢子形成启动子的控制下表达。在一些情况下，靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段的天然启动子会是高表达孢子形成启动子。在其他情况下，靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段的天然启动子不会是高表达孢子形成启动子。在后一种情况下，用高表达孢子形成启动子替代天然启动子可能是有利的。融合蛋白在高表达孢子形成启动子的控制下的表达使融合蛋白在蜡样芽孢杆菌家族成员的孢子外壁上的表达增加。
高表达孢子形成启动子可包含一个或多个σ-k孢子形成特异性聚合酶启动子序列。
用于在蜡样芽孢杆菌家族成员中表达融合蛋白的适合的高表达孢子形成启动子包括下表2中所列出的那些：
表2：启动子序列
在上表2中所列出的启动子序列中，σ-k孢子形成特异性聚合酶启动子序列的位置由粗体和加下划线的文本示出。cry1a启动子(苏云金芽孢杆菌hd-73；seqidno:90)具有总共四个σ-k序列，其中两个相互重叠，如表2中的双下划线所示。
用于在蜡样芽孢杆菌家族成员中表达融合蛋白的优选高表达孢子形成启动子包括beta启动子(炭疽芽孢杆菌sterne；seqidno:86)、bcla启动子(炭疽芽孢杆菌sterne；seqidno:85)、bcla簇糖基转移酶操纵子1和2启动子(炭疽芽孢杆菌sterne；seqidno:101和102)以及yvtnβ-螺旋桨蛋白启动子(韦氏芽孢杆菌kbab4；seqidno:89)。
在本文所述的任何重组蜡样芽孢杆菌家族成员中，融合蛋白可在孢子形成启动子的控制下表达，所述孢子形成启动子包含与seqidno:85-103中任一个的核酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
当孢子形成启动子包含与seqidno:85-103中任一个的核酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列时，一个或多个σ-k孢子形成特异性聚合酶启动子序列优选与seqidno:85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102或103的对应核苷酸具有100％同一性。例如，如上表2所示，炭疽芽孢杆菌sterne的bcla启动子(seqidno:85)在核苷酸24-32、35-43以及129-137处具有σ-k孢子形成特异性聚合酶启动子序列。因此，如果孢子形成启动子包含与seqidno:85的核酸序列具有至少90％同一性的序列，优选对应于seqidno:85的核苷酸24-32、35-43以及129-137的孢子形成启动子的核苷酸与seqidno:85的核苷酸24-32、35-43以及129-137具有100％同一性。
在本文所述的用于刺激植物生长的任何方法中，在包含重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种选自本文所公开的特定杀真菌剂的杀真菌剂的植物生长介质中生长的植物表现出相对于在不含重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞的相同植物生长介质中的植物的生长的增强的生长。
在本文所述的用于刺激植物生长的任何组合物和方法中，重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞可包括上文所述的任何细菌的重组植物生长促进菌株。
在本文所述的用于刺激植物生长的任何组合物和方法中，融合蛋白可在以上所述的任何启动子的控制下表达。
杀真菌剂
通常，“杀真菌的”意指物质提高真菌死亡率或抑制其生长速率的能力。
术语“真菌(fungus)”或“真菌(fungi)”包括多种不含叶绿素的有核产孢子的生物体。真菌的实例包括酵母、霉菌、霉(mildew)、锈菌类(rusts)和蕈类(mushrooms)。
本发明的组合物包含至少一种本文所公开的特定杀真菌剂。
本文中由其通用名指定的活性化合物是已知的，并且记载于，例如，“农药手册(pesticidemanual)”中或因特网(例如：http://www.alanwood.net/pesticides)上。
在一些实施方案中，杀真菌剂选自双苯三唑醇、联苯吡菌胺、糠菌唑、多菌灵、氯环丙酰胺、苯氟磺胺、咪唑菌酮、环酰菌胺、三苯基乙酸锡、毒菌锡、氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟喹唑、乙磷酸、异菌脲、异丙菌胺、异噻菌胺、苯氧菌胺、呋酰胺、戊菌隆、戊苯吡菌胺、丙氯灵丙氯灵、霜霉威、丙森锌、丙硫菌唑、嘧霉胺、螺环菌胺、戊唑醇、甲苯磺菌胺、三唑酮、三唑醇、咪唑嗪、肟菌酯、n-[5-氯-2-(三氟甲基)苄基]-n-环丙基-3-(二氟甲基)-5-氟-1-甲基-1h-吡唑-4-甲酰胺以及2,6-二甲基-1h,5h-[1,4]二硫己烷[2,3-c:5,6-c']联吡咯-1,3,5,7(2h,6h)-四酮。
在本发明的另一个实施方案中，杀真菌剂选自多菌灵、氟喹唑、异噻菌胺、戊菌隆、戊苯吡菌胺、丙硫菌唑、戊唑醇和肟菌酯。
在另一个实施方案中，杀真菌剂为n-(5-氯-2-异丙基苄基)-n-环丙基-3-(二氟甲基)-5-氟-1-甲基-1h-吡唑-4-甲酰胺。
本发明的组合物
根据本发明，所述组合物包含协同有效量的a)表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞，以及b)至少一种本文所公开的特定杀真菌剂，所述融合蛋白包含：(i)至少一种选自以下的植物生长刺激蛋白或肽：产生或活化植物生长刺激化合物中所涉及的酶，降解或修饰细菌、真菌或植物养分来源的酶，以及保护植物免受病原体侵袭的蛋白或肽，和(ii)将所述融合蛋白定位至芽孢杆菌属细胞孢子外壁的靶向序列。
本发明的“协同有效量”代表表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种如本文所述的特定杀真菌剂的组合的量，相比于单独的表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞或这种杀真菌剂，所述组合更有效地对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体。本发明的“协同有效量”还代表表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种如本文所公开的特定杀真菌剂的组合的量，相比于单独的表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞或所述杀真菌剂，所述组合更有效地增强植物生长和/或促进植物健康。
本发明包括本文所提及的各杀真菌剂与重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞的每一种组合。
其他添加剂
本发明的一个方面提供了如上所述的组合物，其还包含至少一种选自以下的助剂：填充剂、溶剂、自发促进剂、载体、乳化剂、分散剂、防霜剂、增稠剂和佐剂。那些组合物被称为制剂。
因此，在本发明的一个方面，提供这些制剂以及由其制备的施用形式作为包含本发明化合物的作物保护剂和/或杀虫剂(如浸液、滴液和喷雾液剂)。施用形式可包含其他作物保护剂和/或杀虫剂；和/或增强活性的佐剂如渗透剂，其实例为植物油(如油菜籽油、葵花籽油)、矿物油(如液体石蜡)、植物脂肪酸烷基酯(如油菜籽油甲酯或大豆油甲酯)或烷醇烷氧基化物；和/或铺展剂如烷基硅氧烷和/或盐类，其实例为有机或无机铵盐或鏻盐(实例为硫酸铵或磷酸氢二铵)；和/或保持促进剂，如二辛基磺基琥珀酸盐或羟丙基瓜尔胶聚合物；和/或保湿剂如丙三醇；和/或肥料如铵肥、钾肥或磷肥。
典型制剂的实例包括水溶性液剂(sl)、乳化浓缩剂(ec)、水乳剂(ew)、悬浮浓缩剂(sc、se、fs、od)、水分散性颗粒剂(wg)、颗粒剂(gr)和胶囊浓缩剂(cs)；制剂的这些及其他可能类型例如由国际作物生命(croplifeinternational)组织在以下文献中描述：《农药说明书》、《联合国粮农组织和世界卫生组织农药说明书开发与使用手册》、《联合国粮农组织植物生产与保护文件-173》(由联合国粮农组织/世界卫生组织关于农药手册的联合会议制订，2004，isbn：9251048576)。除本发明的一种或多种活性化合物以外，所述制剂可包含活性农用化学化合物。
所述制剂或施用形式优选包含助剂，如填充剂、溶剂、自发促进剂、载体、乳化剂、分散剂、防霜剂、杀生物剂、增稠剂和/或其他助剂，如佐剂。在本文中，佐剂是增强制剂的生物效应的组分，而该组分本身不具有生物效应。佐剂的实例为促进保持、扩散、对叶子表面的附着或渗透的试剂。
这些制剂通过已知方法制备，例如通过将活性化合物与助剂混合而制备，所述助剂例如为填充剂、溶剂和/或固体载体和/或其他助剂，例如表面活性剂。所述制剂在合适的设备中制备或者在施用前或施用过程中制备。
适各用作助剂的是这样的物质，它们适合赋予活性化合物的制剂或由这些制剂制备的施用形式(例如，可用的作物保护剂，如喷雾液剂或拌种剂)以特定性质，例如某些物理、技术和/或生物学性质。
合适的填充剂为，例如，水、极性和非极性有机化学液体，例如芳族烃和非芳族烃(如石蜡、烷基苯、烷基萘、氯苯)，醇和多元醇(如果合适，其还可被取代、醚化和/或酯化)，酮(如丙酮、环己酮)，酯(包括脂肪和油)和(聚)醚，未取代的和取代的胺、酰胺、内酰胺(如n-烷基吡咯烷酮)和内酯，砜和亚砜(如二甲基亚砜)。
如果所使用的填充剂是水，则还可使用例如有机溶剂作为助溶剂。基本上，合适的液体溶剂为：芳族化合物，如二甲苯、甲苯或烷基萘；氯代芳族烃和氯代脂族烃，如氯苯、氯乙烯或二氯甲烷；脂族烃，如环己烷或石蜡，例如石油馏分；矿物油和植物油；醇类，如丁醇或乙二醇及其醚和酯；酮类，如丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮或环己酮；强极性溶剂，如二甲基甲酰胺和二甲亚砜；以及水。
原则上，可以使用所有合适的溶剂。合适的溶剂为，例如，芳族烃，如二甲苯、甲苯或烷基萘；氯代芳族烃或氯代脂族烃，如氯苯、氯乙烯或二氯甲烷；例如脂族烃，如环己烷，例如石蜡、石油馏分；矿物油和植物油；醇类，例如甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇或乙二醇及其醚和酯；酮类，如丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮或环己酮；例如强极性溶剂，如二甲亚砜；以及水。
原则上，可使用所有合适的载体。合适的载体特别是：例如，铵盐和磨碎的天然矿物，如高岭土、粘土、滑石、白垩、石英、绿坡缕石、蒙脱石或硅藻土；以及磨碎的合成矿物，如细碎的二氧化硅、氧化铝和天然或合成硅酸盐、树脂、蜡和/或固体肥料。同样还可使用这些载体的混合物。适合用于颗粒剂的载体包括以下载体：例如，压碎并分级的天然矿物，如方解石、大理石、浮石、海泡石、白云石；以及无机和有机粉的合成颗粒；以及有机材料的颗粒，如锯屑、纸、椰壳、玉米穗轴和烟草茎。
还可使用液化的气态填充剂或溶剂。特别合适的是那些在标准温度和标准压力下为气态的填充剂或载体，实例为气溶胶喷射剂，如卤化烃，以及丁烷、丙烷、氮气和二氧化碳。
具有离子或非离子性质的乳化剂和/或发泡剂、分散剂或润湿剂、或这些表面活性物质的混合物的实例为：聚丙烯酸盐；木素磺酸盐；苯酚磺酸或萘磺酸盐；环氧乙烷与脂肪醇或与脂肪酸或与脂肪胺或与取代的酚类(优选烷基酚或芳基酚)的缩聚物；磺基丁二酸酯盐；牛磺酸衍生物(优选牛磺酸烷基酯)；聚乙氧基化醇或酚的磷酸酯；多元醇的脂肪酸酯；以及含硫酸盐、磺酸盐和磷酸盐的化合物的衍生物，实例为烷基芳基聚乙二醇醚、烷基磺酸盐、烷基硫酸盐、芳基磺酸盐、蛋白质水解产物、木质素-亚硫酸盐废液和甲基纤维素。如果所述活性化合物之一和/或所述惰性载体之一不溶于水，并且如果施用在水中进行，则表面活性物质的存在是有利的。
可存在于所述制剂和由其衍生的施用形式中的其他助剂包括着色剂，如无机颜料(实例为氧化铁、氧化钛、普鲁士蓝)，和有机染料(如茜素染料、偶氮染料和金属酞菁染料)；以及营养素和痕量营养素(如铁盐、锰盐、硼盐、铜盐、钴盐、钼盐和锌盐)。
还可存在提高化学和/或物理稳定性的稳定剂，如低温稳定剂、防腐剂、抗氧化剂、光稳定剂或其他试剂。此外，可存在发泡剂或消泡剂。
此外，所述制剂和由其衍生的施用形式还可包含，作为附加助剂的粘着剂，如羧甲基纤维素，粉末、颗粒或胶乳形式的天然和合成聚合物(如阿拉伯树胶、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯)，以及天然磷脂(如脑磷脂和卵磷脂，和合成磷脂)。其他可能的助剂包括矿物油和植物油。
所述制剂和由其衍生的施用形式中还可存在其他助剂。这些添加剂的实例包括香料、保护性胶体、粘合剂(binder)、粘结剂(adhesive)、增稠剂、触变物质、渗透剂、保持促进剂、稳定剂、螯合剂、络合剂、保湿剂和铺展剂。一般而言，活性化合物可与通常用于制剂目的的任何固体或液体添加剂结合。
合适的保持促进剂包括降低动力学表面张力的所有那些物质，如磺基丁二酸二辛酯；或增加粘弹性的所有那些物质，如羟丙基瓜尔胶聚合物。
在本发明的上下文中，合适的渗透剂为通常用于增强活性农用化学化合物向植物内渗透的所有那些物质。在本上下文中，渗透剂被定义为，其能够从(通常是水性的)施用液体和/或从喷雾涂层渗透植物的角质层并由此提高活性化合物在角质层中的迁移的物质。可使用文献(bauretal.，1997，pesticidescience51，131-152)中记载的方法来测定这种特性。实例包括醇烷氧基化物，如椰子脂肪乙氧基化物(10)或异十三烷基乙氧基化物(12)；脂肪酸酯，如油菜籽油甲酯或大豆油甲酯；脂肪胺烷氧基化物，如牛油胺乙氧基化物(15)；或铵盐和/或鏻盐，如硫酸铵或磷酸氢二铵。
以所述制剂的重量计，其优选包含0.0001重量％至98重量％的活性化合物，或特别优选0.01重量％至95重量％的活性化合物，更优选0.5重量％至90重量％的活性化合物。活性化合物的含量被定义为重组产孢子外壁的外芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所公开的特定杀真菌剂的总和。
由所述制剂制备的施用形式(作物保护产品)的活性化合物含量可在宽的范围内变化。以所述施用形式的重量计，其活性化合物浓度通常可为0.0001重量％至95重量％的活性化合物，优选为0.0001重量％至1重量％。施用以适合于施用形式的常规方式进行。
此外，在本发明的一方面，提供了包含在空间上分开放置的协同有效量的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所公开的特定杀真菌剂的试剂盒。
在本发明的其他实施方案中，上述试剂盒还包含至少一种其他杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂。所述杀真菌剂和/或杀虫剂可存在于在空间上分隔的试剂盒的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞组分中或试剂盒的杀真菌剂组分中，或同时存在于在这两种组分中。优选地，所述杀真菌剂和杀虫剂存在于基于重组蜡样芽孢杆菌家族成员的生物防治剂组分中。
此外，本发明的试剂盒还可包含至少一种选自以下的助剂：如下所述的填充剂、溶剂、自发促进剂、载体、乳化剂、分散剂、防霜剂、增稠剂和佐剂。所述至少一种助剂可存在于在空间上分隔的试剂盒的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞组分中或试剂盒的杀真菌剂组分中，或同时存在于在这两种组分中。
在本发明的另一方面，如上所述的组合物用于降低由昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体引起的植物和植物部位的整体损害以及采收的果实或蔬菜的损失。
此外，在本发明的另一方面，如上所述的组合物提高了整体植物健康。
术语“植物健康”通常包括与害虫防治无关的多种植物改进。例如，可提及的有利特性是改进的作物特征，其包括：出苗、作物产量、蛋白含量、油含量、淀粉含量、更发达的根系、改进的根部生长、改进的根部大小维持、改进的根部效率、改进的耐胁迫性(例如，抗干旱、热、盐、uv、水、寒冷)、乙烯减少(减少产生和/或抑制接收)、分蘖增加、植物高度增加、更大的叶片、基底部死叶更少、更强的分蘖、更绿的叶颜色、色素含量、光合作用活性、所需输入(如肥料或水)更少、所需种子更少、更高产的分蘖、开花更早、谷物成熟早、植物倒伏更少、芽生长增加、植物活力增强、植物直立性增加以及发芽更早更好。
对于本发明的用途，改进的植物健康优选是指包括以下的改进的植物特征：作物产量、更发达的根系(改进的根部生长)、改进的根部大小维持、改进的根部效率、分蘖增加、植物高度增加、更大的叶片、基底部死叶更少、更强的分蘖、更绿的叶颜色、光合作用活性、更高产的的分蘖、植物活力增强以及植物直立性增加。
对于本发明，改进的植物健康特别优选指选自如下的改进的植物特性：作物产量、更发达的根系、更发达的根部生长、改进的根部大小维持、改进的根部效率、分蘖增加以及植物高度增加。
本发明的组合物对如本文所定义的植物健康的作用可通过比较在同一环境条件下生长的植物而测定，其中所述植物的一部分用本发明的组合物处理，所述植物的另一部分不用本发明的组合物处理。相反，所述其他部分完全不经处理，或用安慰剂处理(即没有施用本发明的组合物，如没有施用所有活性成分(即，无如本文所述的基于重组蜡样芽孢杆菌家族成员的生物防治剂和无如本文所述的杀真菌剂)，或没有施用如本文所述的基于重组蜡样芽孢杆菌家族成员的生物防治剂，或没有施用如本文所述的杀真菌剂。
本发明的组合物可以任何所需的方式施用，如以种子包衣、土壤浸液和/或直接施用于犁沟中、和/或以叶面喷雾的形式，并且可在出苗前、出苗后或出苗前后都施用。换言之，所述组合物可被施用于种子、植物或采收的果实和蔬菜，或植物正生长于其中或需要在其中生长的土壤(植物的生长地点)。
降低植物和植物部位的整体损害通常得到更健康的植物和/或使植物活力和产量提高。
优选地，本发明的组合物用于处理传统植物或转基团植物或其种子。
本发明还涉及使用上述包含表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所公开的特定杀真菌剂的任何组合物来刺激植物生长的方法。刺激植物生长的方法包括向植物、植物部位、植物周围的地点或将要种植植物的地点(例如，土壤或其他生长介质)施用组合物，所述组合物包含协同有效量的表达融合蛋白的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞，以及至少一种本文所公开的其他特定杀菌剂，所述融合蛋白包含：(i)至少一种植物生长刺激蛋白或肽，和(ii)靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段。
在本发明的另一方面，提供了一种降低由昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体引起的植物和植物部位的整体损害以及降低采收的果实或蔬菜的损失的方法，其包括同时或依次地施用协同有效量的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所公开的特定杀真菌剂的步骤。
在本发明的另一实施方案中，除了重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和本文所公开的特定杀真菌剂之外，所述组合物还包含至少一种杀虫剂和/或至少一种杀真菌剂。在一个实施方案中，所述至少一种杀虫剂是合成杀虫剂。
本发明的方法包括以下施用方法，即可将之前提及的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所公开的特定杀真菌剂配制成具有农业上可接受的保质期的单一、稳定的组合物(所谓的“独配制剂”)，或在使用之前或使用时进行组合(所谓的“组合制剂”)。
如果没有另外提及，表述“组合”代表以如下形式存在的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所公开的特定杀真菌剂以及任选的至少一种其他杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂的各种组合：以独配制剂形式、单一“预混”形式、以由独配制剂组成的组合喷雾混合物(如“桶混”)形式，以及特别是以依次的方式(即在合理的短时期如几小时或几天，例如2小时至7天内相继地)施用时，单一活性成分的组合使用。施用本发明组合物的顺序不是实施本发明的关键。因此，术语“组合”还涵盖例如在同时或依次地向植物、其周围环境、生境或者储存空间施用重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所公开的特定杀真菌剂，以及任选的至少一种其他杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂之后，所述重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所公开的特定杀真菌剂，以及任选的至少一种其他杀真菌剂和/或杀虫剂存在于在待处理的植物之上或之中或其周围环境、生境或者储存空间中。
如果以依次的方式施用或使用重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所公开的特定杀真菌剂，以及任选的至少一种其他杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂，则优选按照以下方法处理植物或植物部位(包括种子和由种子萌发的植物)、采收的果实和蔬菜：首先，将至少一种本文所公开的特定杀真菌剂以及任选的至少一种其他杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂施用于植物或植物部位；其次，将重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞施用于同一植物或植物部位。通过这种施用方式，采收时植物上杀虫剂/杀真菌剂的残留量尽可能地低。在(作物)生长周期内的第一次施用和第二次施用之间的时间段可以改变并且取决于所要达到的效果。例如，进行第一次施用以防止植物或植物部位被昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体侵染(特别是在处理种子的情况下)，或对抗昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的侵染(特别是在处理植物和植物部位的情况下)；进行第二次施用以防止或防治昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的侵染和/或促进植物生长。在本发明的上下文中，防治意指重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞并不能够完全消灭害虫或植物病原性真菌，但是能够使侵染保持在可接受的水平上。
本发明还提供了通过多重施用而增强本发明组合物的杀死、抑制、预防和/或抵抗活性的方法。在一些其他的实施方案中，在任何需要的发育阶段中或在任何预定的害虫压力下，以约1小时、约5小时、约10小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约1周、约10天、约2周、约3周、约1个月或更长时间的间隔，将本发明的组合物施用于植物和/或植物部位两次。在一些实施方案中，在任何需要的发育阶段中或在任何预定的害虫压力下，以约1小时、约5小时、约10小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约1周、约10天、约2周、约3周、约1个月或更长时间的间隔，将本发明的组合物施用于植物和/或植物部位多于两次(例如3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次)。如果需要，各施用之间的间隔可不同。本领域技术人员将能够根据植物种类、植物害虫种类和其他因素决定施用的次数和间隔长度。
通过按照前述步骤，在经处理的植物、植物部位和采收的果实和蔬菜上可以实现至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂的非常低水平的残留。
如果没有另外提及，用本发明组合物对植物或植物部位(包括种子和由种子萌发的植物)、采收的果实和蔬菜的处理直接进行或作用于其周围环境、生境或储存空间，所述处理使用常规的处理方法(例如浸渍、喷雾、雾化、灌溉、蒸发、撒粉、弥雾(fogging)、撒播、发泡、涂抹(painting)、涂布(spreading-on)、浇水(浸湿)、滴灌)。还可以独配制剂或组合制剂的形式以超低容量法施用重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞、至少一种本文所公开的特定杀真菌剂以及任选的至少一种其他杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂，或将本发明组合物以组合物或独配制剂的形式注入到土壤中(犁沟中)。
术语“待处理的植物”涵盖植物的每个部位，包括其根系和分别在待处理的植物的主茎或树干附近至少10cm、20cm、30cm的半径内或在所述待处理植物的根系至少10cm、20cm、30cm附近的物质(例如土壤或营养基质)。
任选在至少一种其他杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂的存在下，与至少一种本文所公开的特定杀真菌剂组合使用或施用的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞的量取决于最终制剂以及待处理的植物、植物部位、种子、采收的果实或蔬菜的大小或种类。通常，根据本发明待施用或使用的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞以其独配制剂或与至少一种本文所公开的特定杀真菌剂和任选的其他杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂的组合制剂的约1％至约80％(w/w)、优选约1％至约60％(w/w)、更优选约10％至约50％(w/w)存在。
同样，任选在至少一种其他杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂的存在下，与重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞组合使用或施用的至少一种本文所公开的特定杀真菌剂的量取决于最终制剂以及待处理的植物、植物部位、种子、采收的果实或蔬菜的大小或种类。通常，根据本发明待施用或使用的特定杀菌剂以其独配制剂或与重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和任选的至少一种其他杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂的组合制剂的约1％至约80％(w/w)、优选1％至约60％(w/w)、更优选约10％至约50％(w/w)存在。
重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞的施用可以叶面喷雾剂、土壤处理剂和/或种子处理剂/拌种剂的形式进行。当用作叶面处理剂时，在一个实施方案中，每英亩施用约1/16至约5加仑的全发酵液。当用作土壤处理剂时，在一个实施方案中，每英亩施用约1至约5加仑的全发酵液。当用于种子处理时，每英亩施用约1/32至约1/4加仑的全发酵液。对于种子处理，最终用途制剂包含至少1×104、至少1×105、至少1×106、1×107、至少1×108、至少1×109、至少1×1010个菌落形成单位/克。
以协同重量比使用或施用重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所公开的特定杀真菌剂以及(如果优选存在的话)其他杀真菌剂和/或杀虫剂。技术人员能够通过常规方法找到用于本发明的协同重量比。技术人员应理解，这些比例是指组合制剂内的比例，以及当两种组分以单一制剂的形式施用至待处理植物时，本文所述的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所公开的特定杀真菌剂的计算比例。由于重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种特定杀真菌剂分别在单一制剂中的体积和量是技术人员已知的，因此，技术人员可通过简单的数学计算出该比例。
所述比例可基于如下进行计算：在将本发明组合的所述组分施用于植物或植物部位的时间点时的所述至少一种本文所公开的特定杀真菌剂的量，以及在将本发明组合的所述组分施用于植物或植物部位之前不久(例如，48h、24h、12h、6h、2h、1h)或该时间点时的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞的量。
可将重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所公开的特定杀真菌剂同时或在不同时间施用于植物或植物部位，只要在一次或多次施用后两种组分存在于植物上或植物内即可。在重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和本文所公开的特定杀真菌剂在不同时间施用，且本文所公开的特定杀真菌剂在重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞之前施用的情况下，技术人员可通过本领域已知的化学分析测定在施用重组产外孢壁芽孢杆菌属细胞的时间点或该时间点之前不久，杀真菌剂在植物上/内的浓度。反之亦然，当首先将重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞施用于植物时，可使用本领域已知的测试在施用杀真菌剂的时间点或该时间点之前不久测定重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞的浓度。
特别地，在一个实施方案中，重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所公开的特定杀真菌剂的协同重量比在1:1000至1000:1的范围内，优选在1:500至500:1的范围内，更优选在1:300至500:1的范围内。尤其优选的比例为20:1至1:20，如10:1、5:1或2:1。必须注意的是，这些比例范围是指基于重组蜡样芽胞杆菌家族成员的生物防治剂(待与至少一种本文所公开的特定杀真菌剂或至少一种本文所公开的特定杀真菌剂的制剂组合)。例如，比例100:1意指100重量份的基于重组产孢子外壁的芽孢杆菌属的生物防治剂的孢子制剂与1重量份的本文所公开的特定杀真菌剂组合(作为独配制剂、组合制剂或通过单独施用于植物从而在植物上形成结合物)。在该实施方案的一方面，重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞的孢子制品为干燥的孢子制品，其含有至少约1×104cfu/g、至少约1×105cfu/g、至少约1×106cfu/g、至少约1×107cfu/g、至少约1×108cfu/g、至少约1×109cfu/g、至少约1×1010cfu/g或至少约1×1011cfu/g。
在另一个实施方案中，重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所公开的特定杀真菌剂的协同重量比在1:100至20,000:1的范围内，优选在1:50至10,000:1的范围内或甚至在1:50至1000:1的范围内。
在本发明的一个实施方案中，重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞在分散后的浓度为至少50g/ha，如50-7500g/ha、50-2500g/ha、50-1500g/ha；至少250g/ha(公顷)，至少500g/ha或至少800g/ha。
根据本发明施用或使用的组合物的施用率可变化。技术人员能够通过常规实验找到合适的施用率。
在本发明的另一方面，提供了用如上所述的组合物处理的种子。
通过处理植物的种子来防治昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体是长期已知的并且是持续改进的主题。然而，种子处理涉及一系列不能总是以令人满意的方式解决的问题。因此，需要开发用于保护种子和发芽植物的方法，所述方法不需要或至少显著降低在植物的储存过程中、播种后或出苗后额外递送作物保护组合物的需要。此外，需要优化所使用的活性成分的量，从而为种子和发芽植物提供最可能的保护以使其免受昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的攻击，而所使用的活性成分不会损害植物本身。特别地，处理种子的方法还应考虑抵抗害虫或耐受害虫的转基因植物固有的杀虫或杀线虫特性，以实现用最少量的作物保护组合物获得对种子和发芽植物的最佳保护。
因此，本发明还特别涉及一种通过用协同有效量的如上所定义的重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所公开的特定杀真菌剂处理种子来保护种子和发芽植物免受害虫攻击的方法。本发明的用于保护种子和发芽植物免受害虫攻击的方法涵盖这样一种方法，其中用重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所公开的特定杀真菌剂，以及任选的至少一种其他杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂，在一次操作中同时处理种子。其还涵盖这样一种方法，其中用重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所公开的特定杀真菌剂，以及任选的至少一种其他杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂，在不同时间处理种子。
本发明还涉及本发明的组合物用于处理种子以保护种子和所得植物免受昆虫、螨虫、线虫和/或植物病原体的侵袭的用途。
本发明还涉及已同时用重组产孢子外壁的芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所公开的特定杀真菌剂，以及任选的至少一种其他杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂处理的种子。本发明还涉及已用重组产孢子外壁芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所公开的特定杀真菌剂以及任选的至少一种其他杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂在不同时间处理的种子。在已用重组产孢子外壁芽孢杆菌属细胞和至少一种本文所公开的特定杀真菌剂，以及任选的至少一种其他杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂在不同时间处理的种子的情况下，本发明组合物中的各活性成分可存在于种子上的不同层中。
此外，本发明涉及这样的种子，其在用本发明的组合物处理之后，经过薄膜包衣过程以防止灰尘对种子的磨损。
本发明的优势之一在于，由于本发明组合物的特定的系统特性，用这些组合物处理种子不仅为种子本身还为源自该种子的植物(在其出苗后)提供保护以免受昆虫、螨虫、线虫/或植物病原体的侵袭。这样，可不必在播种时或其后不久对作物直接进行处理。
另一个优势可见于事实：通过用本发明的组合物处理种子，可促进经处理的种子的发芽和出苗。
同样被认为有利的是，本发明的组合物还可特别地用于转基因种子。
还应说明，本发明的组合物可与信号传导技术试剂组合使用，其结果是，例如，改进了与共生体的集群(colonization)，增强了例如根瘤菌、菌根和/或植物内生细菌，和/或优化了固氮作用。
本发明的组合物适于保护在农业、温室、林业或园艺中使用的任何植物品种的种子。更具体地，所述种子为谷物(例如，小麦、大麦、黑麦、燕麦和粟)、玉米、棉花、大豆、稻、马铃薯、向日葵、咖啡豆、烟草、加拿大油菜(canola)、油菜、甜菜(例如，糖用甜菜和饲用甜菜)、花生、蔬菜(例如番茄、黄瓜、豆、十字花科蔬菜、洋葱和莴苣)、果实植物、草坪和观赏植物的种子。特别重要的是处理谷物(如小麦、大麦、黑麦和燕麦)、玉米、大豆、棉花、加拿大油菜、油菜和稻的种子。
如上已提及，用本发明的组合物处理转基因种子是特别重要的。在此所述的种子为通常包含至少一种异源基因的植物的种子，所述异源基因控制具有(特别是)杀虫和/或杀线虫特性的多肽的表达。转基因种子中的这些异源基因可源自微生物如芽孢杆菌属、根瘤菌属(rhizobium)、假单孢菌属(pseudomonas)、沙雷氏菌属(serratia)、木霉属(trichoderma)、棒状杆菌属(clavibacter)、球囊霉属(glomus)或者胶霉属(gliocladium)。本发明特别适于处理包含至少一种源自芽孢杆菌属种(bacillussp)的异源基因的转基因种子。特别优选地，所述异源基因源自苏云金芽孢杆菌。
为了本发明的目的，将本发明的组合物单独或以适合的制剂形式施用于种子。优选在足够稳定以在处理过程中不发生损伤的状态下处理种子。一般而言，可在采收和播种之间的任何时间点处理种子。通常，使用已从植物中分离并且已除去穗轴、外壳、茎、荚、毛或果肉的种子。因此，例如，可以使用已采收、清理且干燥至含水量小于15重量％的种子。或者，也可使用在干燥后用例如水处理然后再干燥的种子。
一般而言，当处理种子时，必须确保施用于种子的本发明组合物的量和/或其他添加剂的量经过选择以使种子的发芽不受到不利影响，和/或由该种子萌发的植物不受到损伤。特别是在特定施用率下可表现出植物毒性作用的活性成分的情况下。
本发明的组合物可直接施用，换言之，不包含其他组分且不经稀释。通常，优选以合适的制剂形式将组合物施用于种子。用于处理种子的合适的制剂和方法是技术人员已知的并且记载于例如以下文献中：美国专利no.4,272,417a、no.4,245,432a、no.4,808,430a、no.5,876,739a；美国专利公开no.2003/0176428a1；wo2002/080675a1；wo2002/028186a2。
根据本发明可使用的结合物可以转化成常规拌种制剂，如溶液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、泡沫剂、浆剂或其他种子包衣组合物，以及ulv制剂。
这些制剂可用已知方式通过将组合物与常规佐剂混合而制备，所述常规佐剂为，例如，常规填充剂以及溶剂或稀释剂、着色剂、润湿剂、分散剂、乳化剂、消泡剂、防腐剂、二次增稠剂、粘着剂、赤霉素以及水。
可存在于可根据本发明使用的拌种制剂中的着色剂包括常规用于此目的的所有着色剂。在本文中，不仅可以使用具有低水溶性的颜料，也可以使用水溶性的染料。实例包括已知的名称为罗丹明b、c.i.颜料红112和c.i.溶剂红1的着色剂。
可存在于可根据本发明使用的拌种制剂中的润湿剂包括促进润湿且常规用于活性农用化学成分的制剂的所有物质。优选使用烷基萘磺酸盐，如二异丙基萘磺酸盐或二异丁基萘磺酸盐。
可存在于可根据本发明使用的拌种制剂中的分散剂和/或乳化剂包括常规用于活性农用化学成分的制剂的所有非离子、阴离子和阳离子分散剂。优选使用非离子或阴离子分散剂，或非离子或阴离子分散剂的混合物。合适的非离子分散剂特别为环氧乙烷-环氧丙烷嵌段聚合物、烷基酚聚乙二醇醚以及三苯乙烯基酚聚乙二醇醚，及其磷酸化或硫酸化衍生物。合适的阴离子分散剂特别为木素磺酸盐、聚丙烯酸盐和芳基磺酸盐-甲醛缩合物。
可存在于可根据本发明使用的拌种制剂中的消泡剂包括常规用于活性农用化学成分的制剂的所有泡沫抑制剂。可优选使用有机硅消泡剂和硬脂酸镁。
可存在于可根据本发明使用的拌种制剂中的防腐剂包括在农用化学组合物中可用于此目的的所有物质。实例包括双氯酚和苄醇半缩甲醛。
可存在于可根据本发明使用的拌种制剂中的二次增稠剂包括在农用化学组合物中可用于此目的的所有物质。优选考虑的那些二次增稠剂包括纤维素衍生物、丙烯酸衍生物、黄原胶、改性粘土以及高度分散的二氧化硅。
可存在于可根据本发明使用的拌种制剂中的粘着剂包括可用于拌种产品中的所有常规粘合剂。可优选提及聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇和甲基纤维素。
可存在于可根据本发明使用的拌种制剂中的赤霉素优选包括赤霉素a1、a3(＝赤霉酸)、a4和a7；特别优选使用赤霉酸。赤霉素是已知的(参见r.wegler“chemiederpflanzenschutz-und
可根据本发明使用的拌种制剂可以直接地或在先用水稀释后用于处理各种不同种类的任何种子。因此，所述浓缩剂或可通过用水稀释而由其获得的制剂可用于对以下植物的种子进行拌种：谷物如小麦、大麦、黑麦、燕麦和黑小麦，以及玉米、稻、油菜、豌豆、豆、棉花、向日葵和甜菜，或各种不同蔬菜中任一种的种子。可根据本发明使用的拌种制剂或其稀释制剂也可用于转基因植物的拌种。在这种情况下，在与通过表达形成的物质的相互作用中还可产生额外的协同效应。
对于用可根据本发明使用的拌种制剂或通过加入水而由其制得的制剂处理种子而言，合适的混合设备包括通常可用于拌种的所有的这种设备。更具体地，进行拌种的过程是：将种子置于混合器内，加入特定所需量的拌种制剂(以其本身或预先用水稀释后)，并进行混合直到制剂均匀地分布在种子上。随后可进行干燥操作。
可根据本发明使用的拌种制剂的施用率可在相对宽的范围内变化。施用率由制剂中的基于重组蜡样芽孢杆菌家族成员的生物防治剂和至少一种本文所公开的特定杀真菌剂的具体含量和种子决定。在组合物的情况下，施用率通常为0.001至50g/kg种子，优选为0.01至15g/kg种子。
此外，本发明的组合物优选具有潜在的杀微生物活性并可在作物保护和材料保护中用于防治不想要的微生物，如真菌和细菌。
本发明还涉及一种用于防治不想要的微生物的方法，其特征在于，将本发明的组合物施用于植物病原性真菌、植物病原性细菌和/或其生境。
杀真菌剂可在作物保护中用于防治植物病原性真菌。所述杀真菌剂的特征在于，在对抗广谱的植物病原性真菌方面有突出的功效，所述植物病原性真菌包括土壤传播的病原体，其特别是根肿菌纲(plasmodiophoromycetes)、卵菌纲(peronosporomycetes(同义词，卵菌纲(oomycetes))、壶菌纲(chytridiomycetes)、接合菌纲(zygomycetes)、子囊菌纲(ascomycetes)、担子菌纲(basidiomycetes)和半知菌纲(deuteromycetes)(同义词：不完全真菌纲(fungiimperfecti))的成员。一些杀真菌剂具有全身性活性并可在作物保护中用作叶子杀真菌剂、拌种杀真菌剂或土壤杀真菌剂。此外，它们适于对抗尤其是侵袭植物的木质或根部的真菌。
杀细菌剂可在作物保护中用于防治假单孢菌科(pseudomonadaceae)、根瘤菌科(rhizobiaceae)、肠杆菌科(enterobacteriaceae)、棒状杆菌科(corynebacteriaceae)和链霉菌科(streptomycetaceae)。
可根据本发明处理的真菌性病害的病原体的非限制性实例包括：
由白粉病病原体引起的病害，例如布氏白粉菌属(blumeria)菌种，例如禾本科布氏白粉菌(blumeriagraminis)；叉丝单囊壳属(podosphaera)菌种，例如白叉丝单囊壳(podosphaeraleucotricha)；单囊壳属(sphaerotheca)菌种，例如凤仙花单囊壳(sphaerothecafuliginea)；钩丝壳属(uncinula)菌种，例如葡萄钩丝壳(uncinulanecator)；
由锈病病原体引起的病害，例如胶锈菌属(gymnosporangium)菌种，例如褐色胶锈菌(gymnosporangiumsabinae)；驼孢锈属(hemileia)菌种，例如咖啡驼孢锈菌(hemileiavastatrix)；层锈菌属(phakopsora)菌种，例如豆薯层锈菌(phakopsorapachyrhizi)和山马蝗层锈菌(phakopsorameibomiae)；柄锈菌属(puccinia)菌种，例如隐匿柄锈菌(pucciniarecondita)、小麦叶锈病菌(p.triticina)、小麦杆锈菌(p.graminis)或小麦条锈菌(p.striiformis)；单胞锈菌属(uromyces)菌种，例如疣顶单胞锈菌(uromycesappendiculatus)；
由卵菌纲(oomycete)病原体引起的病害，例如，白锈属(albugo)菌种，例如白锈菌(albugocandida)；盘霜霉属(bremia)菌种，例如莴苣盘霜霉(bremialactucae)；霜霉属(peronospora)菌种，例如豌豆霜霉(peronosporapisi)或十字花科霜霉(peronosporabrassicae)；疫霉属(phytophthora)菌种，例如致病疫霉(phytophthorainfestans)；轴霜霉属(plasmopara)菌种，例如葡萄生轴霜霉(plasmoparaviticola)；假霜霉属(pseudoperonospora)菌种，例如草假霜霉(pseudoperonosporahumuli)或古巴假霜霉(pseudoperonosporacubensis)；腐霉属(pythium)菌种，例如终极腐霉(pythiumultimum)；
由下述病原体引起的叶斑枯病(leafblotch)和叶萎蔫病(leafwilt)病害：例如，链格孢属(alternaria)菌种，例如早疫病链格孢(alternariasolani)；尾孢属(cercospora)菌种，例如菾菜生尾孢(cercosporabeticola)；枝孢(cladiosporium)属，例如黄瓜枝孢(cladiosporiumcucumerinum)；旋孢腔菌属(cochliobolus)菌种，例如禾旋孢腔菌(cochliobolussativus)(分生孢子形式：德氏霉属(drechslera)，同义词：长蠕孢属(helminthosporium))、宫部旋孢霉(cochliobolusmiyabeanus)；炭疽菌属(colletotrichum)菌种，例如菜豆炭疽菌(colletotrichumlindemuthanium)；锈斑病菌属(cycloconium)菌种，例如孔雀斑病(cycloconiumoleaginum)；间座壳属(diaporthe)菌种，例如柑桔间座壳(diaporthecitri)；痂囊腔菌属(elsinoe)菌种，例如柑桔痂囊腔菌(elsinoefawcettii)；盘长孢属(gloeosporium)菌种，例如悦色盘长孢(gloeosporiumlaeticolor)；小丛壳(glomerella)属，例如围小丛壳(glomerellacingulata)；球座菌属(guignardia)菌种，例如葡萄球座菌(guignardiabidwelli)；小球腔菌属(leptosphaeria)菌种，例如斑污小球腔菌(leptosphaeriamaculans)；大毁壳属(magnaporthe)菌种，例如灰色大毁壳(magnaporthegrisea)；微座孢属(microdochium)菌种，例如雪霉微座孢(microdochiumnivale)；球腔菌属(mycosphaerella)菌种，例如禾生球腔菌(mycosphaerellagraminicola)、落花生球腔菌(m.arachidicola)和斐济球腔菌(m.fijiensis)；壳针孢属(phaeosphaeria)菌种，例如颖枯壳针孢(phaeosphaerianodorum)；核腔菌属(pyrenophora)菌种，例如圆核腔菌(pyrenophorateres)、偃麦草核腔菌(pyrenophoratriticirepentis)；柱隔孢属(ramularia)菌种，例如辛加柱隔孢(ramulariacollo-cygni)、白斑柱隔孢(ramulariaareola)；喙孢属(rhynchosporium)菌种，例如黑麦喙孢(rhynchosporiumsecalis)；针孢属(septoria)菌种，例如芹菜小壳针孢(septoriaapii)、番茄壳针孢(septorialycopersii)；核瑚菌属(typhula)菌种，例如肉孢核瑚菌(typhulaincarnata)；黑星菌属(venturia)菌种，例如苹果黑星病菌(venturiainaequalis)；
由下述病原体引起的根和茎病害：例如，伏革菌属(corticium)菌种，例如禾伏革菌(corticiumgraminearum)；镰孢属(fusarium)菌种，例如尖镰孢(fusariumoxysporum)；顶囊壳属(gaeumannomyces)菌种，例如禾顶囊壳(gaeumannomycesgraminis)；丝核菌属(rhizoctonia)菌种，例如立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)；由例如稻帚枝杆孢(sarocladiumoryzae)引起的帚枝杆孢属(sarocladium)病害；由例如稻腐小核菌(sclerotiumoryzae)引起的小核菌属(sclerotium)病害；塔普斯属(tapesia)菌种，例如塔普斯梭状芽孢杆菌(tapesiaacuformis)；根串珠霉属(thielaviopsis)菌种，例如根串珠霉(thielaviopsisbasicola)；
由下述病原体引起的肉穗花序或散穗花序病害(包括玉米穗轴)：例如，链格孢属(alternaria)菌种，例如链格孢属(alternariaspp.)；曲霉属(aspergillus)菌种，例如黄曲霉(aspergillusflavus)；枝孢属(cladosporium)菌种，例如芽枝状枝孢(cladosporiumcladosporioides)；麦角菌属(claviceps)菌种，例如麦角菌(clavicepspurpurea)；镰孢属(fusarium)菌种，例如黄色镰孢(fusariumculmorum)；赤霉属(gibberella)菌种，例如玉蜀黍赤霉(gibberellazeae)；小画线壳属(monographella)菌种，例如雪腐小画线壳(monographellanivalis)；壳针孢属(septoria)菌种，例如狗牙根壳针孢(septorianodorum)；
由黑粉菌引起的病害，例如，轴黑粉菌属(sphacelotheca)菌种，例如丝孢堆黑粉菌(sphacelothecareiliana)；腥黑粉菌属(tilletia)菌种，例如小麦网腥黑粉菌(tilletiacaries)、小麦矮腥黑粉菌(t.controversa)；条黑粉菌属(urocystis)菌种，例如隐条黑粉菌(urocystisocculta)；黑粉菌属(ustilago)菌种，例如裸黑粉菌(ustilagonuda)、小麦散黑粉菌(u.nudatritici)；
由例如下列病原体导致的果实腐烂病：曲霉属(aspergillus)菌种，例如黄曲霉(aspergillusflavus)；葡萄孢属(botrytis)菌种，例如灰葡萄孢(botrytiscinerea)；青霉属(penicillium)菌种，例如扩展青霉(penicilliumexpansum)和产紫青霉(p.purpurogenum)；核盘菌属(sclerotinia)菌种，例如核盘菌(sclerotiniasclerotiorum)；轮枝菌属(verticilium)菌种，例如黑白轮枝菌(verticiliumalboatrum)；
由例如下述病原体引起的种子腐烂和土壤传播的腐烂、发霉、萎蔫、腐烂和立枯病：例如，链格孢属(alternaria)菌种，例如芸薹链格孢(alternariabrassicicola)；丝囊霉属(aphanomyces)菌种，例如根腐丝囊霉(aphanomyceseuteiches)；壳二孢属(ascochyta)菌种，例如兵豆壳二孢(ascochytalentis)；曲霉属菌种，例如黄曲霉(aspergillusflavus)；枝孢属(cladosporium)菌种，例如草本枝孢(cladosporiumherbarum)；旋孢腔菌属(cochliobolus)菌种，例如禾旋孢腔菌(cochliobolussativus)(分生孢子形式：德氏霉属，平脐蠕孢属(bipolaris)又名：长蠕孢菌(helminthosporium))；炭疽菌属(colletotrichum)菌种，例如毛核炭疽菌(colletotrichumcoccodes)；镰孢属(fusarium)菌种，例如黄色镰孢(fusariumculmorum)；赤霉属(gibberella)菌种，例如玉蜀黍赤霉(gibberellazeae)；壳球孢属(macrophomina)菌种，例如菜豆壳球孢(macrophominaphaseolina)；小画线壳属(monographella)菌种，例如雪腐小画线壳(monographellanivalis)；青霉属(penicillium)菌种，例如扩展青霉(penicilliumexpansum)；茎点霉属(phoma)菌种，例如黑胫茎点霉(phomalingam)；拟茎点霉属(phomopsisspecies)菌种，例如大豆拟茎点霉(phomopsissojae)；疫霉属(phytophthora)菌种，例如恶疫霉(phytophthoracactorum)；核腔菌属(pyrenophora)菌种，例如麦类核腔菌(pyrenophoragraminea)；梨孢属(pyricularia)菌种，例如稻梨孢(pyriculariaoryzae)；腐霉属(pythium)菌种，例如终极腐霉(pythiumultimum)；丝核菌属(rhizoctonia)菌种，例如立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)；根霉菌属(rhizopus)菌种，例如稻根霉菌(rhizopusoryzae)；小核菌属(sclerotium)菌种，例如齐整小核菌(sclerotiumrolfsii)；壳针孢属(septoria)菌种，例如颖枯壳针孢(septorianodorum)；核瑚菌属(typhula)菌种，例如肉孢核瑚菌(typhulaincarnata)；轮枝孢菌属(verticillium)菌种，例如大丽花轮枝孢(verticilliumdahliae)；
由例如丛赤壳属(nectria)菌种(例如干癌丛赤壳菌(nectriagalligena))引起的癌性病害、菌瘿和从枝病(witches’broom)；
由例如链核盘菌属(monilinia)菌种(例如核果链核盘菌(monilinialaxa))引起的萎缩病害；
由下述病原体引起的叶疱病和卷叶病：例如外担菌属(exobasidium)菌种，例如坏损外担菌(exobasidiumvexans)；外囊菌属(taphrina)菌种，例如畸形外囊菌(taphrinadeformans)；
由下述病原体引起的木本植物退化病害：例如由根霉格孢菌(phaeomoniellachlamydospora)、鸡腿蘑丝孢(phaeoacremoniumaleophilum)和地中海孢孔菌(fomitiporiamediterranea)引起的依科病(esca)；例如由葡萄顶枯菌(eutypalata)引起的葡萄顶枯病(eutypadyeback)；例如由孢灵芝(ganodermaboninense)引起的灵芝病害；例如由木硬孔菌(rigidoporuslignosus)引起的硬孔菌病害；
由下述病原体引起的花和种子的病害：例如，葡萄孢属(botrytis)菌种，例如灰葡萄孢(botrytiscinerea)；
由下述病原体引起的植物块茎的病害：例如，丝核菌属(rhizoctonia)菌种，例如立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)；长蠕孢菌属(helminthosporium)菌种，例如茄病长蠕孢(helminthosporiumsolani)；
由下述病原体引起的根肿病：例如，根肿菌属(plasmodiophora)菌种，例如甘蓝根肿菌(plamodiophorabrassicae)；
由下述细菌病原体引起的病害：例如，黄单胞菌属(xanthomonas)菌种，例如稻黄单胞菌白叶枯变种(xanthomonascampestrispv.oryzae)；假单胞菌属(pseudomonas)菌种，例如丁香假单胞菌黄瓜致病变种(pseudomonassyringaepv.lachrymans)；欧文氏菌属(erwinia)菌种，例如噬淀粉欧文氏菌(erwiniaamylovora)。
优选防治下列大豆病害：
由下述病原体所致的叶、茎、荚和种子的真菌类病害：例如，轮纹叶斑病(alternarialeafspot)(alternariaspec.atranstenuissima)、炭疽病(anthracnose)(colletotrichumgloeosporoidesdematiumvar.truncatum)、褐斑病(brownspot)(大豆壳针孢(septoriaglycines))、桃叶穿孔病和叶枯病(菊池尾孢(cercosporakikuchii))、笄霉叶枯病(漏斗笄霉(choanephorainfundibuliferatrispora(同义词)))、叶斑病(dactuliophoraleafspot)(dactuliophoraglycines)、大豆霜霉病(downymildew)(东北霜霉(peronosporamanshurica))、内脐蠕孢枯萎病(drechsleraglycini)、蛙眼病(frogeyeleafspot)(大豆尾孢(cercosporasojina))、菜豆叶斑病(leptosphaerulinaleafspot)(三叶草小光壳(leptosphaerulinatrifolii))、叶点霉叶斑病(phyllosticaleafspot)(大豆生叶点霉(phyllostictasojaecola))、荚和茎枯萎病(大豆拟茎点霉(phomopsissojae))、白粉病(microsphaeradiffusa)、棘壳孢叶斑病(pyrenochaetaleafspot)(pyrenochaetaglycines)、丝核菌地上部分(rhizoctoniaaerial)、叶枯病和立枯病(foliageandwebblight)(立枯丝核菌(rhizoctoniasolani))、锈病(豆薯层锈菌(phakopsorapachyrhizi))、山马蝗层锈菌(phakopsorameibomiae))、黑星病(scab)(大豆痂圆孢(sphacelomaglycines))；匍柄霉叶枯病(匍柄霉(stemphyliumbotryosum))；靶斑病(targetspot)(山扁豆生棒孢(corynesporacassiicola))。
由下述病原体引起的位于根部和茎基部的真菌类病害：例如，黑色根腐病(blackrootrot)(野百合丽赤壳菌(calonectriacrotalariae))、炭腐病(菜豆生壳球孢(macrophominaphaseolina))、镰孢枯萎病或萎蔫、根腐以及荚和根颈腐烂病(尖镰孢(fusariumoxysporum)、直喙镰孢(fusariumorthoceras)、半裸镰孢(fusariumsemitectum)、木贼镰孢(fusariumequiseti))、mycoleptodiscus根腐病(mycoleptodiscusterrestris)、新赤壳属病(neocosmospora)(侵菅新赤壳(neocosmopsporavasinfecta))、荚和茎疫病(podandstemblight)(菜豆间座壳(diaporthephaseolorum))、茎溃疡(大豆北方茎溃疡病菌(diaporthephaseolorumvar.caulivora))、疫霉腐病(大雄疫霉(phytophthoramegasperma))、褐茎腐病(大豆茎褐腐病菌(phialophoragregata))、腐霉病(pythiumrot)(瓜果腐霉(pythiumaphanidermatum))、畸雌腐霉(pythiumirregulare)、德巴利腐霉(pythiumdebaryanum)、群结腐霉(pythiummyriotylum)、终极腐霉(pythiumultimum))、丝核菌根腐病、茎腐(stemdecay)和立枯病(立枯丝核菌(rhizoctoniasolani))、核盘菌茎腐病(sclerotiniastemdecay)(核盘菌(sclerotiniasclerotiorum))、核盘菌白绢病(sclerotiniasouthernblight)(sclerotiniarolfsii)、根串珠霉根腐病(thielaviopsisrootrot)(根串珠霉(thielaviopsisbasicola))。
本发明的组合物可用于治疗性地或保护性/预防性地防治植物病原性真菌。因此，本发明还涉及通过使用本发明的组合物——其施用至种子、植物或植物部分、果实或植物生长于其中的土壤——防治植物病原性真菌的治疗性和保护性方法。
所述组合物在防治植物病害所需的浓度下被植物良好地耐受，这一事实允许处理植物的地上部位、繁殖材料和种子，以及土壤。
根据本发明，可处理所有植物和植物部分。植物是指所有植物和植物种群，例如需要和不需要的野生植物、栽培种和植物变种(不论是否受植物品种或植物育种者权利的保护)。栽培种和植物变种可以是通过传统的繁殖和育种方法(其可由一种或多种生物技术方法如通过使用双单倍体、原生质体融合、随机和定点突变、分子或遗传标记物辅助或补充)或通过生物工程与基因工程方法获得的植物。植物部分是指植物的所有地上和地下部分和植物器官如芽、叶、花和根，可列举的实例为叶、针叶、茎、干、花、子实体、果实和种子，以及根、块茎和根茎。作物以及无性繁殖和有性繁殖物，例如插枝、球茎、根茎、分檗和种子也属于植物部分。
当本发明的组合物具有良好的植物耐受性、具有有利的温血动物毒性，以及良好的环境相容性时，适用于保护植物和植物器官，提高采收产量，改善采收材料的质量。它们可被优选用作作物保护组合物。它们对通常敏感和抗性物种以及全部或一些发育阶段具有活性。
可依照本发明处理的植物包括以下主要作物植物：玉米、大豆、紫花苜蓿、棉花、向日葵、芸苔油籽如甘蓝型油菜(如加拿大油菜、油菜籽)、芸苔(brassicarapa)、芥菜型油菜(b.juncea)(如(田野)芥菜)和伊索比亚芥菜(brassicacarinata)、棕榈科属种(arecaceaesp.)(例如油棕、椰子)、稻、小麦、甜菜、甘蔗、燕麦、黑麦、大麦、粟和高粱、黑小麦、亚麻、坚果、葡萄和藤本植物以及来自多种植物分类群的果实和蔬菜，例如蔷薇科属种(rosaceaesp.)(例如仁果，如苹果和梨；以及核果，如杏、樱桃、扁桃、李子和桃；和浆果，如草莓、树莓、黑茶藨子和红茶藨子以及醋栗)、茶藨子科属种(ribesioidaesp.)、胡桃科属种(juglandaceaesp.)、桦木科属种(betulaceaesp.)、漆树科属种(anacardiaceaesp.)、壳斗科属种(fagaceaesp.)、桑科属种(moraceaesp.)、木犀科属种(oleaceaesp.)(如橄榄树)、猕猴桃科属种(actinidaceaesp.)、樟科属种(lauraceaesp.)(例如鳄梨、肉桂、樟脑)、芭蕉科属种(musaceaesp.)(例如香蕉树和香蕉种植园)、茜草科属种(rubiaceaesp.)(例如咖啡)、山茶科属种(theaceaesp.)(例如茶树)、梧桐科属种(sterculiceaesp.)、芸香科属种(rutaceaesp.)(例如柠檬、橙子、柑橘和葡萄柚)、茄科属种(solanaceaesp.)(例如番茄、马铃薯、胡椒、辣椒、茄子和烟草)、百合科属种(liliaceaesp.)、菊科属种(compositiaesp.)(例如莴苣、洋蓟和菊苣--包括根菊苣、苦苣或普通菊苣)、伞形科属种(umbelliferaesp.)(例如胡萝卜、西芹、芹菜和块根芹)、葫芦科属种(cucurbitaceaesp.)(例如黄瓜--包括小黄瓜、南瓜、西瓜、葫芦类和甜瓜类)、葱科属种(alliaceaesp.)(例如韭葱类和洋葱类)、十字花科属种(cruciferaesp.)(例如白球甘蓝、红球甘蓝、椰菜、花椰菜、抱子甘蓝、小白菜、球茎甘蓝、萝卜、辣根、水芹和大白菜)、豆科属种(leguminosaesp.)(例如花生、豌豆类、扁豆类和豆类--如菜豆(commonbeans)和蚕豆(broadbeans))、藜科属种(chenopodiaceaesp.)(例如瑞士甜菜(swisschard)、饲用甜菜、菠菜、甜菜根)、亚麻科属种(linaceaesp.)(如大麻)、大麻科属种(cannabeaceasp.)(例如大麻)、锦葵科属种(malvaceaesp.)(例如黄秋葵、可可)、罂粟科属种(papaveraceae)(例如罂粟)、天门冬科(asparagaceae)(例如芦笋)；园艺和森林中的有用植物和观赏植物，如草皮、草地、草坪和甜叶菊(steviarebaudiana)；以及所述植物各自的转基因品种。
根据植物种或植物栽培种、其位置和生长条件(土壤、气候、生长期、营养(diet))，使用或施用本发明的组合物，本发明的处理还可产生超加性(“协同”)效应。因此，例如通过在本发明的处理中使用或施用本发明的组合物可获得如下超过实际预期的效果：降低施用率和/或拓宽活性谱和/或提高活性、改善植物生长，增强对高温或低温的耐受性、增强对干旱或水或土壤盐含量的耐受性、提高开花品质、使采收更简易、加速成熟、提高采收量、使果实更大、使植物更高、使叶色更绿、使开花更早、提高采收产品的品质和/或提高其营养价值、提高果实内的糖浓度、改善采收产品的贮存稳定性和/或其加工性。
在本发明的处理中，本发明的组合物在一定的施用率下还可对植物具有强化作用。植物抵抗不想要的植物致病性真菌和/或微生物和/或病毒攻击的防御体系被调动起来。在本文中，植物强化(抗性诱导)物质应理解为意指能够以这样一种方式刺激植物防御体系的那些物质或物质的组合，即当随后用不想要的植物致病性真菌和/或微生物和/或病毒接种时，经处理的植物对这些植物致病性真菌和/或微生物和/或病毒表现出很大程度的抗性。因此，通过在本发明的处理中使用或利用本发明的组合物，可在处理后的一定时期内保护植物免受上述病原体的攻击。产生保护作用的时间段通常为在用活性化合物处理植物之后的1至10天，优选1至7天。
还优选根据本发明进行处理的植物和植物栽培种对一种或多种生物胁迫具有抗性，即所述植物对动物和微生物有害物(例如对线虫、昆虫、螨虫、植物病原性真菌、细菌、病毒和/或类病毒)表现出更好的防御。
还可根据本发明进行处理的植物和植物栽培种是对一种或多种非生物胁迫具有抗性的那些植物，即已经在胁迫耐受性方面表现出提高的植物健康的植物。非生物胁迫条件可包括，例如干旱、低温暴露、热暴露、渗透胁迫、水涝、增加的土壤含盐量、增加的矿物质暴露、臭氧暴露、强光暴露、有限的氮营养素利用度、有限的磷营养素利用度、避荫。优选地，用本发明的组合物对这些植物和栽培种的处理还提高了植物整体健康(参见上文)。
还可根据本发明进行处理的植物和植物栽培种是以增强的产量特性为特征的那些植物，即在此特性方面表现出提高的植物健康的植物。所述植物中提高的产量可以是以下因素的结果：例如，改进的植物生理机能、生长和发育，如水利用效率、水保持效率；改善的氮利用；增强的碳同化作用；改善的光合作用；提高的发芽率和加速的成熟。
产量还可受到改进的植物结构(plantarchitecture)的影响(在胁迫和非胁迫条件下)，包括但不限于，提早开花、对杂种制种的开花控制、幼苗活力、植物大小、节间数和节间距、根部生长、种子大小、果实大小、荚果大小、荚果数或穗数、每个荚果或穗的种子数、种子质量、提高的种子饱满度、减少的种子散布、减少的荚开裂以及抗倒伏性。其他产量特征包括种子组成，如碳水化合物含量、蛋白质含量、油含量和组成、营养价值、抗营养化合物的减少、改善的加工性和更好的储存稳定性。优选地，用本发明的组合物对这些植物和栽培种进行处理还提高了植物的整体健康(参见上文)。
可根据本发明进行处理的植物为已表达出杂种优势或杂种活力特征的杂种植物，所述特征通常导致更高的产量、活力、健康度以及对生物和非生物胁迫因素的抗性。这类植物通常由一种自交雄性不育亲本系(母本)与另一种自交雄性能育亲本系(父本)杂交而制得。杂种种子通常从雄性不育植株中采收并售给种植者。雄性不育植株有时(例如在玉米中)可通过去雄(即，机械地除去雄性繁殖器官(或雄花))制得，但是，更通常地，雄性不育是由植物基因组中的遗传决定子导致的。在这种情况下，尤其是当种子是待从杂种植物上采收的所需产品时，确保杂种植物中的雄性能育性的完全恢复通常是有用的。这可通过确保父本具有适当的育性恢复基因来实现，该基因能够恢复含有造成雄性不育的遗传决定子的杂种植物的雄性能育性。雄性不育的遗传决定子可位于细胞质中。细胞质雄性不育(cms)的实例例如在芸苔属种中有描述。然而，雄性不育的遗传决定子也可位于细胞核基因组中。雄性不育植物也可通过植物生物技术方法如基因工程而获得。一种获得雄性不育植物的特别有用的方法记载于wo89/10396中，其中，例如核糖核酸酶(如芽孢杆菌rna酶)在雄蕊的绒毡层细胞中选择性地表达。随后可以通过在绒毡层细胞中表达核糖核酸酶抑制因子如芽孢杆菌rna酶抑制因子来恢复能育性。
可根据本发明进行处理的植物或植物栽培种(通过植物生物技术方法如基因工程而获得)是除草剂耐受性植物，即对一种或多种给定除草剂具有耐受性的植物。这类植物可通过遗传转化或通过选择含有赋予所述除草剂耐受性的突变的植物而获得。
实施例
实施例1：用于多种活性成分的结合物的功效的公式
当活性成分结合物的活性超过活性成分单独施用时的活性的总和时，存在活性成分的协同效应。给定的两种活性成分的结合物的预期活性可如下计算(参见colby,s.r.，“calculatingsynergisticandantagonisticresponsesofherbicidecombinations，”weeds1967，15，20-22)：
如果
x为以mppm(或g/ha)的施用率施用活性成分a时的功效，
y为以nppm(或g/ha)的施用率施用活性成分b时的功效，
e为分别以m和nppm(或g/ha)的施用率施用活性成分a和b时的功效，
那么
如果实际的活性超过计算值，则所述结合物的活性具有超加性，即存在协同效应。在这种情况下，实际观察到的功效一定大于由上述公式计算的预期功效(e)值。
例如，所述公式和分析可用于植物生长促进的评估。在施用于植物后数天评估这样的测定。100％意指相当于未经处理的对照植物的重量的植物重量。在这种情况下，功效意指与未经处理的对照的重量相比，额外的植物重量％。例如，与未经处理的对照植物相比，产生植物重量为120％的处理的功效为20％。如果结合物的植物生长促进作用(即，对于用结合物处理的植物的植物重量％，所观察到的功效)超过计算值，则结合物的活性是超加性的，即存在协同效应。
所述公式和分析还可用于在病害防治测定中评估协同作用。功效的程度以％表示。0％意指相当于对照的功效，而100％的功效意指未观察到病害。
如果实际的杀虫或杀真菌活性超过计算值，则所述结合物的活性具有超加性，即存在协同效应。在这种情况下，实际观察到的功效一定大于由上述公式计算的预期功效(e)值。
证实协同效应的另一种方式是tammes法(参见“isoboles，agraphicrepresentationofsynergisminpesticides”neth.j.plantpath.，1964，70，73-80)。
实施例2：使用肟菌酯和重组苏云金芽孢杆菌细胞促进植物生长
进行实验以分析肟菌酯与表达内切葡聚糖酶的重组苏云金芽孢杆菌细胞(“bee”)的发酵产物的结合物的功效。在25-28℃和50％湿度的植物生长室中，使玉米种子在轻型架(lightracks)上的小型三英寸方盆中的合成介质和沙子的无菌混合物中生长约14天。在每盆中种植两粒种子。在种植时，每个盆中的生长介质都用下述处理剂浸透。14天后，测量植株的整个植株生物量。在下表中，utc是指未经处理的对照。“计算值”是指使用上述colby方程计算的预期效果，“功效”是指所观察到的实际效果。
将含有肟菌酯作为其活性成分(22％肟菌酯)的
如下生成在其孢子外壁上表达内切葡聚糖酶的重组蜡样芽孢杆菌家族成员(苏云金芽孢杆菌bt013a)(bee)。为了产生用于在蜡样芽孢杆菌家族成员中表达融合蛋白的质粒，产生pcr片段，所述pcr片段编码bcla启动子(seqidno:85)、甲硫氨酸起始密码子和bcla(seqidno:1)的氨基酸20-35，接着是六个丙氨酸接头序列——其在框中融合至苏云金芽孢杆菌bt013a内切葡聚糖酶(seqidno:107)。将这些pcr片段用xhoi消化并连接到psuper质粒的sali位点以产生质粒psuper-bcla20-35-内切葡聚糖酶。psuper质粒通过将puc57质粒(含有氨苄青霉素抗性盒)与来自芽孢杆菌属的pbc16-1质粒(含有四环素抗性)融合而产生。这种5.5kbp质粒可以在大肠杆菌和芽孢杆菌属种中复制。将psuper-bcla20-35-磷脂酶质粒转化到dam甲基化酶阴性大肠杆菌菌株中并在其中增殖，最后转化到苏云金芽孢杆菌bt013a中。
为了获得bee的全发酵液培养物，用bee接种含有脑心浸液培养基(bhi)的15ml锥形瓶，并使其在约30℃下生长7-8小时，振动器设定为300rpm。第二天，将取自各烧瓶的250μl等分试样接种到含有50ml基于酵母提取物的培养基的250ml烧瓶中，并使其在约30℃下生长。孵育约2天后，当孢子形成完成至少95％时，收集培养液并计算菌落形成单位。将发酵液在50ml水中稀释至5％，并将以下菌落形成单位施用于每个盆。
实验结果示于下表3中。
表3
当将肟菌酯与bee组合时，结果显示出超加性的植物产量效果。
实施例3：使用异噻菌胺和重组苏云金芽孢杆菌细胞促进植物生长
在20℃和70％湿度的温室中，使玉米种子在壤质砂土中生长约11天。处理后约11天，将土壤以上的幼苗切断并测定鲜重。
以约50μg/种子施用表达由seqidno:107编码的内切葡聚糖酶或由seqidno:108编码的磷脂酶c并且如上所述制备的重组苏云金芽孢杆菌细胞。还以约250μg/种子施用异噻菌胺。
可预期，用与异噻菌胺组合的重组苏云金芽孢杆菌处理的玉米植物具有超过基于用两种活性成分单独处理的玉米植物的芽重％的计算值的芽重％，即观察到协同效应。
序列表
<110>拜耳作物科学有限合伙公司
<120>包含重组芽孢杆菌属（bacillus）细胞和杀真菌剂的组合物
<130>bcs149058wo
<150>us62/051,915
<151>2014-09-17
<160>109
<170>patentin版本3.5
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<211>41
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