本发明属于植物细胞培养基技术领域，具体涉及一种适用于铁皮石斛细胞培养的培养基及其制备方法。
背景技术：
铁皮石斛是珍稀名贵中药材，素有“千金草”、“植物黄金”、“健康软黄金”之称，因其药效如神、极其稀少、生存环境特殊和极佳的滋补功效，而名列“中华九大仙草”之首，被国际药用植物界称为“药界大熊猫”。铁皮石斛的主要成分是多糖和生物碱，还富含氨基酸，其中包括7种人体必需氨基酸(除色氨酸外)和3种人体必须氨基酸，还含有丰富的微量元素，尤以Se(硒)和Fe(铁)的含量较高。现代临床应用和药理研究证实：铁皮石斛对咽喉疾病、肠胃疾病、白内障、心血管疾病、糖尿病及抑制肿瘤生长具有显著疗效；对增强免疫力、扩张血管、抗血小板凝集、提高肌体免疫机能有极好的效果。同时，还具有抗衰老、刺激唾液分泌、抗疲劳、耐缺氧、养颜美发、明目强身等作用。特别是滋阴润肺、养胃生津、健脑明目、补五脏之虚劳；对烟酒过度、劳累过度、夜生活过度、用眼用脑过度、声带嘶哑等有特殊疗效；对人的肺癌细胞、萎缩性胃炎、糖尿病有极大的抑制作用。对于我国上千万咽喉炎、气管炎、肺癌患者和4000多万糖尿病患者，1千多万教师队伍，3亿多烟民来说是极好的防病、治病、保健良药。石斛对抗氧化和延缓衰老也有显著作用，能显著提高SOD的水平，使LPO显著下降，并能有效地降低血糖，为众多糖尿病患者开辟了一条天然全新的治疗途径，受到医学界的重视。
中国专利申请CN103875533A公开了一种铁皮石斛体细胞胚增殖保存的方法及培养基，包括以下步骤：1)外植体的消毒；2)原球茎的诱导培养；3)体细胞胚的诱导；4)体细胞胚的增殖保存培养；5)体细胞胚的恢复生长与增殖培养；6)体细胞胚的萌发；7)试管苗的壮苗生根培养，所述培养基的配方是：MS基本培养基，6-苄氨基腺嘌呤0.5～1.5mg/L，6-糖基氨基嘌呤0.2～0.8mg/L，萘乙酸0.2～0.6mg/L，水解酪蛋白0.4～0.8g/L，活性炭0.3～0.6g/L，蔗糖2～4％，琼脂粉6～7g/L。
中国专利申请CN105123513A公开了一种铁皮石斛厌氧发酵残留物培养基，所述培养基由下列质量百分比的原料组成：厌氧发酵残留物5～30％，MS基本培养基10～40％，1/2MS基本培养10～40％，蔗糖2～3％，香蕉5～10％，洋芋5～10％，琼脂粉0.35～0.5％，生长素1.5×10-5～1×10-4％，细胞分裂素2×10-5～2×10-4％，活性炭0.2～0.4％，余量为蒸馏水，厌氧发酵残留物含有丰富的氮、磷、钾、钙、铜、铁、镁、锰和锌等营养元素以及氨基酸类、水解酶类、B族维生素和激素等。
铁皮石斛因具有独特而神奇的功效，在国内外市场供不应求。长期以来，人们用此药都是依靠采挖收集野生资源。高额利润的诱惑，使野生铁皮石斛成为世界珍稀濒危植物，受到国家的重视和保护。石斛是目前《中华人民共和国药典》记载中药材涉及植物来源最为众多、应用最为广泛、使用最为频繁的一种极为珍稀名贵的中药材。因此，研制出一种适用于铁皮石斛细胞培养的培养基，使铁皮石斛得以延续迫在眉睫。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种适用于铁皮石斛细胞培养的培养基及其制备方法。本发明提供的适用于铁皮石斛细胞培养的培养基，能够实现铁皮石斛的大规模细胞培养，能够使细胞培养和育苗实现规模化工厂生产，可明显缩短铁皮石斛的生长繁殖周期，更宜于后期的有效成分提取等工业生产步骤，对解决铁皮石斛资源短缺问题具有重大意义。
本发明的技术方案是：
一种适用于铁皮石斛细胞培养的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：盐酸硫胺素0.02-0.08mg/L，麦芽糖15-22g/L，活性炭0.04-0.08g/L，氯化镁5-10mM，谷胱甘肽13-21μg/L，水杨酸15-25mg/L，腺嘌呤1-3mg/L，玉米素3-7mg/L，葛根素32-45μg/L，苯丙氨酸60-70mg/L和硫酸铵0.5-1.2μM。
一种适用于铁皮石斛细胞培养的培养基，优选的方案是，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：盐酸硫胺素0.05mg/L，麦芽糖18g/L，活性炭0.06g/L，氯化镁7mM，谷胱甘肽17μg/L，水杨酸22mg/L，腺嘌呤2mg/L，玉米素4mg/L，葛根素36μg/L，苯丙氨酸64mg/L和硫酸铵0.8μM。
优选地，所述基础培养基为White培养基或B5培养基。
另外，本发明还提供了所述适用于铁皮石斛细胞培养的培养基的制备方法，步骤如下：
S1向基础培养基中加入盐酸硫胺素、谷胱甘肽、腺嘌呤、玉米素和葛根素，搅拌20-30分钟，加入麦芽糖、活性炭、氯化镁、水杨酸、苯丙氨酸和硫酸铵，继续搅拌15-21分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至5.7-6.1，灭菌温度为115-120℃，灭菌时间为30分钟，即得。
优选地，所述步骤S1搅拌26分钟。
优选地，所述步骤S1继续搅拌17分钟。
优选地，所述步骤S2调节步骤S1所得混合物的pH至5.9。
优选地，所述步骤S2灭菌温度为118℃。
本发明所用主要原料的作用：
盐酸硫胺素：盐酸硫胺素又称维生素B1盐酸盐、3-[(4-氨基-2-甲基吡啶-5-基)甲基]-5-(2-羟乙基)-4-甲基噻唑氯化鎓合单盐酸。白色至浅黄色单斜晶系片状结晶(α型)，或斜方晶系针状结晶(β型)。相对分子质量337.28。无嗅或有米糠气味，有苦味，分解温度248℃。不溶于乙醚、乙烷、氯仿和苯，溶于水、丙二醇、95％乙醇、100％乙醇。有一定的吸湿性，曝露在湿空气中，可吸收一定量的水，而成为水合物。用途：用作营养增补剂。
活性炭：活性炭可以降低组织培养物的有害代谢物浓度，对细胞生长有利。活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉末结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糖醛及激素等。
谷胱甘肽：谷胱甘肽(分子式C10H17O6N3S)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合，含有巯基的的三肽，具有抗氧化作用和解毒作用。谷胱甘肽在生命体内的作用机理和四大生理功能：1、清除人体细胞内的自由基，是细胞内最主要的抗氧化剂。2、与人体内的有毒物质结合并排出体外，是人体内重要的解毒剂。3、激活和保护免疫细胞，增强人体免疫功能，是重要的免疫增强剂。4、影响皮肤细胞酪氨酸酶活性、抑制黑色素生成，防止皮肤色斑的产生。
腺嘌呤：腺嘌呤分子式：C5H5N5，分子量：135.127，其性状为：白色针状结晶。220℃开始升华，360-365℃分解。溶于酸和碱，微溶于醇，不溶于醚及氯仿。主要用于参加DNA和RNA的合成，用于放射治疗、苯中毒和抗肿瘤等引起的白细胞减少症，用于急性粒细胞减少症，医药及生化研究。
玉米素：中文名：6-反式-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基氨基嘌呤。CAS号：1637-39-4，分子式：C10H13N5O，分子量：219.24。玉米素是白色结晶或粉末，溶于水，溶于醇和DMF。玉米素是一种天然的细胞分裂素。它是从甜玉米灌浆期的籽粒中提取并结晶出的第1个天然细胞分裂素。
葛根素：葛根素存在于豆科植物野葛的根中。CAS号：3681-99-0。分子式：C21H20O9，分子量：416.38。药理作用：具有提高免疫，增强心肌收缩力，保护心肌细胞，降低血压，抗血小板聚集等作用。
本发明提供的适用于铁皮石斛细胞培养的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，添加的添加剂包括盐酸硫胺素、麦芽糖、活性炭、氯化镁和葛根素等。在本发明的各种培养基的成分中，基础培养基能够提供铁皮石斛细胞的生存和最低的生理活动。在本发明培养基中使用的盐酸硫胺素，是所有细胞和组织必需的基本维生素，在培养基中加入盐酸硫胺素，有利于铁皮石斛的发育。在本发明培养基中使用的谷胱甘肽，能够诱导细胞的增殖，避免过氧化物对铁皮石斛细胞的损害。在本发明培养基中使用的腺嘌呤，对铁皮石斛细胞的分裂起促进作用。在本发明培养基中使用的玉米素，能够促进铁皮石斛细胞的分裂，促进芽的分化，促进细胞扩大，促进侧芽发育，消除顶端优势，延缓叶片衰老，打破种子休眠。在本发明培养基中使用的活性炭，能够吸附铁皮石斛细胞生长中代谢的有毒物质，但是，活性炭在吸附培养基中的有害物质的同时，也能吸附生长调节物质和其它培养基中的成分，发明人在使用活性炭时，考虑到活性炭的两面性，经大量实验，得到合适的活性炭与培养基中生长调节物质的配比，使其都能更好的发挥作用。发明人意外发现，在本发明培养基中使用葛根素，能够与其它物质相互作用，促进细胞增殖。本发明适用于铁皮石斛细胞培养的培养基搭配合理，各成分间协同作用，能提供铁皮石斛细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境，促进铁皮石斛细胞的增殖。
与现有技术相比，本发明提供的适用于铁皮石斛细胞培养的培养基具有以下优势：
(1)本发明提供的适用于铁皮石斛细胞培养的培养基能够实现铁皮石斛的大规模细胞培养，能够使细胞培养和育苗实现规模化工厂生产。
(2)本发明提供的适用于铁皮石斛细胞培养的培养基，可明显缩短铁皮石斛的生长繁殖周期，更宜于后期的有效成分提取等工业生产步骤，对解决铁皮石斛资源短缺问题具有重大意义。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明White培养基可购自青岛海博生物技术有限公司；B5培养基可购自青岛海博生物技术有限公司；葛根素可购自南京广润生物制品有限公司。
实施例1、一种适用于铁皮石斛细胞培养的培养基
所述适用于铁皮石斛细胞培养的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：盐酸硫胺素0.02mg/L，麦芽糖15g/L，活性炭0.04g/L，氯化镁5mM，谷胱甘肽13μg/L，水杨酸15mg/L，腺嘌呤1mg/L，玉米素3mg/L，葛根素32μg/L，苯丙氨酸60mg/L和硫酸铵0.5μM。
所述基础培养基为White培养基。
制备方法：
S1向基础培养基中加入盐酸硫胺素、谷胱甘肽、腺嘌呤、玉米素和葛根素，搅拌20分钟，加入麦芽糖、活性炭、氯化镁、水杨酸、苯丙氨酸和硫酸铵，继续搅拌15分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至5.7，115℃灭菌温度为，灭菌时间为30分钟，即得。
实施例2、一种适用于铁皮石斛细胞培养的培养基
所述适用于铁皮石斛细胞培养的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：盐酸硫胺素0.08mg/L，麦芽糖22g/L，活性炭0.08g/L，氯化镁10mM，谷胱甘肽21μg/L，水杨酸25mg/L，腺嘌呤3mg/L，玉米素7mg/L，葛根素45μg/L，苯丙氨酸70mg/L和硫酸铵1.2μM。
所述基础培养基为B5培养基。
制备方法：
S1向基础培养基中加入盐酸硫胺素、谷胱甘肽、腺嘌呤、玉米素和葛根素，搅拌30分钟，加入麦芽糖、活性炭、氯化镁、水杨酸、苯丙氨酸和硫酸铵，继续搅拌21分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至6.1，120℃灭菌温度为，灭菌时间为30分钟，即得。
实施例3、一种适用于铁皮石斛细胞培养的培养基
所述适用于铁皮石斛细胞培养的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：盐酸硫胺素0.05mg/L，麦芽糖18g/L，活性炭0.06g/L，氯化镁7mM，谷胱甘肽17μg/L，水杨酸22mg/L，腺嘌呤2mg/L，玉米素4mg/L，葛根素36μg/L，苯丙氨酸64mg/L和硫酸铵0.8μM。
所述基础培养基为B5培养基。
制备方法：
S1向基础培养基中加入盐酸硫胺素、谷胱甘肽、腺嘌呤、玉米素和葛根素，搅拌26分钟，加入麦芽糖、活性炭、氯化镁、水杨酸、苯丙氨酸和硫酸铵，继续搅拌17分钟，得混合物；
S2调节步骤S1所得混合物的pH至5.9，118℃灭菌温度为，灭菌时间为30分钟，即得。
对比例1、一种适用于铁皮石斛细胞培养的培养基
所述适用于铁皮石斛细胞培养的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：盐酸硫胺素0.05mg/L，麦芽糖18g/L，活性炭0.06g/L，氯化镁7mM，谷胱甘肽17μg/L，水杨酸22mg/L，腺嘌呤2mg/L，玉米素4mg/L，槲皮素36μg/L，苯丙氨酸64mg/L和硫酸铵0.8μM。
所述基础培养基为B5培养基。
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，将葛根素替换为槲皮素。
对比例2、一种适用于铁皮石斛细胞培养的培养基
所述适用于铁皮石斛细胞培养的培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：盐酸硫胺素0.05mg/L，麦芽糖18g/L，活性炭0.032g/L，氯化镁7mM，谷胱甘肽17μg/L，水杨酸22mg/L，腺嘌呤2mg/L，玉米素0.032g/L，葛根素36μg/L，苯丙氨酸64mg/L和硫酸铵0.8μM。
所述基础培养基为B5培养基。
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，将活性炭和玉米素的终浓度均调整为0.032g/L。
试验例一、本发明适用于铁皮石斛细胞培养的培养基对铁皮石斛细胞的培养效果
1、试验对象：本发明实施例1-3所得适用于铁皮石斛细胞培养的培养基，以及对比例1和对比例2所得适用于铁皮石斛细胞培养的培养基。
2、试验方法：
用移液器移取3mL铁皮石斛单细胞悬浮液，分别注入实施例1-3所得适用于铁皮石斛细胞培养的培养基，以及对比例1和对比例2所得适用于铁皮石斛细胞培养的培养基中，将已接种的三角瓶置于25℃，150r/min的恒温摇床中进行黑暗培养。不同培养基对铁皮石斛细胞的细胞增殖结果如表1所示。
表1：不同培养基对铁皮石斛细胞的细胞增殖结果
由表1可以看出，在相同的培养时间内，生长在本发明实施例1-3所得适用于铁皮石斛细胞培养的培养基中铁皮石斛细胞的细胞数，明显大于生长在对比例1和对比例2所得适用于铁皮石斛细胞培养的培养基中铁皮石斛细胞的细胞数。这说明，本发明适用于铁皮石斛细胞培养的培养基可以明显促进铁皮石斛细胞的增殖，本发明适用于铁皮石斛细胞培养的培养基的扩增效果好。