一组特异识别黄曲霉毒素B₁的寡核苷酸适配子的制作方法

专利名称：一组特异识别黄曲霉毒素B₁的寡核苷酸适配子的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及到利用分子生物学技术中的SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)制备一组与黄曲霉毒素B1高特异性和高亲和力的核酸适配予，为该核酸适配子在检测黄曲霉毒素B1中的应用提供科学依据和理论基础。
背景技术：
黄曲霉毒素(aflatoxins，AF)主要是黄曲霉菌和寄生曲霉菌的二次代谢产物，其化学结构类似，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。目前已确 定黄曲霉毒素结构的有AFBpAFB2、AFM1等18种，它们的基本结构中都含有二呋喃环和氧杂萘邻酮(又名香豆素)，前者为其毒性结构，后者可能与其致癌有关。黄曲霉毒素耐高温，通常加热处理对其破坏很小，只有在熔点温度下才发生分解。黄曲霉毒素遇碱能迅速分解，但此反应可逆，即在酸性条件下又复原。在温暖潮湿气候地区的粮食和饲料，凡被黄曲霉菌和寄生曲霉菌污染都可能存在黄曲霉毒素。黄曲霉毒素最易污染花生、玉米、棉籽、禽蛋、肉、奶及奶制品，其次是小麦、高粱和甘薯，大豆柏被黄曲霉毒素污染的程度轻些。我国粮食和饲料被黄曲毒素污染率很高，给饲料企业和养殖业主带来了很大损失。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为I类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡，在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强，其致癌力是奶油黄的900倍，比二甲基亚硝胺诱发肝癌的能力大75倍，比3，4_苯并芘大4000倍。它主要诱使动物发生肝癌，也能诱发胃癌、肾癌、直肠癌及乳腺、卵巢、小肠等部位的癌症；其毒性远远高于氰化物、砷化物和有机农药，比氰化钾大100倍，比砒霜大68倍。因此，如何快速、准确检测出黄曲霉毒素B1具有重要研究意义。目前，对真菌毒素B1的检测方法应用最多的是抗原抗体法即免疫学方法，但这种方法需要制备特异性的抗体，抗体具有不稳定性，制备的成本较高而且不宜保存，受免疫原性等的限制。这些不足制约了免疫学方法在真菌毒素领域中的应用。而且目前存在的检测方法检测限普遍较高，不适合真菌毒素中毒具有隐蔽性和微量性的特点。因此，建立新的对真菌毒素尤其是黄曲霉毒素B1为典型代表的快速而灵敏的检测方法尤为必要。近些年来，寡核苷酸适配子作为抗体分子的前景性替代分子，其研究较为引人注目。寡核苷酸适配子是通过SELEX过程筛选的与靶物质特异性结合的一簇小分子DNA或RNA片段。SELEX技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,系统进化指数富集技术)是20世纪90年代初研制的一种新的组合化学技术，是一种研究核酸结构和功能的有效方法。其基本原理是体外化学合成一个随机单链寡核苷酸库，用它与靶物质混合形成靶物质-核酸复合物，洗去未与靶物质结合的核酸分子，分离与靶物质结合的核酸分子，以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进行下轮的筛选过程。通过数轮重复筛选与扩增，最后得到高亲和力和高特异性的寡核苷酸适配子即Aptamer。利用SELEX技术筛选获得的Aptamer识别分子的模式与蛋白抗体类似，但与蛋白类抗体相比，适配子具有更明显的优越性，如不依赖动物细胞，不受免疫条件和免疫原性限制，适配子的筛选完全在体外进行，具有时间、质量和数量上的选择弹性，可以在合成时精确、定点、随意连接其他功能基团和分子；适配子变性与复性可逆且速度快，可反复使用、长期保存和室温运输；靶分子范围更广，除蛋白质、核苷酸大分子外，还有小分子(如染料、可卡因、咖啡因和茶碱等)、生长因子、肽链、类固醇、糖类、辅因子(如FMN等)，甚至可用于完整的细胞、病毒、孢子等；与靶分子结合具有更强的特异性和亲和力，不受组织或样品中非靶蛋白的干扰，可以在靶目标性质未知的情况下筛选出其相应的适配子；适配子通过占据靶物质表位，使疾病得到控制，作为临床药物的治疗，已显现了潜在的应用前景，已有研究通过SELEX技术筛选到相应靶物质的适配子作为拮抗剂，抑制肿瘤生长时的血管内皮生长因子、血栓生成因子、ー些毒素蛋白等的作用，以达到治疗目的。在微生物检测方面，特别是对ー些致病性细菌或病毒的研究，虽然不知道其内部结构、功能及这些物质的表位，但将其作为靶物质，通过SELEX过程筛选到与其对应的适配子，检测靶物质，已成为该领域的研究探索热点。鉴于SELEX技术相对于传统抗原抗体技术的优势，具有更高的选择性，特异性和亲和性，以及能区分结构极其相似的物质的特性，而且目前SELEX技术主要应用在整体菌 及细胞等大分子的筛选中，在小分子领域尤其是真菌毒素的应用中很少，据报道筛选出的真菌毒素适配体只有赭曲霉毒素和伏马菌素的适配子，若能筛选出黄曲霉毒素B1的适配子对真菌毒素的检测将有重要的意义，同时也将推动SELEX技术在小分子领域的发展，也是SELEX技术自身的完善。本发明以食品和粮食中常见的黄曲霉毒素B1为靶标，利用SELEX技术获得了与黄曲霉毒素B1特异性结合的核酸适配子序列，该序列可以快速、准确检测黄曲霉毒素B1，由于单链DNA寡核苷酸适配子性能稳定、合成方便且廉价、经修饰后可直接用于荧光或化学发光、发色方法检测黄曲霉毒素B1，因此操作简单、直接。该发明可以在食品安全检测、临床医学等领域得到广泛应用。

发明内容
本发明目的在于提供ー种真菌毒素检测方法，特别涉及ー种利用适配子技术快速、准确检测黄曲霉毒素B1的方法。本发明方法利用指数级富集配体的系统进化技术(SELEX技术)，以黄曲霉毒素B1为靶标，筛选获得与靶标高亲和性特异结合的适配子，通过羧基荧光素(FAM)标记方法达到快速、准确诊断食品或粮食中黄曲霉毒素B1的目的。本发明的优点(I)与蛋白类的抗体相比，单链寡核苷酸更为稳定；Aptamer可直接体外合成、标记，不需要标记的ニ抗，使得操作更为简单、迅速;Aptamer的合成成本较抗体制备成本低，周期短。(2)该序列是从结构显著、与靶标具有不同亲和カ的9条适配子序列中选取出的亲和カ和特异性均最強的一组适配子序列，能够特异识别黄曲霉毒素


图I是第ト10轮筛选得到的AFbi-SSDNA变性聚丙烯酰胺电泳图
图2是AFBfaptamer饱和结合曲线3是AFBfaptamer特异性图表I代表适配子与AFBi的解离常数
具体实施例方式下面是通过SELEX技术筛选特异结合部分适配子与AFBl的解离常数的核酸适配子制备方法及其快速检出部分适配子与AFB1的解离常数方面的应用。I、合成随机单链DNA文库和引物(IDT公司合成)随机单链DNA(ssDNA)文库5’_AGCAGC ACA GAG GTC AGATG(N40)CCTATGCGT GCTACC GTG AA-3’，构建了长度为80nt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间为40·个碱基的随机序列，库容量为IO14以上；引物I :5’ -AGCAGCACAGAG GTCAGATG-3’ ；引物II 5’-P04-TTC ACG GTA GCA CGC ATA GG-3’，将随机ssDNA文库和两种引物均用TE缓冲液配制成100 u mo I/L贮存液_20°C贮存备用。2、双链 DNA (dsDNA)及单链 DNA (ssDNA)文库的 PCR 扩增取2mol随机ssDNA文库(第二轮开始每次加入200pmol)加入500 U L结合缓冲液 BB(pH7. 0 :100mmol/L NaCI,20mmol/L Tris-HCl pH7.6,2mmol/L MgCl2,5mmol/L KCl,lmmol/L CaCl2,0. 02% Tween20)，95°C水浴 5min，冰浴 5min 然后取 200 u L 连有目标物质AFB1的磁珠，事先用BB冲洗，用磁铁将其吸附在管子底部弃上清，然后将冰浴产物加入其中37°C摇床孵化2h。将孵化体系用混匀器震荡20s，加磁铁弃上清，反复用BB冲洗5次，每次lmL。在磁珠中加入洗脱缓冲液I XPCR扩增缓冲液100 u L，95°C水浴5min，冰浴5min，迅速震荡20s加磁铁将上清吸出即为洗脱液，再在磁珠中加入IOOii LI XPCR扩增缓冲液重复洗脱。将两次洗脱液混匀作为模板PCR加样模板5 u L，上下游引物各I U L，dNTPl u L，10XPCR扩增缓冲液5 ii L，灭菌水36. 5 ii L，Taq酶0. 5 ii L,总体积为50 y L在95°C 5min,95°C 30s, 60°C 40s, 72°C 30s，循环 30 次，72°C 7min, 12°C 2min 条件下扩增。将扩增产物用6 X DNA凝胶上样缓冲液(溴酚蓝0.25%，蔗糖40 %，水59. 75 % )跑变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，验证扩增是否成功，然后在同样条件下进行大批量扩增以备纯化和单链制备，将酶切好的单链置4°C环境中储存备用，进行下ー轮的筛选。3、筛选所用黄曲霉毒素B1的获取与处理黄曲霉毒素B1属于小分子，要与SELEX技术结合必须借用一定的载体，首先选择了氨基化的磁珠作为载体，然后对黄曲霉毒素B1进行了活化使其带上羧基，采用EDC-NHS连接方法将黄曲霉毒素B1固定在磁珠的表面，表征活化连接成功后4°C环境中储存备用。4、克隆和测序将第十轮富集的ssDNA文库，PCR扩增为双链，送上海生エ生物技术有限公司进行DNA序列測定，获得30条适配子序列。5、适配子序列结构分析采用DNAMAN软件和RNA Structure4. 2软件分别对适配子序列进行ー级结构和ニ级结构分析，获得30条序列的同源性信息和ニ级结构图谱。结合一级结构同源性和ニ级结构将序列分为9个家族，从每个家族中选出I条结构稳定，能级较低的序列为代表进行下一步鉴定，共9条。
6、适配子与黄曲霉毒素B1亲和力和特异性测定6. I适配子亲和力分析根据AFB1Iptamer的一、二级结构特征，把测序得到的所有序列进行分组，从每组中挑选出能级较低，结构较稳定的一条序列，由上海生工合成并在其5’端标记生物素。将合成的9条标有生物素的AFBi-aptamer与亲和素化的磁珠组装成适配体探针，用BB分别稀释成10、20、40、60、80、100、120、150鹽01/1，再在上述不同浓度适配子的溶液中加入AFB1 (应用中的AFB1用甲醇-BB溶解)，使AFB1的最后浓度为1000ng/L，37°C、3000rpm摇床孵育lh，磁分离弃上清，用BB反复冲洗5次，在激发波长375nm，发射波长425nm,电压800V下测磁珠上的荧光强度，平行三次，应用GraphPad Prism5软件计算各个代表序列的解离常数&值，并绘制各不同浓度适配子对AFB1的饱和曲线，结果如图2所示。
表I
权利要求
1.ー组特异识别黄曲霉毒素B1的寡核苷酸适配子，其寡核苷酸序列为 1)序列表中序列1、2、3所示的序列； 2)序列表中序列1所示的核苷酸序列经替换、缺失和/或者插入ー个或几个核苷酸形成的具有序列表中序列1同等功能的序列； 3)序列表中序列2所示的核苷酸序列经替换、缺失和/或者插入ー个或几个核苷酸形成的具有序列表中序列2同等功能的序列； 4)序列表中序列3所示的核苷酸序列经替换、缺失和/或者插入ー个或几个核苷酸形成的具有序列表中序列3同等功能的序列。
2.权利要求1所述的寡核苷酸适配子在检测食品中黄曲霉毒素B1方面的应用。
3.根据权利要求2中所述的应用，其特征在于所述寡核苷酸适配子的5’端或3’端可以经过FITC,或FAM,或生物素,或地高辛标记。
全文摘要
本发明公开了一组黄曲霉毒素B1的寡核苷酸适配子。通过SELEX技术获得了能够特异识别黄曲霉毒素B1的单链DNA寡核苷酸适配子，该适配子可以通过荧光素标记等转为报告适配子用于检测黄曲霉毒素B1，该适配子序列在准确、快速检出食品中的黄曲霉毒素B1方面具有广泛应用前景。
文档编号C12N15/115GK102952802SQ201210370140
公开日2013年3月6日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者王周平, 王文凤, 段诺, 吴世嘉, 夏雨, 马小媛 申请人:江南大学