专利名称：一种具有拆分消旋体苯基缩水甘油酯活性的酯酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于酶工程领域，具体涉及一种具有拆分消旋体苯基缩水甘油酯活性的酯 酶及其编码基因，以及该酯酶的应用。
背景技术：
目前，资源、能源和环境危机已经威胁到人类的生存与发展。生物转化是以微生物 或酶作为催化剂，以可再生资源取代不可再生资源，大规模生产人类所需的化学品、医药、 能源、材料等的有效手段。(2R，3S)_苯基缩水甘油酯是合成抗癌药物紫杉醇以及治疗心血管药物地尔硫卓 的重要的中间体。目前合成手性(2R，3S)_苯基缩水甘油酯的方法主要分为化学合成法，手 性助剂共结晶法和生物酶促转化法。化学法方法成本高、步骤烦琐，而且催化过程中使用的 重金属催化剂严重污染环境。以手性助剂为拆分剂的方法收率较低，且终产物中有拆分剂 残留。生物酶法在合成手性(2R，3S)_苯基缩水甘油酯中，具有节约能源，效率高，对环境友
好的特点。 酶法拆分苯基缩水甘油酯能够水解拆分消旋苯基缩水甘油酯的酶被称为酯酶。酯酶由于具有稳定性高，不 需要辅因子参与催化反应的特点，在手性化合物拆分中具有广泛的应用。目前所报道的酯 酶的拆分过程中，酯酶对苯基缩水甘油酯底物的拆分不具有绝对选择性，所以拆分效果依 赖于拆分反应的过度反应，即需要超过50%的反应转化率。这种不具绝对选择性的酶很容 易造成产物光学活性降低或者目的光学产物的损失。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种具有拆分消旋体苯基缩水甘油酯活性的酯 酶及其编码基因。该酯酶具有绝对选择性，可用于消旋苯基缩水甘油酯的拆分，制备获得光 学纯的(2R，3S)_苯基缩水甘油酯。为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是本发明所提供的酯酶被命名为MHest，来源于液化微杆菌(Microbacterium liquefaciens)。酯酶MHest是如下(a)或(b)的蛋白质
(a)由序列表中的SEQ ID NO 1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中的SEQ ID NO 1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取 代和/或缺失和/或添加且具有拆分消旋体苯基缩水甘油酯活性的由SEQ ID N0:1衍生的 蛋白质。其中，序列表中的SEQ ID NO 1由253个氨基酸残基组成。上述酯酶的编码基因也属于本发明的保护范围。它可具有下述核苷酸序列之一(a)序列表中SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列；(b)编码序列表中SEQ ID NO 1蛋白质序列的多核苷酸。其中，序列表中的SEQ ID NO 2由762个碱基组成，其编码序列为自5，端第1到 第762位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO 1的氨基酸残基序列的蛋白质。含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。本发明的酯酶MHest是通过如下方法制备的培养液化微杆菌获得细胞，提取液 化微杆菌的全基因组DNA，建立液化微杆菌的质粒基因组文库，利用三丁酸甘油酯法筛选质 粒文库，获得具有水解三丁酸甘油酯能力的克隆，对阳性克隆进行测序，获得酯酶的基因。 根据基因序列设计PCR引物，提取微杆菌全基因组，以全基因组为模板，利用上述设计的引 物进行PCR扩增，获得目的基因。将上述基因构建到重组表达载体上，构建好的蛋白基因含 有氨基端和羧基端的组氨酸标签蛋白。将构建好的表达载体导入宿主细胞，表达得到酯酶 MHest0用于构建含有上述酯酶编码基因的重组表达载体都可以为基因工程领域中的质 粒表达载体、可行的载体包括PET系列载体，pUC系列载体，pGEX系列载体等。宿主细胞选 择与上述表达载体相应的宿主。如大肠杆菌E. coil BL21(DE3)等。表达后的蛋白进一步 利用公认已知的纯化方法进行纯化。本发明所述的酯酶MHest可以用于消旋的苯基缩水甘油酯的拆分，获得99. 6%光 学纯的(2R，3S)_苯基缩水甘油酯。该酯酶在进行消旋苯基缩水甘油酯的拆分前，为了提高 反应效率，可以利用海藻酸钠法制备获得固定化酯酶。具体反应为将消旋苯基缩水甘油酯底物加入到0. 5M，pH6. 0 pH8. 5的磷酸缓冲液中，该消旋 苯基缩水甘油酯在该缓冲液中的浓度为0. 06mol/L 0. 93mol/L，然后在此缓冲液中加入 固定化的酯酶，该固定化酯酶与缓冲液的质量体积比为2g IOg 1L，在30°C 60°C转化 1 6小时，制得(2R，3S)_苯基缩水甘油酯。所述固定化酯酶是通过下述方法制备获得的所述酯酶用海藻酸钠法进行固定， 固定化的条件为将酯酶与30°C的0. 23mol/L 0. 45mol/L的海藻酸钠溶液混合，所述酯 酶在该海藻酸钠溶液中的浓度为4g/L，然后将含有酯酶的海藻酸钠溶液滴入到4°C的含有 浓度为0. lmol/L 0. 5mol/L CaCl2的1. 5mol/L 5mol/L的硼酸溶液中，所述海藻酸钠 与CaCl2的摩尔比例控制在23 10 50，固定化时间3 8小时，固定化温度为4°C。本发明的有益效果主要体现在本发明提供了一种具有拆分消旋体苯基缩水甘油 酯活性的酯酶及其编码基因。该酯酶具有绝对选择性，可用于水解消旋苯基缩水甘油酯制 备(2R，3S)-苯基缩水甘油酯，产率大于42 %，光学纯度大于99. 6 %。下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细的说明。
图1以微杆菌基因组为模板PCR扩增MHest的DNA电泳图，泳道1，MHest PCR产物；泳道M，DNA分子量标准；图2重组MHest的表达及纯化SDS-PAGE图，泳道1，Ecoli BL21 (DE3)细胞对照，泳道2，pET30空质粒的表达对照，泳道3， PETMHest的表达，泳道4，MHest蛋白的纯化，泳道M，蛋白分子量标准；图3重组MHest拆分消旋苯基缩水甘油酯HPLC图谱。a消旋苯基缩水甘油酯，b (2R，3S)-苯基缩水甘油酯
具体实施例方式以下实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。实施例1本发明的酯酶MHest基因的获得(1)液化微杆菌(Microbacterium liquefaciens)基因组质粒文库的建立及筛选在中国普通微生物菌种保藏管理中心购买液化微杆菌1. 1934 (Microbacterium liquefaciens 1.1934)的菌株安培管，将管口打碎后加入ImL液体营养肉汁琼脂培养基 (蛋白胨10g/L，牛肉浸取物3g/L，NaCl 5g/L，蒸馏水lL，pH7. 0)，然后将菌株的悬浮液接入 IOOmL同样的培养基培养，摇床条件为220转/分钟，30°C，48小时。培养完成后用离心机 12000转/分钟离心收集菌体。纯化提取来自液化微杆菌的基因组DNA，采用细菌基因组提取试剂盒(上海生 工)提取，操作方法按照试剂盒提供的说明书进行。用BamHI内切酶酶切该基因组DNA至 lkb-6kb之间的片段。回收这些片段，连入到通过同样处理的pUC18质粒上。连接产物转化 大肠杆菌E. coli DH5a转化后涂三丁酸甘油酯平板。筛选获得一株具有明显水解活力的 克隆，提取质粒，BamHI酶切表明插入重组质粒上来自基因组的片段为3kb，将带有此片段 的质粒样品进行DNA测序，测序工作在北京华大基因进行。测序结果表明在该片段上有一 个完整的ORF阅读框架，Blast分析表明未见与此序列同源性相关的基因。将该ORF阅读 框架编码的蛋白命名为MHest。这个基因的DNA序列如SEQ ID NO :2所示，相应的氨基酸 序列如SEQ ID NO 1所示。(2)引物设计根据上述基因序列设计引物，引物序列如下(由上海生工合成)；MHest上游引物 -GGGAATTCCATATGACACTCAGGTTTCGATTTACCTCGAT-3'下划线表示NcoI酶切位点MHest下游引物5“-CCTCGAGTGGCTCGTCTATGAGCCAGACCCC-3“下划线表示XhoI酶切位点(3) PCR扩增及基因克隆使用细菌基因组提取试剂盒(上海生工)提取微杆菌基因组，操作方法按照试剂 盒提供的说明书进行，以此基因组DNA作为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为1 μ L基因组DNA(180yg/ml)，3yL dNTP (10mM，上海生工)，1单位(U)的tag酶(申能博彩)，各1 μ L 的上下游引物(10 μ Μ)，用ddH20补至50 μ L。PCR条件为第一步热变性95°C，5分钟，第二 步热变性95 °C，30秒，第三步退火50 °C，30秒，第四步延伸72 °C，2分钟，第五步延伸72 °C， 10分钟，第二步到第四步之间设置30个循环，PCR反应结束后电泳检测(见附图1)。PCR产物经胶回收试剂盒(上海生工)回收，操作方法按照试剂盒提供的说明书 进行，样品回收后分别用NcoI和XhoI酶切，连入相同酶切的pET30质粒。构建好的载体为 pETMHest。实施例2重组蛋白表达和纯化将构建好的质粒pETMHest通过电转化法导入大肠杆菌E. coil BL21(DE3)，获得 转化子Ε. coil BL21 (pETMHest)。将转化子接种到LB液体培养基(含有卡那霉素)的试 管中，37°C过夜培养，按的转种量转接到含有400mL的LB液体培养基(含卡那霉素) 中，37°C培养，待OD值为0. 6-0. 8时，加入终浓度为ImM的IPTG进行诱导培养3小时，离 心收集菌体。将菌体悬浮在结合缓冲液中(50mM TrisHCl，20mM咪唑，50mMNaCl，pH8.0，)， 进行超声波破碎(300W，超声3秒，间隔1秒，共90个循环)，14000RPM离心，收集上清液， 上清液加入ImL的镍亲和柱(Novogen)，结合后用5mL洗涤缓冲液(50mM TrisHCl，IOOmM 咪唑，50mMNaCl，pH8. 0，)进行洗涤，之后用5mL洗脱缓冲液(50mM TrisHCl，250mM咪唑， 50mMNaCl,pH8.0,)进行洗脱。洗脱后的蛋白用20mM Tris HCl缓冲液透析，透析后的蛋白 冷冻干燥后(Flexdry冷冻干燥仪，美国)收集。SDS-PAGE检测表明蛋白的纯度在95%以 上(见图2，泳道4)。MHest的单体分子量为27. 4kDa，在生理条件下以三聚体形式存在，表观分子量为 90kDa。酶的最适反应温度为60°C，最适反应pH值为7. 0，催化反应不需要金属离子作为激 活剂。实施例3酯酶的固定将纯化后的蛋白用海藻酸钠法进行固定，固定化的方法具体如下，在IOmL的水中 加入0. 3g的海藻酸钠(从百灵威公司购买)，并且加热到121°C彻底溶解，将混合液温度 冷却至30°C，加入溶解在pH7. 0的磷酸缓冲液中的酯酶，该酯酶在该海藻酸钠溶液中的浓 度为4g/L，轻微搅拌混合液进行混合，将混合液用注射器小心滴入冰冷的含0. lmol/L的 CaCl2的1. 5mol/L的硼酸溶液，所述海藻酸钠与CaCl2的摩尔比例控制在23 10，固定化 酶在上述硼酸溶液中继续悬浮3小时，保持温度为4°C。固定化结束后，固定化酶过滤收集， 用蒸馏水洗涤后保存在4°C冰箱中。实施例4重组酯酶在消旋的苯基缩水甘油酯拆分中的应用(1)反应转化率测定和对映体手性分析方法酯酶的活性测定和对映体的分析采用手性HPLC方法。色谱柱型号为Daicel公司 Chiralpark As-H(250 X 4. 6mm)；流动相为乙腈；流速为0. 6mL/分钟；检测波长为230nm ； 产物的定量方法采用内标法，内标物为乙酰苯丙氨酸。(2)固定化酶催化水解消旋苯基缩水甘油酯将消旋苯基缩水甘油酯底物首先溶解在乙腈中，然后加入到1L，0. 5M，pH7. 5的磷 酸缓冲液中，该消旋苯基缩水甘油酯在磷酸缓冲液中的浓度为0. 5mol/L，然后，加入IOg固 定化的MHest酶，将反应液加入到4L发酵罐中，控制温度在60°C，通气量lL/min，转化时间为1小时。用手性HPLC检测反应进程，控制转化率。对于转化反应，反应到达50%即可终 止反应，过滤留存固定化MHest酶，反应液用乙酸乙酯萃取，萃取液旋转蒸发仪蒸干，获得 收率为43%、光学纯度为99. 6%的(2R，3S)_苯基缩水甘油酯。(见图3)实施例5重组酯酶在消旋的苯基缩水甘油酯拆分中的应用(1)反应转化率测定和对映体手性分析方法酯酶的活性测定和对映体的分析采用手性HPLC方法。色谱柱型号为Daicel公司 Chiralpark As-H(250 X 4. 6mm)；流动相为乙腈；流速为0. 6mL/分钟；检测波长为230nm ； 产物的定量方法采用内标法，内标物为乙酰苯丙氨酸。(2)固定化酶催化水解消旋苯基缩水甘油酯将消旋苯基缩水甘油酯底物首先溶解在乙腈中，然后加入到1L，0. 5M，pH7. 0的磷 酸缓冲液中，该消旋苯基缩水甘油酯在磷酸缓冲液中的浓度为0. 8mol/L，然后，加入IOg固 定化的MHest酶，将反应液加入到4L发酵罐中，控制温度在60°C，通气量lL/min，转化时间 为1.5小时。用手性HPLC检测反应进，控制转化率。对于转化反应，反应到达50%即可 终止反应，过滤留存固定化MHest酶，反应液用乙酸乙酯萃取，萃取液旋转蒸发仪蒸干，获 得收率为44%、光学纯度为99. 6%的(2R，3S)_苯基缩水甘油酯。显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对 本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发 明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
权利要求
一种具有拆分消旋体苯基缩水甘油酯活性的酯酶，是如下(a)或(b)的蛋白质；(a)由序列表中的SEQ ID NO1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中的SEQ ID NO1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有拆分消旋体苯基缩水甘油酯活性的由SEQ ID NO1衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述的酯酶的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述酯酶的编码基因具有下述核苷 酸序列之一(a)序列表中SEQID NO 2所示的核苷酸序列；(b)编码序列表中SEQID NO 1蛋白质序列的多核苷酸。
4.含有权利要求2或3所述的酯酶编码基因的重组表达载体。
5.含有权利要求2或3所述的酯酶编码基因的转基因细胞系。
6.含有权利要求2或3所述的酯酶编码基因的宿主菌。
7.权利要求1所述的酯酶在拆分消旋体苯基缩水甘油酯制备(2S，3R)_苯基缩水甘油 酯中的应用。
8.权利要求2或3所述的酯酶编码基因在拆分消旋体苯基缩水甘油酯制备(2S， 3R)-苯基缩水甘油酯中的应用。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述应用为将消旋苯基缩水甘油酯底物 加入到0. 5M，pH6. 0 pH8. 5的磷酸缓冲液中，该消旋苯基缩水甘油酯在该缓冲液中的浓度 为0. 06mol/L 0. 93mol/L，然后在此缓冲液中加入固定化的酯酶，该固定化酯酶与缓冲液 的质量体积比为2g IOg 1L，在30°C 60°C转化1 6小时，制得(2R，3S)_苯基缩水 甘油酯。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述固定化酯酶是通过下述方法制备获 得的所述酯酶用海藻酸钠法进行固定，固定化的条件为将酯酶与30°C的0. 23mol/L 0. 45mol/L的海藻酸钠溶液混合，所述酯酶在该海藻酸钠溶液中的浓度为4g/L，然后将含 有酯酶的海藻酸钠溶液滴入到4°C的含有浓度为0. lmol/L 0. 5mol/L CaCl2的1. 5mol/ L 5mol/L的硼酸溶液中，所述海藻酸钠与CaCl2的摩尔比例控制在23 10 50，固定 化时间3 8小时，固定化温度为4°C。
全文摘要
本发明提供一种来源于液化微杆菌(Microbacterium liquefaciens)的酯酶MHest及其编码基因，还提供了该酯酶水解拆分消旋体苯基缩水甘油酯的应用。本发明所述酯酶是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中的SEQ IDNO1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中的SEQ ID NO1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有拆分消旋体苯基缩水甘油酯活性的由SEQ ID NO1衍生的蛋白质。利用该酯酶拆分消旋体苯基缩水甘油酯可以获得光学纯度为99.6％的(2R，3S)-苯基缩水甘油酯，收率大于42％。
文档编号C12N15/63GK101886063SQ20101021021
公开日2010年11月17日 申请日期2010年6月23日 优先权日2010年6月23日
发明者吴胜, 王建军 申请人:中国科学院微生物研究所