醛和相应醇的微生物合成的制作方法
【专利摘要】一种改良的醇生产过程，包括使用遗传修饰的微生物进行微生物发酵产生显著量的醛，从发酵培养基中气提醛并冷凝。在体外过程中将这样产生的醛转化为相应的醇。
【专利说明】醛和相应醇的微生物合成
[0001] 本申请要求获得我们共同待决的于2011年3月14日提交的美国临时专利申请系列号61/452，519的优先权。
发明领域
[0002]本发明的领域是对微生物的代谢工程，以产生一种或多种化学品，特别是醛，然后将它们分离并在体外转化成相应的醇。
[0003]发明背景
[0004]2005年，全世界生产和消耗醛和其它羰基化学品(oxo-chemical)将近960万公吨。由于需求强烈、产量增加和产能合理化(rationalized capacity), 2005年全球的产能利用率(capacity utilization)提高到了 84%，而 2001 年为 79%。2001 年-2005 年，世界醛和其它羰基化学品的产能以1.6%的平均年增长率增加，低于世界的消耗率。在同期，世界的消耗率以平均3.4%的平均年增长率增加。
[0005]最常见地，目前醛和其它羰基化学品的生产是通过使用来自原油裂解的石油化学品进行精炼的方法。例如，C3-C15醒的产生是通过石腊与合成气(synthesis gas)的氢甲酰化反应，然后将所生产的醛转化成相应的醇、酸或其它衍生物。目前，最高需求的羰基化学品是正丁醛，随后是用于生产增塑剂醇的C6-C13醛，和用于生产去污剂醇的异丁醛和C12-C18 醒。
[0006]使用代谢工程化的微生物进行微生物合成生物燃料，特别是生产C2-C6醇，在本领域是众所周知的。例如，在W094/06924中描述了从碳水化合物进行微生物乙醇生产，美国专利N0.8，048, 666中报道了从C02进行乙醇生产。在美国专利申请N0.2009/0081746中描述了使用代谢工程化细胞从2-酮酸生产短链醇，并且有许多发表的文章涉及从代谢工程化细胞生产异丁醇(例如美国专利Nos.7，851，188和7，993，889，和W02009/086423, W02009/149240, W02010/062597,和 W02010/075504)，在 US2011/0250660 中描述了使用光合活性微生物从 C02 生产醇。Kechun Zhang 等在 Proc.Nat.Acad.Sc1.(2008)，105, n0.52:20653 -20658中也描述了相似的方法。在美国专利申请N0.2011/0201083中描述了使用代谢工程化细胞从2-酮酸生产C5-8醇，在美国专利N0.8，097，439中报道了从各种碳源生产脂肪醛。本文通过援引并入这些和在这里所讨论的全部其它外部材料的全部内容。当在并入的参考文献中定义或使用的术语与这里所提供的该术语的定义不一致或相互矛盾时，采用这里所提供的该术语的定义，而不使用该术语在参考文献中的定义。
[0007]不幸的是，这些方法中有很多用来生产的醇的产量仍然相对较低。为了提高至少某些特定醇的产量，可以删除或抑制内源的醇脱氢酶，或者用重组脱氢酶代替它们，如W02009/149240A1中所述。尽管这些修饰经常在至少一定程度上符合期望，但是产生了其它的问题。例如，各种醇在高于阈值浓度的情况下对产生醇的细胞是有毒的，从而趋向于对整体产量产生限制。而且，大多数微生物合成的醇可以与发酵培养基完全混溶，需要相当耗能的过程进行分离。然而更糟糕的是，一些醇是共沸混合物，更难以从培养基中分离。
[0008]因此，尽管本领域已知有许多生产醛-羰基化学品和相应醇的系统和方法，但是仍然存在一些困难。因此，仍然需要有改进，特别是在使用微生物细胞生产这些化学品的情况下。
[0009]发明简沭
[0010]本发明涉及使用混合的合成过程来生产醛和醇化合物的设备和方法，所述过程中，代谢工程化的微生物细胞利用碳源产生醛，然后将所述醛连续地或半连续地在汽相中从发酵培养基移出。在特别优选的方面中，代谢工程化的微生物细胞基本上没有任何醇的产生。醛然后从汽相中冷凝，并在体外被还原成相应的醇。预期的方法有利地克服了各种困难，特别是与产物抑制和从发酵培养基中分离醇相关的各种问题。
[0011]在本发明主题的一个方面中，生产醇的方法包括在发酵培养基(优选地具有葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、纤维素、半纤维素、甘油、二氧化碳、蛋白质、脂质和/或氨基酸作为碳源)中培育多个微生物细胞的步骤，其中该细胞被遗传修饰从而与非遗传修饰的细胞相比具有增加的代谢活性。特别优选的是，增加的代谢活性是丙酮酸或2-酮丁酸向醛的转化增加，和醇脱氢酶活性降低。细胞产生的醛被连续地或半连续地在汽相中从发酵培养基移出。在另一个步骤中，将醛从汽相中冷凝，在另外一个步骤中，将冷凝的醛还原成相应的醇。
[0012]在一些实施方案中，增加的代谢活性是丙酮酸通过重组的丙酮酸脱羧酶向乙醛的转化增加，而在其它实施方案中，增加的代谢活性是2-酮丁酸通过重组的2-酮异戊酸脱羧酶向丙醛的转化增加。并且/或者，优选的是，该微生物细胞通过重组的2-酮异戊酸脱羧酶而在对2-酮戊酸、2-酮己酸、2-酮庚酸、2-酮辛酸、2-酮-3-甲基戊酸、2-酮-4-甲基己酸、2-酮-5-甲基庚酸、2-酮 -6-甲基辛酸、2-酮-异戍酸、2-酮-异己酸、2-酮-5-甲基己酸、或2-酮-6-甲基辛酸中的一种或多种的脱羧中的代谢活性也增加。因此，特别优选的发酵产物包括乙醛、丙醛、丁醛和2-甲基-1-丙醛。
[0013]在更进一步的预期方面中，所述微生物细胞通过重组的ilvGMCD基因或重组的ilvBNCD基因而在将2_丽丁酸分支碳链延伸(branched carbon chain elongation)而成为2-酮-3-甲基戊酸中具有增加的代谢活性，和/或通过重组的alsS-1lv⑶基因或重组的ilvIHCD基因而在将丙酮酸分支碳链延伸成为2-酮-3-异戊酸中具有增加的代谢活性。更进一步尤其优选地，所述微生物细胞通过重组的IeuABCD基因而在直碳链延伸中也具有增加的代谢活性。
[0014]尽管不对本发明构成限制，一般优选地，微生物细胞中醇脱氢酶的活性与非遗传修饰的细胞相比降低至少70%，更典型地至少90%。
[0015]在特别优选的方法中，在汽相中除去醛的步骤包括搅拌发酵培养基，用惰性气体气提(stripping)发酵培养基，用含有氧的气体气提发酵培养基，和/或将醛与结合剂暂时结合。更典型地，将醛连续地从发酵培养基移出。然后将如此分离的醛还原成相应的醇，例如通过使用电化学还原、酶还原和/或利用氢的催化还原。
[0016]合适的微生物细胞从如下的属中选出:埃希氏菌属，芽孢杆菌属，棒状杆菌属，罗尔氏菌属(Ralstonia),发酵单胞菌属(Zymomonas),梭菌属，乳杆菌属(Lactobacillus),聚球藻属(Synechococcus),集胞藻属(Synechocystis),酵母属，毕赤酵母属，假丝酵母属，汉逊酵母属，和曲霉属。因此，特别优选的微生物细胞包括大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，细长聚球藻(Synechococcus elongatus),真养罗尔氏菌(Ralstonia eutropha),和酿酒酵母。[0017]因此，从不同的角度考虑，产生代谢工程化的微生物细胞用于在体外从醛产生有价值的产物(例如醇)的生产过程的方法，包括:遗传修饰微生物细胞使其丙酮酸或2-酮丁酸到醛的转化增加的步骤，和进一步地遗传修饰微生物细胞使其醇脱氢酶活性降低，从而使该微生物细胞基本上没有醇产生的步骤。在另外一个步骤中，对经修饰的微生物细胞的下述性质进行检验:在发酵培养基中产生挥发性醛，其产量足以允许挥发性的醛从发酵培养基中气提，从而允许在体外将醛转化成有价值的产物(例如将醛还原成相应的醇)。
[0018]在特别优选的方面中，所述微生物细胞通过重组的丙酮酸脱羧酶将丙酮酸转化成乙醛的代谢活性增加，或者通过重组的2-酮异戊酸脱羧酶将2-酮丁酸转化成丙醛的代谢活性增加。并且/或者，所述微生物细胞通过重组的IeuABCD基因具有更高的直碳链延伸代谢活性，和/或通过重组的ilvGMCD基因或重组的ilvBNCD基因具有更高的将2-酮丁酸分支碳链延伸成为2-酮3-甲基戊酸的代谢活性，或者通过重组的alsS-1lvCD基因或重组的ilvIHCD基因具有更高的将丙酮酸分支碳链延伸成为2-酮-异戊酸的代谢活性。
[0019]本发明的各种目标、特征、方面和优点将通过如下优选实施方案的详细描述以及相应的附图变得更加显而易见，附图中同样的数字代表同样的组分。
[0020]附图简沭
[0021]图1A是产生直链醒的代谢通路的示意图。
[0022]图1B是产生分支链醛的代谢通路的示意图。
[0023]详细说明
[0024]本发明人已经发现，微生物细胞能够被代谢工程化而实质性增加各种(特别是挥发性的)醛的产生，它们不会 或者仅以可忽略的程度被进一步代谢成相应的醇。这种方法是特别出人意料的，因为醛通常具有比相应的醇更明显的毒性，并且由于内源醇脱氢酶的抑制，醛会以更快的速度产生(并在细胞内潜在积累)。然后，以连续或半连续的方式(即以间歇性的方式，在整个发酵过程中使用至少两个除去周期)将如此产生的醛在汽相中从发酵培养基中移出，优选通过用气提气(stripping gas)气提该培养基而移出。
[0025]在本发明的特别优选的方面中，微生物细胞被遗传修饰，从而具有更高的将丙酮酸或2-酮丁酸转化成醛的转化，以及降低的醇脱氢酶活性。丙酮酸或2-酮丁酸向醛的转化的增加最典型地是由于存在一种或多种这样的核酸构建体(例如作为质粒提供和/或整合到宿主细胞基因组中)，其编码导致可催化丙酮酸或2-酮丁酸转化为醛的反应的酶的形成的一个或多个基因。因此，在大多数情况下，转化的增加是由于代谢产物通过细胞内通向期望的醛终产物的生化反应序列的通量增加所致。当然，应当意识到，一种或多种内源(非重组)酶可能是所述的细胞内生化反应序列的一部分。
[0026]图1A描述了一组用于增加细胞内直链醛的产生的代谢工程化通路的实例。这里，从丙酮酸通过丙酮酸脱羧酶(Pdc)形成乙醛，从2-酮异戊酸(2-KB)通过2-酮异戊酸脱羧酶(kivD)形成丙醛。为了产生更长链的产物，包括丁醛、戊醛、己醛、庚醛、辛醛等，代谢工程化通路可以进一步包括编码2-异丙基苹果酸合酶(LEUA)，3-异丙基苹果酸脱氢酶(IeuB), 3-异丙基苹果酸异构酶大亚基(IeuC),和3-异丙基苹果酸异构酶,小亚基(IeuD)的基因。最优选地，这些基因被组织成处于合适控制下的操纵子，用于在细胞内表达。因此，被工程化而表达IeuAB⑶和kivD的细胞适合用于如图所示从2-酮丁酸产生丁醛、戊醛、己醛、庚醛等，通过从2-KB起连续链延伸成为2-酮戊酸(2-KV)、2-酮己酸(2-KC)、2-酮庚酸(2-KH)和2-酮辛酸(2-KO)，最后脱羧。
[0027]图1B描述了另一组用于增加细胞内分支链醛的产生的代谢工程化通路的实例。这里，在如下基因产物的作用下，将2-ΚΒ分支化成2-Ket-3-甲基戊酸(2-K-3-MV):乙酰羟酸合成酶II大亚基(ilvG)，乙酰羟酸合酶II小亚基(ilvm)，乙酰羟酸异构还原酶(ilvC)，和二羟酸脱水酶(ILVD)，或者乙酰羟酸合酶I大亚基(ilvB)，乙酰羟酸合酶I小亚基(ilvN)，乙酰羟酸异构还原酶(ilvC)，和二羟酸脱水酶(ILVD)。然后，2-K-3-MV可以被kivD脱羧形成2-甲基-1-丁醛，或者可以通过由IeuAB⑶编码的蛋白被连续地延伸为2-酮-4-甲基己酸(2-K-4MH)或2-酮-5-甲基庚酸(2_Κ_5ΜΗρ)，随后被kivD脱羧而分别形成3-甲基-1-丙醛和4-甲基-1-己醛(以及更长的分支产物)。当起始材料是丙酮酸时，丙酮酸首先被乙酰乳酸合酶(alsS)、乙酰羟酸异构还原酶(ilvC)、和二羟酸脱水酶(ILVD)基因的表达产物分支化，这些基因优选地组织成功能性的表达盒子alsS-1lv⑶；或者被乙酰羟酸合酶III (ilvl)的大亚基、乙酰羟酸合酶III (ilvH)的小亚基、乙酰羟酸异构还原酶(ilvC)、和二羟酸脱水酶(ILVD)基因的表达产物分支化而形成2-酮异戊酸(2-KIV)。2-KIV脱羧产生2-甲基-1-丙醛，而通过IeuAB⑶的表达产物进行链延伸产生2-酮异己酸(2-KIC)和2-酮-5-甲基己酸(2-K-5Mhx)和更高级的产物。如前文所述，2-KIC和2_K_5Mhx随后被脱羧成为相应的3-甲基-1- 丁醛和4-甲基-1-戊醛，和更高级的产物。
[0028]因此，在本发明主题的特别优选的方面中，这里构想的微生物细胞将会通过表达重组ilvGMCD基因或表达重组ilvBNCD基因而在将2-酮丁酸分支碳链延伸为2-酮-3-甲基戊酸中具有增加的代谢活性，和/或通过表达重组alsS-1lv⑶基因或表达重组ilvIHCD基因而在将丙酮酸分支碳链延伸为2-酮-异戊酸中具有增加的代谢活性。
[0029]在更进一步的优选方面中，构想的细胞还将会通过表达重组2-酮异戊酸脱羧酶(优选地kivD)而在对2-酮戊酸、2-酮己酸、2-酮庚酸、2-酮辛酸、2-酮-3-甲基戊酸、2-酮-4-甲基己酸、2-酮-5-甲基庚酸、2-酮-6-甲基辛酸、2-酮-异戍酸、2-酮-异己酸、2-酮-5-甲基己酸、或2-酮-6-甲基辛酸中的一种或多种的脱羧中具有增加的代谢活性，和/或通过表达重组丙酮 酸脱羧酶而在将丙酮酸转化为乙醛中具有增加的代谢活性，和/或通过表达重组2-酮异戊酸脱羧酶而在将2-酮丁酸转化为丙醛中具有增加的代谢活性。在特别优选的方面中，细胞将被进一步遗传修饰，从而通过表达重组IeuABCD基因而具有增加的直碳链延伸的代谢活性。
[0030]当然，应当意识到，所有所述的基因均可以是未被修饰的，或者可以被工程化而赋予期望的选择性、更高的转换率等(见例如Proc.Nat.Acad.Sc1.(2008)，105, n0.52:20653 - 20658;W02009/149240Al)o 对代谢工程化细胞的活性合适的基因在本领域是众所周知的，而且认为结合本文提出的教导来使用所有这些基因都是合适的。而且，认为所有已知的制作代谢工程化细胞的方式也适合于在这里使用。例如，代谢工程化细胞可以通过基因组插入一个或多个基因、操纵子或用质粒或噬菌粒转染来加以修饰，这是本领域众所周知的。在一些实施方案中，在本发明的方法中还可以使用突变体微生物，并可以根据期望进一步进行修饰。
[0031]在进一步的特别优选方面中，内源醇脱氢酶活性至少被降低，更优选被抑制；应当注意，在优选的方面中，所有或者基本上所有的醇脱氢酶将被抑制或删除。例如，被抑制或删除的脱氢酶包括adhE，IdhA，frdB，和pflB。还应当注意，脱氢酶活性可以通过多种众所周知的方式加以抑制或删除，包括下调(例如通过反义RNA或siRNA)或破坏编码脱氢酶的基因，引入敲低(knock-down)或敲除(knock-out)突变等)。结果，构想的遗传修饰细胞的超过I种脱氢酶将被突变或抑制。
[0032]从另一不同的角度看，因此构想经遗传修饰的细胞不会产生任何显著量的短链(最多到C6，直链或分支)醇。例如，相对于相应的醇，这些修饰的细胞会向发酵培养基释放显著更高量的醛，最典型地，醛与相应醇(例如丁醛:丁醇)的摩尔比为至少3:1，更典型地至少4:1，最典型地至少5:1。结果，发酵培养基中总的短链(最多到C6，直链或分支)醇将少于发酵培养基的lwt%，更典型地少于0.5wt%，最典型的少于0.lwt%0因此，在特别优选的方面中，将修饰的细胞不会产生任何可检测的醇(即少于10mg/l发酵培养基)。
[0033]重组微生物可以是任何合适的微生物，包括细菌、蓝藻或真菌。然而，非光合活性微生物是特别优选的。因此，在一些实施方案中，微生物细胞属于从下组选出的属:埃希氏菌属，芽孢杆菌属，棒状杆菌属，罗尔氏菌属，运动发酵单胞属，梭菌属，乳杆菌属，聚球藻属，集胞藻属，酵母属，毕赤酵母属，假丝酵母属，汉逊酵母属，和曲霉属。在优选实施方案中，微生物包括大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，细长聚球藻，真养罗尔氏菌(Ralstoniaeutropha ),和酿酒酵母。
[0034]应当进一步理解，培养条件通常会取决于微生物的具体选择，本领域的普通技术人员可以容易地选择合适的培养基。除了其它合适的选择之外，一般而言优选的是，培养基的碳源为糖类，特别是葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、纤维素、半纤维素、甘油、二氧化碳、蛋白质和/或氨基酸。然而，许多其他碳源也被认为是合适的，其他碳源的实例包括脂质、蛋白质、C02、CH4、复杂的有机混合物(例如生物固体(biosolids)、肉类加工废料、基于植物的材料等)。无论具体的培养条件为何，将挥发性的醛在汽相中从发酵培养基移出。更优选地，这种移出在细胞培养过程中以连续的方式实施，该移出可以是基于搅动发酵培养基、用惰性气体气提发酵培养基、用含氧气体气提发酵培养基、和/或将醛与结合剂暂时结合。或者，醛的移出还可以在发酵之后 实施，或者以半连续的方式实施(例如通过与气提气间歇性接触)。
[0035]关于进一步的处理，应当意识到，醛的冷凝可以通过各种方式实施，优选地使用本领域众所周知的冷凝器，并且这样冷凝的醛产物可以使用常规方式在一个或多个步骤中进一步纯化，或者可以直接用于还原反应以产生相应的醇。本领域已知有许多用于醛的还原反应，认为所有这些均适合于在这里使用。例如，特别合适的还原反应包括电化学还原、酶还原和利用氢的催化还原。
[0036]因此，应当理解，产生供醇生产过程中使用的代谢工程化微生物细胞的方法包括:遗传修饰微生物细胞使之具有更高的从丙酮酸或2-酮丁酸到醛的转化；遗传修饰微生物细胞使之具有更低的醇脱氢酶活性，从而使该微生物细胞基本上没有醇的产生；并测试经修饰的微生物细胞是否在发酵培养基中产生足以容许从发酵培养基中气提、并藉此容许将其在体外还原成相应的醇的量的挥发性醛。
[0037]如果期望，还构想这里提出的细胞不需要用于醇的生产，而是用于产生各种醛，特别是挥发性醛。在这种情况下，将细胞如上所述地加以遗传修饰，并在适合于产生醛的条件下培养。更典型地，随后将如此生产的醛从培养培养基中气提出来，并冷凝供销售、或供进一步使用，或供储存。[0038]此外，应当意识到，构想的方法、细胞和处理还可有利地允许产生除醇之外的期望化合物，如果期望化合物的前体是醛的话。例如，当遗传修饰的细胞的发酵产物是乙醛时，特别优选的从乙醛体外制备的产物是乙醇和乙酸。类似地，当遗传修饰的细胞的发酵产物是丙醛时，特别优选的从丙醛体外制备的产物包括正丙醇、乙酸正丙酯、丙酸、和乙酸丙酸纤维素。同样，当遗传修饰的细胞的发酵产物是正丁醛时，特别优选的从正丁醛体外制备的产物包括正丁醇、乙基己醇、聚乙烯缩丁醛、2-乙基己酸、甲基戊酮、正丁酸、乙酸正丁酯、丙烯酸正丁酯、和乙酸丁酸纤维素。当遗传修饰的细胞的发酵产物是异丁醛时，特别优选的从异丁醛体外制备的产物包括异丁醇、异丁酸、新戊二醇、甲基异戊酮、乙酸异丁酯、丙烯酸异丁酯、2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇，2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇、单异丁酸酯或盐、2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇二异丁酸酯、和异丁酸异丁酯。
[0039]实施例
[0040]DNA操作:实施例使用的是标准的重组DNA技术，它们是本领域技术人员熟知的，如Sambrook J等编辑的《分子克隆:实验室手册》(Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述。
[0041]基因敲除:所有的基因敲除均使用合适的Keio库菌株(Keio collectionstrains) (Construction of Escherichia coli K-12in-frame, single-gene knockoutmutants: the Keio collection, Mol.Syst.Biol.2:2006.0008 (2006))，通过 Pl 转导实现。利用每两个连续敲除之间的 pCP20 (One-step inactivation of chromosomal genes inE.coli using PCR products, Proc.Natl.Acad.Sc1., 97:6640-6645 (2000))除去卡那霉素抗性基因。
[0042]发酵:大肠杆菌菌株在含有合适抗生素的LB中37°C培养过夜。第二天，将过夜细胞在250ml旋盖瓶中亚培养(通常1:100)，瓶中含有10_20ml M9培养基(每升水含有64gNa2HPO4.7H20, 15g KH2PO4, 2.5g NaCl, 5g NH4Cl, 2mM MgSO4, 0.1mM CaCl2, IOmg 硫胺素)和5g/升酵母提取物、40g/升 葡萄糖、和合适的抗生素。随后将培养物在摇床上(250rpm)37°C温育。为了减少异丁醛的损失，在取样前将培养物冷却到4°C达30min。
[0043]GC分析:通过装备有FID (火焰离子化检测器)的气相质谱(GC)对异丁醛和异丁醇加以定量。系统由一个7890A型GC和7693型自动进样器(Agilent Technologies)组成。使用长 30m、内径 0.32mm 的 0.25 μ m DB-FFAP 毛细管柱(Agilent Technologies)。将GC炉温保持在85°C 3min,以45°C /min的梯度升温至225°C并保持3min。检测器和入口温度保持在225°C。所用氢气、空气和氦气的流速分别为40ml/min，450ml/min, 45ml/min。培养肉汤的上清以分流进样模式(split injection mode) (1:25分流比)进样,用1_戍醇作为内参。
[0044]用于异丁醛生产的质粒构建:pEB121:质粒pEB0121通过DNA组装四个节段加以构建。第一个节段含有PLlacOl启动子、pl5A复制起点和卡那霉素抗性基因，用引物I和2 从 pZE21_MCSl 的衍生物(Independent and tight regulation of transcriptionalunits in Escherichia coli via the LacR/0, the TetR/0 and AraC/Il_I2regulatoryelements.Nucleic Acids Res25:1203-10 (1997))中将该节段扩增出来。在该 pZE21_MCSl衍生物中，作为利用AatI和Acc65I限制位点与pZE12_luc进行启动子交换的结果，PLtetOl 被 PLlacOl 所代替(Independent and tight regulation of transcriptionalunits in Escherichia coli via the LacR/0, the TetR/0 and AraC/Il_I2regulatoryelements.Nucleic Acids Res25:1203-10 (1997))。以枯草芽抱杆菌B.subtilis基因组DNA为模板，用引物3和4扩增出第二节段。以大肠杆菌基因组DNA(ATCC10789D-5)为模板，用引物5和6扩增出含有ilvC的第三节段。以大肠杆菌基因组DNA(ATCC10789D-5)为模板，用引物7和8扩增出含有ilvD的第四节段。
[0045]引物1: 5’ -ACGCGTGCTAGAGGCATCAAA-3’ ；引物 2: 5 ’ -TGTACCTTTCTCCTCTTTAATGAATTCGGTCAGTGCG-3，;引物 3:5，-TTAAAGAGGAGAA AGGTACAATGTTGACAAAAGCAACAAAAGAACAAA-3’ ;引物 4:5’-CAT GGTGATTCCTCGTCGACCTAGAGAGCTTTCGITTTCA-3’ ；引物5:5，-GTCGACGAGGAATCACCATGGCTAACTACTTCAATAC-3，;引物 6:5，-ATGGTATATCTCCTTCCGGGTTAACCCGCAACAGCAATAC-3，;引物 7:5，-CCCGGAAGGAGATATACCATGCCTAAGTACCGTTCCGC-3，;引物 8:5，-TTGATGCCTCTAGCACGCGTTTAACCCCCCAGTTTCGATT-3，。
[0046]pEB5:质粒pEB0005通过两个节段的DNA组装加以构建。载体通过用引物9和10 扩增 pZE12_luc (Independent and tight regulation of transcriptional units inEscherichia coli via the LacR/0, the TetR/0 and AraC/Il-12 regulatory elements.Nucleic Acids Res 25:1203-10 (1997))来扩增。Kivd基因用引物11和12从乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)基因组 DNA 扩增。
[0047]引物9:5 ’ -TCTAGAGGCATCAAATAAAACGAAAGG-3 ’ ;引物 10:5 ’ -GGTACCTTTCTCCTCTTTAATGAATTC-3’ ;引物 11:5’ -TTAAAGAGGAGAAAGGTACCATGTATACAGTAGGAGATTA-3’ ；引物12:5’ -TTTTATTTGATGCCTCTAGAATGATTTATTTTGTTCAGCA-3，。
[0048]异丁醒生产宿主菌株的构建:大肠杆菌BW25113 (Datsenko and Warner 2000)用作野生型。为了消除IPTG诱导，首先敲除了 IacI基因。然后，依次敲除主要的醇脱氢酶，以构建用于异丁醛生产的平台菌株EB4 (大肠杆菌BW25113 Δ IacI Δ adhE Δ yqhD Δ yiaY)。去除醇脱氢酶可以通过阻断向异丁醇的转化而增加异丁醛产生，如表1所示(所有菌株均带有两个质粒PEB5和pEB121)。
[0049]表1
[0050]
【权利要求】
1.一种生产醇的方法，包括: 在发酵培养基中培养多个微生物细胞，其中所述细胞被遗传修饰从而与非遗传修饰的细胞相比具有增加的代谢活性； 其中该增加的代谢活性以增加的丙酮酸或2-酮丁酸到醛的转化为特征； 其中所述多个微生物细胞还被遗传修饰从而具有降低的醇脱氢酶活性； 连续或半连续地将醛在汽相中从发酵培养基中移出； 从汽相中冷凝醛；和 将冷凝的醛还原为相应的醇。
2.权利要求1的方法，其中所述微生物细胞通过表达重组的丙酮酸脱羧酶而在丙酮酸到乙醛的转化中具有增加的代谢活性。
3.权利要求1的方法，其中所述微生物细胞通过表达重组的2-酮异戊酸脱羧酶而在2-酮丁酸到丙醛的转化中具有增加的代谢活性。
4.权利要求1的方法，其中该微生物细胞通过表达重组的2-酮异戊酸脱羧酶而在对2-酮戊酸、2-酮己酸、2-酮庚酸、2-酮辛酸、2-酮-3-甲基戊酸、2-酮-4-甲基己酸、2-酮-5-甲基庚酸、2-酮-6-甲基辛酸、2-酮-异戍酸、2-酮-异己酸、2-酮-5-甲基己酸、或2-酮-6-甲基辛酸中一种或多种的脱羧中具有增加的代谢活性。
5.权利要求1的方法,其中所述微生物细胞通过表达重组的iIvGMCD基因或表达重组的ilvBNCD基因而在2 -酮丁酸到2-酮-3-甲基戊酸的分支碳链延伸中具有增加的代谢活性。
6.权利要求1的方法，其中所述微生物细胞通过表达重组的alsS-1lv⑶基因或表达重组的ilvIHCD基因而在丙酮酸到2-酮-异戊酸的分支碳链延伸中具有增加的代谢活性。
7.权利要求4、5或6中任一项的方法，其中所述微生物细胞通过表达重组的IeuAB⑶基因而在直碳链延伸中具有增加的代谢活性。
8.权利要求1的方法，其中所述微生物细胞中降低的醇脱氢酶活性是与非遗传修饰的细胞相比降低至少70%。
9.权利要求1的方法，其中所述微生物细胞中降低的醇脱氢酶活性是与非遗传修饰的细胞相比降低至少90%。
10.权利要求1的方法，其中在汽相中移出醛的步骤包括选自下组的步骤:搅动发酵培养基，用惰性气体气提发酵培养基，用含氧气体气提发酵培养基，和将醛与结合剂暂时结口 O
11.权利要求1的方法，其中移出醛的步骤是连续实施的。
12.权利要求1的方法，其中所述醛选自下组:乙醛、丙醛、丁醛和2-甲基-1-丙醛。
13.权利要求1的方法，其中将冷凝的醛还原成相应醇的步骤选自下组:电化学还原、酶还原和用氢催化还原。
14.权利要求1的方法，其中所述微生物细胞属于选自下组的属:埃希氏菌属(Escherichia)，芽抱杆菌属(Bacillus)，棒状杆菌属(Corynebacterium)，罗尔氏菌属(Ralstonia)，发酵单胞菌属(Zymomonas)，梭菌属(Clostridium)，乳杆菌属(Lactobacillus)，聚球藻属(Synechococcus)，集胞藻属(Synechocystis)，酵母属(Saccharomyces)，毕赤酵母属(Pichia)，假丝酵母属(Candida)，汉逊酵母属(Hansenula),和曲霉属(Aspergillus)。
15.权利要求14的方法,其中微生物细胞属于选自下组的种:大肠杆菌(Escherichiacoli),枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis),细长聚球藻(Synechococcus elongatus),真养罗尔氏菌(Ralstonia eutropha),和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
16.权利要求1的方法，其中发酵培养基具有选自下组的碳源:葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、纤维素、半纤维素、甘油、二氧化碳、蛋白质和氨基酸。
17.—种产生供在体外从醛生产有价值的产物的过程中使用的代谢工程化微生物细胞的方法，包括: 遗传修饰微生物细胞使之具有增加的丙酮酸或2-酮丁酸到醛的转化； 遗传修饰微生物细胞使之具有降低的醇脱氢酶活性，从而使该微生物细胞基本上没有醇产生；和 检验经修饰的微生物细胞是否在发酵培养基中产生足够量的挥发性醛，所述量足以允许从发酵培养基中气提该挥发性醛，藉此允许在体外将该醛转化成所述有价值的产物。
18.权利要求17的方法，其中所述微生物细胞通过表达重组的丙酮酸脱羧酶而在丙酮酸到乙醛的转化中具有增加的代谢活性，或者通过表达重组的2-酮异戊酸脱羧酶而在2-酮丁酸到丙醛的转化中具有增加的代谢活性。
19.权利要求17的方法，其中所述微生物细胞通过表达重组的IeuAB⑶基因而在直碳链延伸中具有增加的代谢活性。
20.权利要求17的方法，其中所述微生物细胞通过表达重组的ilvGMCD基因或表达重组的ilvBNCD基因而在2-酮丁`酸到2-酮-3-甲基戊酸的分支碳链延伸中具有增加的代谢活性，或者通过表达重组的alsS-1lv⑶基因或表达重组的ilvIHCD基因而在丙酮酸到2-酮-异戊酸的分支碳链延伸中具有增加的代谢活性。
【文档编号】C12P7/06GK103635577SQ201280023276
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年3月14日 优先权日:2011年3月14日
【发明者】W.M.希加施德, K.M.周, S.拉比扎德 申请人:伊塞尔生物技术有限责任公司