专利名称：一种莜麦病程相关蛋白基因及其编码的蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物中与抗病害相关的基因序列及其编码的氨基酸序列，尤其涉及莜麦(裸燕麦)的一种病程相关蛋白基因序列。
背景技术：
植物在其生长发育过程中会受到一些病原微生物的侵袭，常可诱发植物产生抗病机制。从作用方式看，植物产生的抗病机制可分为3种形成障碍物以阻止病原菌的侵染和扩散；产生具有抑菌活性的物质以杀死病原体；产生一些酶或化学物质以解除致病因子。 病程相关蛋白(pathogenesis related proteins,PRP / PRs)就是植物在病理或病理相关的条件下产生的一类蛋白，具有广谱抗性。它最初是由Van Loon和Van Ka_en等人应用多聚腺苷酸诱导烟草抗病研究时发现的，称为b蛋白。随着研究的不断深入，在许多植物中都发现了该类蛋白，并将其命名为病程相关蛋白。植物在外界因素(如病原因素、化学和物理因素等)以及自身生理因素(如开花、落叶、衰老等)影响下常会产生或积累PRP，其主要分布于植物的细胞间隙和液泡内，相对分子量较小，一般为10-40kD。PRP的稳定性较好，能抵抗蛋白酶、糖苷酶、重金属、尿素、低pH值和高温(60°C )等。已报道的PRP大部分是植物抗病原微生物时产生的，但也有些是由化学或物理条件诱导产生的，其主要功能包括攻击病原物、分解毒素、结合或抑制病毒外壳蛋白。按氨基酸序列的相似度可将PRP分为以下5类(1)PR-1类，富含甘氨酸，该类蛋白在TMV侵染烟草过敏反应中产生的。(2)PR-2和PR-3类，分别具有P _1，3-葡聚糖酶和几丁质酶活性。(3)PR-4类，有保守的Barwin domain，N端有信号肽。(4)PR_5类，被称为类甜蛋白(Thaumatin-Iike proteins),是一类具有多种生物学活性及重要功能的植物防御蛋白。通常该类蛋白具有葡聚糖酶活性，能结合并降解真菌细胞壁，该功能与其表面的酸性“V”字形裂缝有关。(5) PR-IO类，有核酸酶相似结构，部分显示体外核酸酶活性和抗菌活性。莜麦(又称裸燕麦)是晋西北地区主要的粮食作物之一，在禾谷类作物中蛋白质含量最高，含有人体必需的8种氨基酸，且组成也较平衡。长期食用莜麦不仅能预防高血压、高血脂等心脑血管疾病，而且对糖尿病的预防及治疗也有一定的作用。本发明从莜麦幼苗中分离到一种病程相关蛋白基因，该基因编码的蛋白属于PR-5类病程相关蛋白，已有报道在玉米、高梁、小麦等种子中发现了该类蛋白，分子量约为23KD。该类蛋白常具有抗真菌、￠-1,3-葡聚糖酶、抗冻、抗渗透压力等多种生物学活性，参与植物系统获得性反应(SAR)和超敏反应(HR)，在植物抵御生物和非生物胁迫中具有重要作用。PR-5蛋白能导致真菌孢子裂解，抑制孢子萌发，降低萌芽的生存能力，消耗细胞膜的势能，抵抗不同的致病和非致病真菌。研究发现，酵母细胞膜表面存在一种PR-5蛋白的受体(Izh2p),从而导致细胞程序性死亡，该PR-5蛋白受体在真菌是保守存在的，这使的PR-5蛋白被认为是一种新颖的、广谱的、具有潜力的抑菌药物。此外，对转PR-5基因作物的研究发现，与野生作物相比，转基因作物对环境胁迫的适应能力，尤其是抗盐溃、干旱和病菌侵害的能力都有显著的提高，这也进一步证实了 PR-5蛋白的应用价值。另外PR-5蛋白还与毫无氨基酸序列同源性的动物脂联素(adiponectin)具有相似的功能——能通过哺乳类C2C12肌细胞的脂联素受体诱导AMP激酶的磷酸化作用，这一研究发现使得PR-5蛋白的应用前景更为广阔。
发明内容
本发明的目的是提供莜麦中的一种PR-5类病程相关蛋白基因及其编码的蛋白，本发明的另一目的在于将莜麦病程相关蛋白的基因在培育抗病作物中应用，将莜麦病程相关蛋白在制备抑囷剂中应用。本发明提供的一种莜麦病程相关蛋白(permatin)的基因,其核苷酸序列为SEQID No :1，来源于莜麦(A. nuda)，由678个碱基组成。莜麦病程相关蛋白(permatin)的基因编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No 2，由225个氨基酸组成。蔽麦病程相关蛋白基因的获得I)根据 NCBI 中 permatin precursor [Avena sativa](登录号为 ASU57787) DNA序列设计引物正向引物IaaUp5’ -CTGGATCCATGGCGTCCTCCAGTGTC-3’反向引物184aaDn5’ -GTCGGTGAACTGGCCCCGGCA-3’以莜麦(A. nuda)幼苗叶片总RNA为模板，在laaUp/184aaDn引物引导下进行RT-PCR ；2)根据已获取的permatin基因5’端cDNA序列设计特异性引物124aaUp,利用3’ RACE技术扩增permatin基因cDNA 3’末端；3)利用重叠PCR获得permatin基因的全长核苷酸序列。将该基因全长经Blast比对，结果表明其与禾本科植物类甜蛋白(Thaumatin-like proteins, TLP)有较高的同源性,具有PR-5类蛋白的共同特征,归属于PR-5类病程相关蛋白，在培育抗病作物中潜在的应用价值。莜麦重组病程相关蛋白的获得将5’和3’端分别含有EcoR I和BamH I酶切位点的PCR产物克隆至含相应酶切位点的原核表达载体pMAL-2c中，构建成重组质粒pMAL-2c-permat in,转E. Coli BL21感受态细胞中，IPTG诱导表达重组蛋白，并进行纯化。蔽麦重组病程相关蛋白抑菌实验用牛津杯法鉴定permatin蛋白对白腐菌、毛壳菌、红曲霉三种真菌的抑制作用，表明该蛋白具有很好的抗菌效果，在开发绿色抑菌剂方面有潜在的应用价值。本发明的莜麦病程相关蛋白的基因，可用于培育抗病作物；该基因编码的蛋白，可用于开发绿色抑菌剂等。
图I为莜麦幼苗叶片总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果图2为RT-PCR及3’ RACE实验PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果泳道I :DNAMarker ;泳道2 :laaUp/184aaDn 引物扩增产物；泳道3 124aaUp/InnerPrimer引物扩增产物。
图3为搭桥PCR扩增permatin全长cDNA琼脂糖凝胶电泳检测结果泳道I :DNA Marker ;泳道 2-3 laaUp/228aaDn 引物扩增产物。图4为不同来源的PRP氨基酸序列比对结果Triticum aestivum TLP (GenBank 登录号为 AAM15877. I) ；0ats permatinprecursor (GenBank 登录号为 AAB02259. I) ;Barley TLP7 (GenBank 登录号为 548125);Zeamatin precursor (RefSeq 登录号为 NP 001105356. I) ；Barperml (GenBank 登录号为AAB71680. I)。图5为重组融合蛋白纯化过程12%SDS_PAGE
泳道I :Pix)tein Marker ;泳道2 :诱导全菌样；泳道3 :诱导上清样；泳道4 :诱导沉淀样；泳道5 Amylose柱穿透样；泳道6 :麦芽糖洗脱样；泳道7 Sephacryl-200凝胶层析柱纯化样。图6为permatin蛋白体外抑菌实验A.对白腐菌菌丝生长的抑制；B.对毛壳菌菌丝生长的抑制；C.对红曲霉菌丝生长的抑制；(0 :control I 30 u g/ml 2 50 u g/ml 3 80 u g/ml)
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。实施例I莜麦permatin基因的克隆根据NCBI已经报道的 permatin precursor [Avena sativa](登录号为ASU57787)DNA序列设计引物正向引物IaaUp5’ -CTGGATCCATGGCGTCCTCCAGTGTC-3’反向引物184aaDn5’ -GTCGGTGAACTGGCCCCGGCA-3'以莜麦(A. nuda)幼苗叶片总RNA为模板，在laaUp/184aaDn引物引导下进行RT-PCR，然后根据已知的permatin基因5’端cDNA序列设计特异性引物124aaUp，利用3’RACE技术扩增permatin基因cDNA 3’末端,进而得到permatin基因的全长核苷酸序列。具体方法包括以下步骤I. Total RNA的提取取生长5_7天的莜麦幼苗叶片，用TRNzol法(所用试剂购自TIANGEN公司)提取幼苗Total RNA。具体方法为称取生长良好的莜麦幼苗叶片0. 2g，立即在液氮中充分研磨，加入3ml TRNzol试剂，将匀浆样品吸入无RNase的I. 5ml离心管中，室温放置15分钟；每毫升匀浆样中加入0. Iml氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3分钟；4°C下，12000rpm离心15分钟，此时样品会分成三层黄色有机相、中间层和上层无色的水相。RNA主要分在水相，用Iml的移液器将水相转移到无RNase的I. 5ml离心管中；加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置30分钟；4°C下，12000rpm离心10分钟，倒掉上清，此时可以在管侧和管底看到胶状沉淀；加入Iml 75%乙醇(DEPC处理过的水配制)洗涤沉淀，4°C下，12000rpm离心10分钟，倒掉上清后室温下放置2-3分钟，加入50 U I RNase-free ddH20,反复吹打溶解RNA取5 ii ITotal RNA于无RNase的电泳槽中进行琼脂糖凝胶电泳检验Total RNA质量(见图I)。2.第一链cDNA合成用反转录试剂盒(购自TIANGEN公司)将RNA反转录为cDNA。具体方法为取1-5 V- g Total RNA,向冰浴的无RNase的I. 5ml离心管中加入2 y Ioligo(dT)和 2ii IdNTP (2. 5mM each)，用 RNase-free ddH20 补足体系至 14. 5 u I ;70°C加热5分钟后迅速在冰上冷却2分钟,离心收集反应液,加入4 u I 5 X First-Strand Buffer(含 DTT)和 0. I RNasin ;加入 I ii I TIANScript M-MLV (200U/y 1)，轻轻混匀；25°C温浴10分钟，42°C温浴50分钟；95°C加热5分钟终止反应，_20°C保存。3. RT-PCR :在无菌的离心管中依次加入 5 y 110 X PCR Buffer, I. 5u I 50mMMgCl2,1 u I IOmMdNTP mix,2u I IaaUp 引物(10 y M)，2 y I 184aaDn 引物(10 y M)，0. 4 y ITaq DNApolymerase (5U/ ii I)和 I cDNA (第一链反应液)，ddH20 补足体系至 50 ii I ;混匀后，95°C预变性5分钟，94°C变性30秒，53°C退火30秒，72°C延伸45秒，30个循环，72°C延伸10分钟；1%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带特异性(见图2);回收目的DNA片段，连接PEasy Tl载体(购自TransGen公司)，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆子(白斑)测序。4.利用3’ RACE技术扩增permatin基因3’末端序列根据获得部分permatin 基因5’端cDNA序列设计特异性正向引物124aaUp 5’ -CAACACGCCAATAAGCTTCCAG-3’与3’RACE Outer Primer和Inner Primer进行巢式PCR。具体方法如下4. I用3’ RACE试剂盒(购自TAKARA公司)自带试剂合成cDNA第一链在无RNase的离心管中依次加入 I U I Total RNA (I U g/u I), I U I 3’ RACE Adapor, 2 u I 2 X M-MLVBuffer,Iu IdNTP Mixture(IOmM each),0. 25 u I RNase Inhibitor (40U/u I),0.25 u IReverse Transcriptase M-MLV (2000U/ U 1),4. 5 U I RNase-free ddH20,轻轻混勻；42°C 温浴60分钟，70°C加热15分钟终止反应，-20°C保存。4.2 Outer PCR反应在无菌的微离心管中依次加入2 ii I上述反转录反应液，8 ill IXcDNADilution Buffer II，2 y I 特异性上游引物 124aaUp (10uM),2u I 3’RACEOuter Primer, IOu 15 X TransStart FastPfu Buffer, Iul TransStart FastPfu DNAPolymerase高保真酶(购自TransGen公司)，25 u I ddH20,轻轻混勻;94°C预变性3分钟， 94°C变性30秒，53°C退火30秒，72°C延伸60秒，20个循环，72°C延伸10分钟；_20°C保存。4. 3Inner PCR反应在无菌的微离心管中依次加入I iU 1st PCR产物，
5u IlOXTransTaq HiFi Buffer II，2 y I 特异性上游引物 124aaUp (10 y M)，2 y I 3’RACEInner Primer, 4 u I dNTP (2. 5mMeach), Iul TransTaq HiFi DNA Polymerase (购自TransGen公司)，补ddH20至50 yl，轻轻混匀；94°C预变性3分钟，94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸45秒，30个循环，72°C延伸10分钟；1%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带特异性(见图3);回收目的DNA片段，连接pEasy Tl载体，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆子(白斑)，测序。5.重叠PCR技术(S0E PCR)扩增permatin基因全长测序分析后，根据获得的cDNA 3’末端序列设计带EcoR I限制性内切酶酶切位点的permatin基因反向引物225aaDn 5’ -TGAATTCCAATTAAGGGCAGAGCACG-3，(划线部分为限制性内切酶酶切位点)，用SOEPCR技术扩增permatin全长，具体方法为分别以pEASY-Tl-Permatin (laa_184aa)，pEASY-Tl-Permatin (124aa_C 末端)为模板，laaUp/184aaDn和124aaUp/225aaDn为引物，用高保真酶进行PCR ;分别回收Permatin l_184aa, Permatin 124_225aa 基因片段各 30 U I 作为 SOE PCR 的模板；在无菌的微离心管中依次加入 30. 5 ii I ddH20, 5 u I IOXTransTaq HiFi BufferII,4u I 2. 5mMdNTP, 3 u I Permatin l_184aa 基因片段，3 y I Permatin 124_225aa 基因片段，轻轻混匀;94°C预变性3分钟，94°C变性30秒，53°C退火30秒，72°C延伸30秒，5个循环；再依次加入2 U I 上游引物 Iaa Up, 2 U I 下游引物 225aa Dn, 0. 5 U I TransTaq DNA Polymerase HighFidelity，轻轻混勻;94°C预变性3分钟，94变性30秒，53 °C退火30秒，72 °C延伸60秒，30个循环，72°C延伸10分钟；1%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带特异性(见图3)。将permatin基因全长的PCR产物回收后测序分析，经序列测定表明扩增产物从ATG到TAA的读框为678bp核苷酸片段，Blast比对结果表明该基因编码的氨基酸序列与禾本科植物TLP有较高的同源性。其中与设计引物时所参考的permatin precursor [Avenasativa](登录号为AAB02259. I)ORIGIN序列同源性为82. 7%，与其他来源的PRP同源性如下Triticum aestivum TLP (AAM15877. 1)81. 8% ；Barley TLP7 (548125)84. 4% ；Zeamatinprecursor (NP_001105356. I) 55. 6% ；Barperml (AAB71680. I) 86. 2% (见图 4)。实施例2 Permatin基因原核表达载体的构建取15 ill permatin基因PCR产物回收产物与I ii I pMAL_2c原核表达载体质粒分 别用EcoRI和BamHI (均购自TaKaRa公司)限制性内切酶37°C酶切2小时，反应体系分别为60 Ul和20 Ul ;然后将两个酶切反应体系混合后，加入等体积的80 Ul酚/氯仿(I : I )，震荡混匀，13000rpm离心10分钟；小心吸取上层清液，加入1/10体积的3M NaAc (pH5. 2)，混匀后再加入2倍体积的无水乙醇(_20°C预冷)，-20°C下静置30分钟；13000rpm离心10分钟，弃去液体；加入100 u I 75%乙醇洗涤一次；室温下干燥至管底无液体残留；依次加入7. I 的 ddH20, 2 u I 5XT4DNA Ligase Buffer 和 0. 5 y I T4DNA Ligase (200U/u I)(购自TransGen公司);25°C水浴40分钟；将连接产物加入100 用氯化钙制备的E. Coli XlO感受态细胞中，冰浴30分钟，42°C热休克90秒，冰浴2分钟；加入200 u I 37°C预热的LB液体培养基，37°C培养I小时；4000rpm离心2分钟后弃去200 U I上清液，将剩于清液与沉淀轻轻混匀；将悬液涂布在含IOOii g/ml的氨苄青霉素平板上；37°C倒置培养12小时；用自身引物筛选阳性重组子，并测序分析。实施例3 Permatin基因的重组表达及纯化将插入Permatin基因的重组子进行质粒抽提，取I ill转化E. Coli BL21感受态细胞中，冰浴30分钟，42°C热休克90秒，冰浴2分钟后将悬液涂布在含100 u g/ml的氨苄青霉素平板上；37°C倒置培养12小时；从平板上挑取单菌落于5ml LB(含100 u g/ml的Amp)液体培养基中，37°C培养12小时；取上述预培养菌按1%的接种量转接于500ml LB(含100 y g/ml的Amp)液体培养基，37°C震荡培养2_3小时至0D_在0. 6-0. 8时加入IPTG使其终浓度达到0. 3mM，37°C震荡培养4小时，8000rpm离心10分钟收集菌体；用适量的pH8. 020mMTris-HCl (含500mM NaCl)缓冲液将菌体悬起，超声破碎细胞；11000rmp离心30分钟，收集上清；上清经0. 22 ii m的微孔滤膜过滤后，上样至已用20mM Tris-HCl pH8. 0 (含500mMNaCI)缓冲液平衡好的Amylose亲和柱，结合30分钟；用20mM Tris-HCl pH8. 0 (含500mMNaCl)缓冲液洗脱至无蛋白穿出；用20mM Tris-HCl pH8. 0 (含500mM NaCl，IOmM麦芽糖)洗脱液洗脱目的蛋白；目的蛋白洗脱液经浓缩后，上样至已用20mM Tris-HCl pH8. 0 (含50mM NaCl)缓冲液平衡好的S印hacryl-200凝胶层析柱进行纯化，收集目的蛋白洗脱样；12% SDS-PAGE (见图 5)。实施例4 Permatin蛋白体外抑菌实验抗真菌实验采用牛津杯法。具体方法为首先配制PDA培养基(主要成分为200g土豆，20g葡萄糖，2g磷酸二氢钾，Ig结晶硫酸镁，IOmg VB1),将菌株(白腐菌、毛壳菌、红曲霉)点种于培养基的中心，于30°C条件下培养，当其菌落直径长至l_2cm时在菌落的外围加入灭菌的牛津杯，将该样品和不含该样品的其他条件完全相同的含50mmol/L NaCl的20mmol/LTris-HCl, pH8. 0缓冲液通过滤膜除菌加入牛津杯内，于4°C放置24h使其充分扩 散，然后将平板放入30°C培养箱中进行过夜培养，并进行菌丝生长状况的观察(见图6)。结果表明，permatin对白腐菌的抑菌效果最明显(图6A),毛壳菌次之(图6B),对红曲霉的抑制效果最不明显(图6C)，且存在剂量依赖性，其最小抑菌浓度为30ii g/mL。
权利要求
1.一种莜麦病程相关蛋白的基因，其核苷酸序列为SEQ ID N2 :1。
2.权利要求I所述的基因编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQID No :2。
3.权利要求I所述的莜麦病程相关蛋白的基因在培育抗病作物中的应用。
4.权利要求2所述的莜麦病程相关蛋白在制备抑菌剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种莜麦病程相关蛋白的基因及其编码的蛋白。是应用RT-PCR及3'RACE技术从莜麦幼苗中分离出了一个678bp的病程相关蛋白基因，该基因的核苷酸序列为SEQID No1。该基因编码的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No2。本发明的莜麦病程相关蛋白的基因，可用于培育抗病作物；该基因编码的蛋白，可用于开发绿色抑菌剂等。
文档编号C12N15/29GK102703472SQ201210175029
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者石亚伟, 韩德平 申请人:山西大学