专利名称：固定化扩展青霉脂肪酶催化合成糖苷酯类化合物的方法
技术领域：
本发明属于酶化工领域，特别涉及一种利用固定化扩展青霉脂肪酶催化 糖苷酰化合成糖苷酯类化合物的方法。
背景技术：
糖苷广泛存在于生物体内，其中很多糖苷因具有特殊的生物活性而担负 着重要的生物功能。许多糖苷化合物，如天麻苷、熊果苷、葡萄糖豆腐果苷、
高熊果苷、异高熊果苷、水杨醛-^-D-葡萄糖苷等，由于具有特定的药用价 值(例如抗肿瘤、抗微生物、降血脂、抗氧化、提高机体免疫功能、镇静安 眠等)而引起了人们的关注。糖苷化合物是一类活泼的化合物，结构上存在 着多个羟基，可以与其它不同结构的化合物相连接，当糖环的羟基连接上脂 肪族或芳香族酰基时，可以增强化合物的脂溶性，从而改善其在细胞和肠内 的吸收，提高其口服生物利用度，增强药效。因此，对该类化合物的合成及 修饰则成为糖苷类药物的一个主要研究方向。熊果苷除了具有抗菌、镇咳、 降血糖等多种药理作用外，还是人黑色素细胞中酪氨酸酶的抑制剂，能阻断 多巴以及多巴醌的合成，从而有效地抑制黑色素的生成，具有美白作用，且 对皮肤没有刺激性，毒副作用小。然而在使用过程中，熊果苷存在脂溶性差、 生物利用度低等问题。药理活性研究表明，熊果苷的碳十一烯酸和月桂酸酯 衍生物均比亲代化合物表现出更高的抗酪氨酸酶和抗亚油酸氧化活性。
糖苷类化合物糖环上羟基众多，且反应活性相似。采用一般化学方法直接 酯化时，区域选择性低，易产生大量的副产物，产物分离困难；为合成确定 位置酰化的产物，需要对糖环特定羟基进行保护和去保护等操作，反应步骤 多、工艺复杂；同时该方法采用碱性催化剂，易产生含碱废液，对环境造成 严重污染。而酶法合成避免了繁琐的保护和去保护等复杂的反应步骤，反应 条件温和、对环境友好，所得产物纯度高。因此，酶催化糖苷区域选择性酰 化是一条具有广阔前景的替代途径。曾有文献(Tokiwa et al.， Med. Chem. Lett, 2007, 17: 3105-3108; Nakajima et al., J. Biosci. Bioeng. 1997, 87: 105-107; Watanabe et al., Biochem. Eng. J. 2009, 43: 261-265; Chigorimbo-MurefU et al,,J. Mol. Catal. B: Enzym., 2009， 56: 277-282 )公开了酶促熊果苷酯衍生物的 合成方法，但其所用的酶制剂为价格昂贵的商品化蛋白酶或脂肪酶，且催化 效率不高。如利用枯草杆菌蛋白酶催化合成熊果苷碳十一烯酸酯，其反应时 间较长，效率较低；利用来源于南极假丝酵母的脂肪酶催化熊果苷月桂酸酯 和阿魏酸酯的合成，其最大转化率仅为50%;利用来源于洋葱假单胞菌的脂 肪酶催化熊果苷肉桂酸酯的合成，其收率仅为28%。基于不同来源的脂肪酶 之结构与功能的差异，本发明选用价格低廉的固定化扩展青霉脂肪酶制剂催 化糖苷酰化以制备糖苷酯化合物，其不但收率高(85%-98%)，且成本大大 降低。
发明内容
为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种固 定化扩展青霉脂肪酶催化合成糖苷酯类化合物的方法。
本发明的另一目的在于提供上述方法合成的糖苷酯类化合物。
本发明的目的通过下述技术方案实现 一种固定化扩展青霉(尸^^7/^附 ex;^似wm)脂肪酶催化合成糖苷酯类化合物的方法，包括以下操作步骤在 非水介质中，加入摩尔比为l: 1 20: l的酰基供体和糖苷，得到溶液，该
溶液中糖苷的浓度为1 40 mg/mL;加入与糖苷的质量比为10: 1 1: 10 的固定化扩展青霉脂肪酶，在温度为30 60 °C、振荡速度为100 300 rpm 和常压条件下，转酯化反应0.5 72小时，得到糖苷酯类化合物；
所述酰基供体为羧酸乙烯酯、酸酐、羧酸甲酯或羧酸乙酯；
所述糖苷为具有如下通式(II)的化合物
<formula>formula see original document page 5</formula>其中，Ri为氢、羟基、甲氧基、醛基、羟甲基、甲酰基或乙酰基；R: 为氢、甲基或醛基；R3为氢或甲基；所述非水介质为非质子有机溶剂或含低亲核性阴离子的离子液中的一 种或两种。
所述糖苷为熊果苷、天麻苷、葡萄糖豆腐果苷、高熊果苷、异高熊果苷
或水杨醛---D-葡萄糖苷。
所述固定化扩展青霉脂肪酶的制备包括以下操作步骤
(1) 将含有质量百分数为95%淀粉的扩展青霉脂肪酶粗酶粉(购自深
圳绿微康生物工程有限公司)溶于甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中，配制成每毫
升缓冲液含有0.3g脂肪酶粗酶粉的悬浮液，在温度35 t:和转速150 rpm条 件下搅拌1 h;在温度4°C和转速6000 rpm条件下离心得上清液；所述甘氨 酸-氢氧化钠缓冲液中甘氨酸和氢氧化钠的重量比为2.9: 1;
(2) 将大孔吸附树脂(D4020)用质量百分数为95%的乙醇浸泡24 h 后，用去离子水洗至滤液澄清，得到滤液；
(3) 将步骤(2)所得滤液添加到步骤(1)所得上清液中，加酶量为9 g粗酶粉/g树脂；在温度35匸和转速150rpm条件下搅拌4h，用砂芯漏斗 过滤，用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液冲洗，抽滤后冷冻干燥，得到固定化扩展 青霉脂肪酶；将固定化扩展青霉脂肪酶于4 °C冰箱保存备用。
所述非质子有机溶剂为四氢呋喃、丙酮、乙腈、二噁垸、叔丁醇、二甲 基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、吡啶、异丙醚、异辛垸、正己垸、正庚烷、正 辛烷、正壬垸或环己垸；
所述含低亲核性阴离子的离子液中的阴离子为四氟硼酸根离子、六氟磷 酸根离子、二 (三氟甲基磺酰)亚胺离子或氨基酸阴离子；阳离子为1-烷基 -3-甲基咪唑离子、l-烷基-2,3-二甲基咪唑离子、季铵离子、季磷离子、氨基 酸阳离子或N-垸基吡啶离子。
所述非水介质为上述非质子有机溶剂中的两种，两种非质子有机溶剂体 积比为1 19: 1。
所述非水介质为上述非质子有机溶剂中的一种和上述含低亲核性阴离 子的离子液中的一种，其中含低亲核性阴离子的离子液的体积百分含量为 5 95%。
上述方法制备的糖苷酯类化合物，具有如下通式(I ):<formula>formula see original document page 7</formula>
(i)
其中R为2 18个碳原子的烷酰基或9 11个碳原子的不饱和芳香酰 基；R,为氢、羟基、甲氧基、醛基、羟甲基、甲酰基或乙酰基；R2为氢、甲 基或醛基；R3为氢或甲基。
所述烷酰基为直链或支链的饱和或不饱和的垸酰基；所述不饱和芳香酰 基为顺式不饱和芳香酰基或反式不饱和芳香酰基。
本发明相对现有技术，具有如下的优点及有益效果
(1) 采用廉价、高效的生物催化剂——自制固定化扩展青霉脂肪酶催 化糖苷酯衍生物合成。酶促反应选择性高，产物结构易控，因此克服了传统 化学方法选择性低、易生成副产物，或需要保护和脱保护操作及产率低等缺 点；本发明选用价格低廉、来源于扩展青霉的固定化脂肪酶制剂催化糖苷酯 衍生物的合成，与现有的酶催化熊果苷酯衍生物合成的技术相比，具有收率 高(85% 98%)，成本低的优点。
(2) 本发明区域选择性高，产率高、产物纯度高、反应过程简单易控， 产物易分离。
(3) 本发明在温度为30 6(TC、振荡速度为100 300rpm、常压条件 下，利用酶催化制备糖苷酯衍生物，反应条件温和、环境友好。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不 限于此。
实施例l:熊果苷6'-丁酰酯的合成
将熊果苷(109mg, 0.4mmo1)、 丁酸乙烯酯(3 mmol)、 20mL无水四 氢呋喃加入50 mL具塞三角瓶中混匀后，于其中加入1000 mg固定化扩展青 霉脂肪酶，常压下于35'C、 300rpm的恒温振荡器内振荡，利用薄层层析法 (TLC)监控反应。反应1 h后，过滤、真空浓縮滤液、柱层析(石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)-1/4， Rf=0.25)纯化，得白色粉末产物116mg，收率为85%， 纯度大于99%。结构通过13C NMR (100.5 MHz)和& NMR (400 MHz) 确认
13C NMR: S ppm 14.04 (C4")， 18.52 (C3"), 36.02 (C2"), 63.99 (C6'), 70.64 (C4')， 73.79 (C2'), 74.22 (C5'), 76.93 (C3'), 102.05 (Cl')， 116.01 (C3+C5), 118.24 (C2+ C6)， 150.70 (Cl)， 152.91 (C4), 173.17 (Cl")。
& NMR: S ppm 0.88 (t, 3H， H4"), 1.54 (q, 2H, H3"), 2.27 (t， 2H, H2"), 3.29-3.11 (m, 3H， H2'+ H3'+ H4'), 3.51 (t， 1H, H5'), 4.06 (dd， 1H, H6'), 4.33 (d， 1H, H6')， 4.68 (d， 1H， Hl')， 5.14 (d, 1H, OH4'), 5.24 (d, 1H, OH3'), 5.30 (d, 1H， OH2'), 6.65 (d, 2H, H3+ H5)， 6.84 (d, 2H, H2+ H6), 9.01 (s, 1H， OH4)。
实施例2:熊果苷6'-丁酰酯的合成
将熊果苷(218 mg, 0.8 mmol)、 丁酸酐(5.6 mmol)、 20 mL正己烷/四 氢呋喃(1/4, v/v)加入50 mL具塞三角瓶中混匀后，于其中加入900 mg固定 化扩展青霉脂肪酶，常压下于4(TC、 200rpm的恒温振荡器内振荡，利用薄 层层析法(TLC)监控反应。反应10h后，过滤、真空浓縮滤液、柱层析(石 油醚(PE)/乙酸乙酯(EA一1/4， 纯化，得白色粉末产物230 mg，收
率为84%，纯度大于99%。结构通过13C NMR (100.5 MHz)和& NMR (400 MHz)确认
13C NMR: S ppm 14.04 (C4"), 18.52 (C3"), 36.02 (C2")， 63.99 (C6')， 70.64 (C4'), 73.79 (C2')， 74.22 (C5'), 76.93 (C3')， 102.05 (Cl')， 116.01 (C3+C5), 118.24 (C2+C6)， 150.70 (Cl), 152.91 (C4)， 173.17 (Cl")。
& NMR: S ppm 0.88 (t， 3H, H4"), 1.54 (q， 2H, H3")， 2.27 (t， 2H, H2"), 3.29-3.11 (m, 3H, H2'+ H3'十H4'), 3.51 (t， 1H, H5'),楊(dd, 1H, H6'), 4.33 (d, 眠H6')， 4.68 (d, 1H， Hl'), 5.14 (d, 1H, OH4'), 5.24 (d, 1H, OH3')， 5.30 (d, 1H， OH2'), 6.65 (d, 2H, H3+ H5), 6.84 (d, 2H, H2+ H6), 9.01 (s, 1H, OH4)。
实施例3:熊果苷6'-己酸酯的合成
将熊果苷(20mg,0.07mmo1)、己酸乙烯酯(0.5 mmol)、 20mL异丙醚 /四氢呋喃(l/19,v/v)加入50mL具塞三角瓶中混匀后，于其中加入10mg固定 化扩展青霉脂肪酶，常压下于35'C、 150rpm的恒温振荡器内振荡，用TLC 监控反应。反应24h后，过滤、真空浓縮滤液、柱层析(石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA"4/1， Rf=0.25)纯化，得白色粉末产物22.4mg，收率为86%，纯度大 于99%。结构通过BCNMR (100.5 MHz)和iHNMR (400 MHz)确认
13C雨R: S ppm 14.37 (C6"), 22.34 (C5"), 24.69 (C3"), 31.24 (C4"), 34.08 (C2"), 63.98 (C6')， 70.62 (C4'), 73.78 (C2'), 74.22 (C5'), 76.93 (C3'), 102.07 (Cl'): 116.01 (C3+ C5), 118.23 (C2+ C6)， 150.71 (Cl), 152.92 (C4), 173.32 (Cl")。
& NMR: S ppm 0.85 (t, 3H, H6")， 1.25 (s, 4H， H4"+ H5")， 1.52 (q， 2H, H3"), 2.28 (t, 2H， H2"), 3.29-3.11 (m， 3H， H2'十H3'十H4'), 3.50 (t, 1H, H5'),楊 (dd, 1H， H6'), 4.33 (d, 1H, H6'), 4.67 (d, 1H, Hl'), 5.14 (d, 1H, OH4'), 5.23 (d, 1H, OH3'), 5.31 (d, 1H, OH2')， 6,65 (d， 2H, H3+ H5)， 6.84 (d, 2H, H2+ H6), 9.01 (s， 1H, OH4)。
实施例4:熊果苷6'-己酸酯的合成
将熊果苷(109mg, 0.4mmo1)、己酸乙酯(3.6 mmol)、 20 mL异丙醚/ 乙腈(1/5, v/v)加入50 mL具塞三角瓶中混匀后，于其中加入800 mg固定化 扩展青霉脂肪酶，常压下于45 °C、 250 rpm的恒温振荡器内振荡，用TLC 监控反应。反应4.5h后，过滤、真空浓縮滤液、柱层析(石油醚(PE)/乙酸 乙酯(EA"4/1， RJN0.25)纯化，得白色粉末产物127 mg，收率为85%，纯 度大于99%。结构通过13C NMR (100.5 MHz)和^ NMR (400 MHz)确 认
13C NMR: S ppm 14.37 (C6"), 22.34 (C5"), 24.69 (C3"), 31.24 (C4"), 34.08 (C2"), 63.98 (C6'), 70.62 (C4'), 73.78 (C2')， 74.22 (C5'), 76.93 (C3'), 102.07 (Cl')， 116.01 (C3+ C5)， 118.23 (C2+ C6)， 150.71 (Cl), 152.92 (C4), 173.32 (Cl")。
!H NMR: S ppm 0.85 (t, 3H， H6")， 1.25 (s， 4H, H4"十H5"), 1.52 (q, 2H， H3"), 2.28 (t, 2H, H2"), 3.29-3,11 (m, 3H, H2'+ H3'十H4')， 3.50 (t, 1H, H5'), 4.06 (dd， 1H, H6'), 4.33 (d, 1H, H6'), 4.67 (d, 1H, Hl')， 5.14 (d, 1H, OH4'), 5.23 (d, 1H, OH3')， 5.31 (d, 1H, OH2')， 6.65 (d, 2H, H3+ H5)， 6.84 (d, 2H, H2+ H6), 9.01 (s, 1H, OH4)。
实施例5:熊果苷6'-辛酸酯的合成
将熊果苷(109 mg, 0.4 mmol)、辛酸乙烯酯(0.4 mmol) 、 20 mL[C4MIm]PF6/四氢呋喃(1/9, v/v)加入50 mL具塞三角瓶中混匀后，于 其中加入600 mg固定化扩展青霉脂肪酶，常压下于40 °C 、 250 rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。反应8h后，过滤、真空浓縮滤液、柱 层析(石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA"4/1， RfH).27)纯化，得白色粉末产物145 mg，收率为91%，纯度大于99%。结构通过13CNMR( 100.5 MHz)和^NMR (400 MHz)确认
13C NMR: S ppm 14.51 (C8"), 22.61 (C7"), 25.01 (C3")， 28.93 (C4")， 29.01 (C5"), 31.68 (C6"), 34.12 (C2"), 63.98 (C6'), 70.61 (C4')， 73.79 (C2'), 74.22 (C5')， 76.93 (C3'), 102.08 (C1'), 116.01 (C3+ C5), 118.22 (C2+ C6)， 150.71 (Cl), 152.93 (C4), 173.32 (Cr')。
& NMR: S ppm 0.85 (t, 3H， H8"), 1.25 (s, 8H， H4"+ H5"+ H6"+ H7"), 1.52 (t, 2H, H3")， 2.28 (t， 2H， H2")， 3.29-3.11 (m, 3H， H2'+ H3'十H4') 3.50 (t， 1H, H5')， 4.06 (dd, 1H, H6')， 4.31 (d, 1H, H6'), 4.67 (d, 1H， Hl'), 5.14 (d, 1H, OH4')， 5.22 (d, 1H, OH3'), 5.30 (d, 1H, OH2')， 6.66 (d, 2H， H3+ H5)， 6.83 (d, 2H, H2+ H6), 9.00 (s， 1H, OH4)。
实施例6:熊果苷6'-辛酸酯的合成
将熊果苷(109 mg, 0.4 mmol)、辛酸甲酯(4 mmol)、 20 mL[C6MIm]PF6/ 四氢呋喃(1/9, v/v)加入50 mL具塞三角瓶中混匀后，于其中加入600 mg 固定化扩展青霉脂肪酶，常压下于45'C、 250rpm的恒温振荡器内振荡，利 用TLC监控反应。反应4h后，过滤、真空浓縮滤液、柱层析(石油醚(PE)/ 乙酸乙酯(EA)-4/1， RfK).27)纯化，得白色粉末产物145 mg，收率为91%， 纯度大于99%。结构通过13C NMR (100.5 MHz)和]H NMR (400 MHz) 确认
13C NMR: 5 ppm 14.51 (C8")， 22.61 (C7")， 25.01 (C3"), 28.93 (C4"), 29.01 (C5"), 31.68 (C6")， 34.12 (C2"), 63.98 (C6'), 70.61 (C4'), 73.79 (C2'), 74.22 (C5'), 76.93 (C3'), 102.08 (Cl')， 116.01 (C3+ C5)， 118.22 (C2+ C6), 150.71 (Cl)， 152.93 (C4), 173.32 (Cl")。
!H NMR: S ppm 0.85 (t, 3H, H8"), 1.25 (s, 8H, H4"+ H5"+ H6"十H7"), 1.52 (t, 2H, H3"), 2.28 (t, 2H, H2")， 3.29-3.11 (m， 3H， H2'+ H3'+ H4') 3.50 (t, 1H, H5'), 4.06 (dd, 1H, H6'), 4.31 (d, 1H, H6'), 4.67 (d, 1H, m'), 5.14 (d, 1H, OH4'), 5.22 (d, 1H, OH3'), 5.30 (d， 1H, OH2'), 6.66 (d, 2H, H3+ H5)， 6.83 (d， 2H， H2+ H6), 9.00 (s, 1H，OH4)。实施例7:熊果苷6'-癸酸酯的合成
将熊果苷(800mg,2.9mmo1)、癸酸乙烯酯(14mmo1)、 20 mL 二噁烷 加入50 mL具塞三角瓶中混匀后，于其中加入520 mg固定化扩展青霉脂肪 酶，常压下于6(KC、 250 rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。 反应24h后，过滤、真空浓縮滤液、柱层析(石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA"4/1， Rf=0.27)纯化，得白色粉末产物1087mg，收率为88%，纯度大于99°/。。结 构通过"CNMR (100.5MHz)和iHNMR (400 MHz)确认
13C NMR: 5 ppm 14.54 (C10"), 22.67 (C9"), 25.01 (C3")， 29.06 (C4"), 29.23 (C5")， 29.28 (C7"), 29.43 (C6"), 31.85 (C8"), 34.12 (C2")， 63.99 (C6')， 70.62 (C4')， 73.79 (C2')， 74.23 (C5'), 76.94 (C3')， 102.11 (Cl')， 116.00 (C3+ C5), 118.23 (C2+ C6), 150.72 (Cl), 152.94 (C4)， 173.31 (Cl")。
& NMR: S ppm 0.85 (t, 3H， H10"), 1.23 (s， 12H, H4"+ H5"+ H6"+ H7"+ H8"+ H9"), 1.51 (t, 2H, H3"), 2,28 (t, 2H, H2"), 3.29-3.08 (m， 3H, H2'+ H3'+ H4'), 3.50 (t, 1H, H5')， 4.06 (dd, 1H, H6'), 4.31 (d, 1H, H6'), 4.66 (d， 1H, HI'), 5.14(d, 1H, 0H4'), 5.22 (d, 1H, OH3'), 5.30 (d， 1H, OH2'), 6.65 (d， 2H, H3+ H5), 6.83 (d, 2H， H2+ H6), 9.00 (s, 1H, OH4)。
实施例8:熊果苷6'-月桂酸酯的合成
将熊果苷(109 mg, 0.4 mmol)、月桂酸乙烯酯(0.8 mmol) 、 20 mL[QPy]NTf2/丙酮(19/l,v/v)加入50 mL具塞三角瓶中混匀后，于其中加 入100 mg固定化扩展青霉脂肪酶，常压下于60 °C、 250 rpm的恒温振荡器 内振荡，利用TLC监控反应。反应72h后，过滤、真空浓縮滤液、柱层析
(石油醚(PEy乙酸乙酯(EA)-l/3， RfN).27)纯化，得白色粉末产物160 mg， 收率为88%，纯度大于99%。结构通过"CNMR (100.5 MHz)和1H NMR
(400 MHz)确认
13C NMR: S ppm 14.51 (C8")， 22.61 (C7,.)， 25.01 (C3 ), 28.93 (C4..)， 29.01 (C5")， 31.68 (C6")， 34.12 (C2',)， 63.98 70.61 (C4,)， 73.79 (C2,)， 74.22 (C5')， 76.93 (C3〕， 102.09 116.01 (C3+ C5), 118.22 (C2+ C6), 150.71 (d), 152.93 (C4)， 173.32 (Cr)。
!HNMR: S ppm 0.85 (t, 3H, H8..)， 1.25 (s， 8H， H4.'+ H5"+ H6"+ H7")， 1.52 (t, 2H， H3,')， 2.28 (t, 2H, H2"), 3.29-3.11 (m, 3H， H2,+ H3.+ H4') 3.50 (t, 1H, H5')， 4.06 (dd, 1H， H6,)， 4.31 (d, 1H, H6,)， 4.67 (d, 1H, Hr), 5.14 (d， 1H, OH4,)， 5.22 (d, 1H，OH3.)， 5.30 (d, 1H, OH2〕， 6.66 (d， 2H, H3+ H5), 6.83 (d， 2H, H2+ H6), 9.00 (s, 1H， OH4)。
实施例9:熊果苷6'-棕榈酸酯的合成
将熊果苷(109mg,0.4mmo1)、棕榈酸乙烯酯(4mmo1)、 20 mL 二噁垸 /异辛烷(1/1，v/v)加入50mL具塞三角瓶中混匀后，于其中加入200mg固 定化扩展青霉脂肪酶，常压下于5(TC、 200rpm的恒温振荡器内振荡，利用 TLC监控反应。反应IO h后，过滤、真空浓縮滤液、柱层析(石油醚(PE)/ 乙酸乙酯(EA)-1/3， Rf=0.28)纯化，得白色粉末产物174mg，收率为85%， 纯度大于99%。结构通过13C NMR (100.5 MHz)和& NMR (400 MHz) 确认
13C NMR: S卯m 13.97 (C16"), 22.13 (C15")， 24.44 (C3"), 28.51 (C4"), 28.75 (C5")， 28.93 (C13"), 29.07 (C6"+ C7"+ C8"+ C9"+ C10"+ Cll"+ C12")，
31.33 (C14"), 33.53 (C2"), 63.43 (C6'), 70.02 (C4')， 73.19 (C2'), 73.63 (C5'),
76.34 (C3'), 101.51 (C1'), 115.41 (C3+ C5), 117.62 (C2+ C6)， 150.13 (Cl)， 152.36 (C4), 172.72 (Cl")。
& NMR: S ppm 0.85 (t， 3H， H16") 1.23 (s, 24H, H4"+ H5"+ H6"+ H7"+ H8"+ H9"+ H10"+ Hll"+ H12"+ H13"十H14"十H15")， 1.50 (t, 2H, H3"), 2.28 (t, 2H， H2"), 3.23-3.14 (m, 3H, H2'+ H3'+ H4'), 3.50 (t, 1H， H5')， 4.06 (dd, 1H, H6'), 4.29 (d, 1H, H6')， 4.66 (d, 1H， Hl')， 5.17 (s, 1H， 0H4'), 5.25 (d, 1H, OH3'), 5.32 (s， 1H， OH2'), 6.65 (d， 2H, H3+ H5)， 6.83 (d, 2H, H2+ H6), 9.01 (s, 1H, OH4)。
实施例10:熊果苷6'-甲基丙烯酸酯的合成
将熊果苷(109 mg, 0.4 mmol)、甲基丙烯酸乙烯酯(6 mmol)、 20 mL[C4MIm]BF4/乙腈(1/19, v/v)加入50 mL具塞三角瓶混匀后，于其中加 入600 mg固定化扩展青霉脂肪酶，常压下于55'C、 150 rpm的恒温振荡器 内振荡，利用TLC监控反应。反应72h后，过滤、真空浓縮滤液、柱层析
(石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA^4/1， Rf=0.25)纯化，得白色粉末产物115 mg， 收率为85%，纯度大于99%。结构通过"CNMR (100.5 MHz)和NMR
(400 MHz)确认
13C NMR: 5 ppm 17.88 (C4"), 64.05 (C6'), 70.17 (C4'), 73.18 (C2'), 73.61 (C5'), 76.38 (C3'), 101.35 (Cl'), 115,40 (C3+ C5)， 117.47 (C2+ C6), 125.67 (C3"),说 135.84 (C2"), 150.10 (Cl), 152.24 (C4)， 166.33 (Cl")。
H NMR: 5 ppm 1.89 (s， 3H, H4"), 3.32-3.15 (m, 3H， H2'+ H3'+ H4')， 3.59 (t， 1H, H5')， 4.06 (dd， 1H, H6'), 4.44 (d, 1H, H6'), 4.69 (d, 1H, Hl'), 5.14 (s, 1H， OH4')， 5.26 (d, 1H, OH3'), 5.29 (d, 1H， OH2')， 5.69 (d, 1H, H3"), 6.05 (s， 1H, H3")， 6.63 (d， 2H, H3+ H5), 6.84 (d, 2H, H2+ H6), 8.98 (s， 1H, OH4)。
实施例lh熊果苷6'-碳十一烯酸酯的合成
将熊果苷(109 mg, 0.4 mmol)、碳H"^—烯酸乙烯酯(6 mmol)、 20 mL 四氢呋喃加入50 mL具塞三角瓶混匀后，于其中加入600 mg固定化扩展青 霉脂肪酶，常压下于45 'C、 200 rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控 反应。反应0.5 h后，过滤、真空浓縮滤液、柱层析(石油醚(PE)/乙酸乙酯 (EA)=4/1， RfN3.25)纯化，得白色粉末产物172 mg，收率为98%，纯度大 于99%。结构通过"CNMR (100.5 MHz)和^NMR (400 MHz)确认
^NMR: S ppm 1.23 (s, 8H， H4'十H5"+ H6"+ H7")， 1.32-1.30 (m， 2H， H8"), 1.51 (s, 2H, H3"), 1.99 (q, 2H, H9"), 2.27 (t， 2H, H2"), 3.27-3.12 (m, 3H， H2'+ H3'十H4'), 3.50 (t, 1H, H5'), 4.06 (dd, 1H， H6'), 4.31 (d， 1H, H6'), 4.66 (d, 1H, Hl'), 5.00-4.90 (m, 2H, Hll"), 5.13 (s, 1H， OH4'), 5.21 (d， 1H, OH3')， 5.29 (s, 1H, OH2'), 5.82-5.72 (m, 1H, H10"), 6.65 (d, 2H, H3+ H5), 6.83 (d, 2H, H2+ H6): 8.99 (s, 1H, OH4)。
13C NMR: S ppm 24.38 (C3")， 28.25 (C8"), 28.41 (C6"+ C7"), 28.60 (C5"), 28.65(C4" )， 33.12 (C9"), 33.52 (C2")， 63.38 (C6'), 70.05 (C4')， 73.19 (C2'), 73.65 (C5')， 76.36 (C3'), 101.57 (Cl'), 114.51 (Cll"), 115.40 (C3+ C5), 117,66 (C2+ C6), 138.77 (C10"), 150.12 (Cl), 152.34 (C4), 172.66 (Cl")。
实施例12:熊果苷6'-苯甲酸酯的合成
将熊果苷(109mg,0.4mmo1)、苯甲酸乙烯酯(8mmo1)、 20 mL正辛烷 /四氢呋喃(19/1, v/v)加入50 mL具塞三角瓶混匀后，于其中加入700 mg 固定化扩展青霉脂肪酶，常压下置于6(TC、 200rpm的恒温振荡器内振荡， 利用TLC监控反应。反应72h后，过滤、真空浓縮滤液、柱层析(石油醚 (PE)/乙酸乙酯(EA"1/4， RfH).25)纯化，得产物130 mg，收率为86%，白 色粉末，纯度大于99%。结构通过^CNMR (100.5 MHz)和^NMR (400 MHz)确认"C NMR: S ppm 165.51 (Cl"), 152.25 (C4)， 150.05 (Cl), 133.34 (C5"), 129.68 (C2")， 129.14 (C3'十C7"), 128.68 (C4"十C6"), 117.56 (C2+ C6), 115.40 (C3+ C5), 101.36 (CI'), 76.45 (C3')， 73.65 (C5'), 73.24 (C2'), 70.25 (C4'), 64.32 (C6')。
& NMR: S ppm 9.02 (s, 1H, OH4), 7.98 (d, 2H， H3"+ H7"), 7.70-7.66 (m, 1H, H5"), 7.55 (t, 2H, H4"十H6"), 6.88 (d, 2H， H2+ H6), 6.60 (d, 2H, H3+ H5), 5.37-5.36 (m, 2H， OH2'十OH3'), 5.18 (t, 1H, OH4'), 4.76 (t, 1H， Hl'), 4.63 (d, 1H H6'), 4.31-4.27 (m, 1H, H6'), 3.54 (t, 1H, H5'), 3.38-3.28 (m, 3H， H2'+ H3'+ H4')。
实施例13:天麻苷6'-己酸酯的合成
将天麻苷(115mg, 0.4mmo1)、己酸乙烯酯(4 mmol)、 20mL环己垸/ 四氢呋喃(1/4,v/v)加入50mL具塞三角瓶混匀后，于其中加入500mg固 定化扩展青霉脂肪酶，常压下置于5(TC、 200rpm的恒温振荡器内振荡，利 用TLC监控反应。反应6h后，过滤、真空浓缩滤液、柱层析(石油醚(PE)/ 乙酸乙酯(EA)-1/4， Rf=0.25)纯化，得产物131 mg，收率为85%，白色粉 末，纯度大于99%。结构通过13C NMR (100.5 MHz)禾Q ^NMR (400 MHz) 确认。
实施例14:葡萄糖豆腐果苷6'-辛酸酯的合成
将葡萄糖豆腐果苷(115mg,0.4mmo1)、辛酸乙烯酯(6mmo1)、 20 mL 异辛垸/叔丁醇(1/5, v/v)加入50 mL具塞三角瓶混匀后，于其中加入400 mg 固定化扩展青霉脂肪酶，常压下置于55"、 200rpm的恒温振荡器内振荡， 利用TLC监控反应。反应4 h后，过滤、真空浓縮滤液、柱层析(石油醚(PE)/ 乙酸乙酯(EA)4/4， RfN).25)纯化，得产物145 mg，收率为88%，白色粉 末，纯度大于99%。结构通过13CNMR (100.5 MHz)和& NMR (400 MHz) 确认。
实施例15:葡萄糖豆腐果苷6'-月桂酸酯的合成
将葡萄糖豆腐果苷(115mg,0.4mmo1)、辛月桂酸酸乙烯酯(4mmo1)、 20mL正壬垸/丙酮(1/5, v/v)加入50 mL具塞三角瓶混匀后，于其中加入 520 mg固定化扩展青霉脂肪酶，常压下置于30 'C、 250 rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。反应4h后，过滤、真空浓缩滤液、柱层析(石 油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)-1/4， RfK).25)纯化，得产物142mg，收率为86%， 白色粉末，纯度大于99%。结构通过13C NMR (100.5 MHz)和^NMR (400 MHz)确认。
实施例16:水杨醛-P -D-葡萄糖苷6'-巴豆酸酯的合成 将水杨醛-e-D-葡萄糖苷(115 mg， 0.4 mmol)、巴豆酸酸乙烯酯(4 mmol)、 20mL正庚烷/乙腈(l/5,v/v)加入50 mL具塞三角瓶混匀后，于其 中加入800 mg固定化扩展青霉脂肪酶，常压下置于55 °C、 100 rpm的恒温 振荡器内振荡，利用TLC监控反应。反应72h后，过滤、真空浓縮滤液、 柱层析(石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)-1/4， RM).25)纯化，得产物145 mg， 收率为88%，白色粉末，纯度大于99%。结构通过"CNMR (100.5 MHz) 和iHNMR (400 MHz)确认。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述 实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护 范围之内。
权利要求
1、一种固定化扩展青霉(Penicillium expansum)脂肪酶催化合成糖苷酯类化合物的方法，其特征在于包括以下操作步骤在非水介质中，加入摩尔比为1∶1～20∶1的酰基供体和糖苷，，得到溶液，该溶液中糖苷的浓度为1～40mg/mL；加入与糖苷的质量比为10∶1～1∶10的固定化扩展青霉脂肪酶，在温度为30～60℃、振荡速度为100～300rpm和常压条件下，转酯化反应0.5～72小时，得到糖苷酯类化合物；所述酰基供体为羧酸乙烯酯、酸酐、羧酸甲酯或羧酸乙酯；所述糖苷为具有如下通式(II)的化合物其中，R1为氢、羟基、甲氧基、醛基、羟甲基、甲酰基或乙酰基；R2为氢、甲基或醛基；R3为氢或甲基；所述非水介质为非质子有机溶剂或含低亲核性阴离子的离子液中的一种或两种。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述糖苷为熊果苷、天 麻苷、葡萄糖豆腐果苷、高熊果苷、异高熊果苷或水杨醛-:-D-葡萄糖苷。
3、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述固定化扩展青霉脂 肪酶的制备包括以下操作步骤(1) 将含有质量百分数为95%淀粉的扩展青霉脂肪酶粗酶粉溶于甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中，配制成每毫升缓冲液含有0.3g脂肪酶粗酶粉的悬浮 液，在温度35 。C和转速150 rpm条件下搅拌1 h;在温度4。C和转速6000 rpm 条件下离心得上清液；所述甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中甘氨酸和氢氧化钠的 重量比为2.9: 1;(2) 将大孔吸附树脂用质量百分数为95%的乙醇浸泡后，用去离子水洗至滤液澄清，得到滤液；(3)将步骤(2)所得滤液添加到步骤(1)所得上清液中，加酶量为9 g粗酶粉/g树脂；在温度35'C和转速150rpm条件下搅拌4h，过滤，用甘 氨酸-氢氧化钠缓冲液冲洗，抽滤后冷冻干燥，得到固定化扩展青霉脂肪酶。
4、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述非质子有机溶剂为 四氢呋喃、丙酮、乙腈、二噁垸、叔丁醇、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、 吡啶、异丙醚、异辛烷、正己烷、正庚垸、正辛烷、正壬垸或环己垸；所述含低亲核性阴离子的离子液中的阴离子为四氟硼酸根离子、六氟磷 酸根离子、二 (三氟甲基磺酰)亚胺离子或氨基酸阴离子；阳离子为1-垸基 -3-甲基咪唑离子、l-烷基-2,3-二甲基咪唑离子、季铵离子、季磷离子、氨基 酸阳离子或N-垸基吡啶离子。
5、 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述非水介质为非质子 有机溶剂中的两种。
6、 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述非水介质为非质子 有机溶剂中的一种和含低亲核性阴离子的离子液中的一种，其中含低亲核性 阴离子的离子液的体积百分含量为5 95%。
7、 根据权利要求1 6任一项所述方法制备的糖苷酯类化合物，其特征在于该糖苷酯类化合物具有如下通式(I ):<formula>formula see original document page 3</formula>其中R为2 18个碳原子的烷酰基或9 H个碳原子的不饱和芳香酰 基；&为氢、羟基、甲氧基、醛基、羟甲基、甲酰基或乙酰基；R2为氢、甲 基或醛基；R3为氢或甲基。
8、根据权利要求7所述的糖苷酯类化合物，其特征在于所述烷酰基 为直链或支链的饱和或不饱和的烷酰基；所述不饱和芳香酰基为顺式不饱和 芳香酰基或反式不饱和芳香酰基。
全文摘要
本发明公开了一种固定化扩展青霉脂肪酶催化合成糖苷酯类化合物的方法。该方法是在非水介质中，加入摩尔比1∶1～20∶1的糖苷和酰基供体，糖苷的浓度为1～40mg/mL；加入与糖苷的质量比为10∶1～1∶10的固定化扩展青霉脂肪酶，在温度30～60℃、振荡速度100～300rpm和常压条件下，转酯化反应0.5～72小时，得到糖苷酯类化合物。该化合物具有如上通式(I)的结构。本发明选用一种价格低廉的固定化扩展青霉脂肪酶制剂进行转酯化反应合成糖苷的酯类化合物，不但收率高达85％～98％，且成本大大降低。本发明具有反应条件温和、环境友好、区域选择性高、反应过程简单可控、产物易分离和成本低的优点。
文档编号C12P19/44GK101624612SQ20091004170
公开日2010年1月13日 申请日期2009年8月7日 优先权日2009年8月7日
发明者虹 吴, 宗敏华, 宁 李, 杨荣玲 申请人:华南理工大学