一种tert基因组合突变位点的检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于分子诊断领域，提供了一种TERT基因组合突变位点的检测试剂盒，其包含能分别扩增出含TERT基因多态性位点RS34094720、RS61748181、RS121918661、RS121918662、RS121918663、RS121918664的片段的引物对和对扩增产物测序所用的测序引物。本发明还提供了使用该试剂盒非诊断检测TERT基因组合突变位点的方法。
【专利说明】一种TERT基因组合突变位点的检测试剂盒 发明领域
[0001] 本发明涉及分子诊断领域，具体的说，本发明涉及检测TERT基因组合突变位点的 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 人端粒酶是一种核糖核蛋白复合物，由人端粒酶逆转录酶（hTERT)、人端粒酶 RNA组分（hTR)以及人端粒酶相关蛋白（hTEPl等）组成。端粒酶以hTERC为模板，在 hTERT催化作用下逆转录合成端粒DNA。近年来多项研究发现，编码端粒酶复合体的相关 基因突变，使端粒酶功能障碍、端粒缩短，细胞衰老、基因组不稳定性增加，进而出现骨髓 衰竭综合征，如Neal S. Young对124例获得性再障骨髓衰竭综合征患者的TERT基因的 16个外显子进行了筛查，在7例患者中发现5个TERT突变（Blood2003 ;102:916-918)，而 Juan Liang在日本的儿童获得性再障骨髓衰竭综合征患者中发现了 2个新的TERT突变 (Hematologica2006 ;91:656-658)，此外TERT的突变对骨髓衰竭综合征患者治疗效果有一 定影响（Bl〇〇d2011117 (21):5607-11和中国博士论文全文数据库：中国北方骨髓衰竭综合 征端粒酶基因突变和专利长度变化的研究刘博中国协和医科大学)。因此，检测TERT突变 位点对骨髓衰竭综合征的筛查、指导临床治疗、科学研究有着重要的意义。
[0003] 检测多态性位点处的突变可以使用PCR+RFLP法，这种检测方法针对检测位点选 择特异性的限制性内切酶进行酶切，然后对酶切产物电泳，通过是否被限制性内切酶切开 而判断是否存在突变位点。这种方法的最大缺点是必须有可以特异性识别突变位点的限制 性内切酶，且其他位点最好不能有被该限制性内切酶识别的序列，否则可能造成结果判断 复杂。
[0004] PCR+测序的方法能直接得到多态性位点及其邻近序列的核酸序列，操作简单(测 序可交由测序公司完成)，结果可靠(可以通过邻近序列判断是否特异性扩增出了所需片 段)。但同时检测多个多态性位点时，针对每个位点的引物所用PCR反应条件不同，每份样 品的每个位点都要单独设置反应条件，造成工作量/仪器/时间的较大浪费。
【发明内容】
[0005] 针对上述问题，发明人分析了 TERT基因多态性位点RS34094720、RS61748181、 RS121918661、RS121918662、RS121918663 和 RS121918664 及其邻近序列，设计了 大量引 物，经过对每对引物反应条件的优化和比较，从中筛选到了特异性强、灵敏度高、且PCR反 应条件近似的5对引物，组成了本发明的试剂盒。该试剂盒一次扩增过程可以同时检测血 液、组织、细胞等多种样本中6个TERT位点的突变情况。为了确保检测的准确性，发明人还 在试剂盒中加入了突变的阴性质控品与阳性质控品，在检测样本时同时检测两种质控品， 以监控检测过程的有效性。本发明还在此基础上提供了非诊断检测TERT基因多态性位点 RS34094720、RS61748181、RS121918661、RS121918662、RS121918663、RS121918664 突变的 方法。
[0006] -方面，本发明提供了一种TERT基因组合突变位点的检测试剂盒，其包含 引物对，所述引物对能扩增出含选自TERT基因多态性位点RS34094720、RS61748181、 RS121918661、RS121918662、RS121918663、RS121918664 中的一个或多个位点的片段。
[0007] 进一步的，该试剂盒包含扩增RS34094720的引物对F1/R1、扩增RS61748181和 RS121918661的引物对F2/R2、扩增RS121918662的引物对F3/R3、扩增RS121918663的引物 对F4/R4、以及扩增RS121918664的引物对F5/R5, 5对引物序列分别为：
[0008] Fl :5'-CGGCCCTCCTTCCTACTCAG-3'（SEQ ID NO :1);
[0009] Rl :5'-CCGCACGCTCATCTTCCAC-3'（SEQ ID NO :2);
[0010] F2 :5,-AACACGGTGACCGACGCA-3'（SEQ ID NO :3);
[0011] R2 :5'-AAGTGCTTGGTCTCGGCGTA-3'（SEQ ID NO :4);
[0012] F3 :5'-TGTTCAGCGTGCTCAACTACGA-3'（SEQ ID NO :5);
[0013] R3 :5'-AGCCGTTGCGGTTCCTTCT-3'（SEQ ID NO :6);
[0014] F4 :5'-CGTCCTGATCGGAAGAAACAAG-3'（SEQ ID NO :7);
[0015] R4 :5'-CGAGCAAGTGCTAACAGGCAT-3'（SEQ ID NO :8);
[0016] F5 :5'-CTGTGCCACCAAGCATTCC-3'（SEQ ID NO :9);
[0017] R5 :5'-GGATGGTCTTGAAGTCTGAGGG-3'（SEQ ID NO :10)。
[0018] 进一步的，该试剂盒还包括5条测序引物，其序列分别为：
[0019] RS34094720 的测序引物 Fl :5' -CGGCCCTCCTTCCTACTCAG-3'（SEQ ID NO :1);
[0020] RS61748181 和 RS121918661 的测序引物 F2 :5' -AACACGGTGACCGACGCA-3'（SEQ ID NO ：3)；
[0021] RS121918662 的测序引物 F3 :5'-TGTTCAGCGTGCTCAACTACGA-3'（SEQ ID NO :5)
[0022] RS121918663 的测序引物 F4 :5' -CGTCCTGATCGGAAGAAACAAG-3'（SEQ ID NO :7);
[0023] RS121918664 的测序引物 R5 :5'-GGATGGTCTTGAAGTCTGAGGG-3'（SEQ ID NO :10)。
[0024] 进一步的，试剂盒中的5对引物PCR扩增时的反应条件同为：
[0025] 94°C 3 分钟，1 个循环；94°C 30 秒，63°C 30 秒，72°C 50 秒，30 个循环；72°C 5 分钟， 1个循环。
[0026] 进一步的，还包括了阳性质控品和阴性质控品，阳性质控品由包含有上述5个位 点的突变序列的质粒组成。阴性质控品由包含有上述5个位点的非突变序列的质粒组成。
[0027] 另一方面，本发明提供了非诊断检测选自TERT基因多态性位点RS34094720、 RS61748181、RS121918661、RS121918662、RS121918663 和 RS121918664 中的一个或多个位 点的突变的方法，步骤包括提取基因组DNA、使用引物对PCR扩增出包含位点的片段、对扩 增产物测序。
[0028] 其中非诊断检测方法可以是用于科研用途的方法，例如可以非诊断的检测来自各 保藏机构的细胞株样本，或者医疗机构所收集的研究用细胞/血液样本，这些样本的样本 主体已经去世/治愈/去向不明，所以显然检测其突变并不是为了检测样本主体的健康状 态而是为了科研。
[0029] 进一步的，该方法使用上述引物Fl/Rl、F2/R2、F3/R3、F4/R4和F5/R5在相同PCR 条件下分别扩增出包含 RS34094720、RS61748181、RS121918661、RS121918662、RS121918663 和RS121918664的片段。
[0030] 进一步的，该方法使用上述测序引物FI、F2、F3、F4和R5对扩增产物测序。
[0031] 在另一个方面，本发明提供了引物组
[0032] Fl :5'-CGGCCCTCCTTCCTACTCAG-3'（SEQ ID NO :1);
[0033] Rl :5'-CCGCACGCTCATCTTCCAC-3'（SEQ ID NO :2);
[0034] F2 :5,-AACACGGTGACCGACGCA-3'（SEQ ID NO :3);
[0035] R2 :5'-AAGTGCTTGGTCTCGGCGTA-3'（SEQ ID NO :4);
[0036] F3 :5'-TGTTCAGCGTGCTCAACTACGA-3'（SEQ ID NO :5);
[0037] R3 :5'-AGCCGTTGCGGTTCCTTCT-3'（SEQ ID NO :6);
[0038] F4 :5'-CGTCCTGATCGGAAGAAACAAG-3'（SEQ ID NO :7);
[0039] R4 :5'-CGAGCAAGTGCTAACAGGCAT-3'（SEQ ID NO :8);
[0040] F5 :5'-CTGTGCCACCAAGCATTCC-3'（SEQ ID NO :9);
[0041] R5 :5'-GGATGGTCTTGAAGTCTGAGGG-3'（SEQ ID NO :10)，
[0042] 在制备检测TERT基因组合突变位点的试剂中的应用。
[0043] 本发明的试剂盒可以使用相同的PCR反应条件检测6个TERT基因关键突变位点， 一方面可以对样本的关键突变位点进行全面的检测；另一方面，相同PCR反应条件大大减 少了实验的工作量，一台96孔板仪器、一次PCR反应的时间可以扩增19个样本，每个样本 可检测6个突变位点，即总共可检测114个突变位点，相比PCR反应条件不同的引物组，可 将时间/仪器/人力的消耗减少至1/6。
[0044] 附图简述
[0045] 图1为使用本发明的试剂盒中的测序引物对RS34094720测序的示例图。
[0046] 图2为使用本发明的试剂盒中的测序引物对RS61748181测序的示例图。
[0047] 图3为使用本发明的试剂盒中的测序引物对RS121918661测序的示例图。
[0048] 图4为使用本发明的试剂盒中的测序引物对RS121918662测序的示例图。
[0049] 图5为使用本发明的试剂盒中的测序引物对RS121918663测序的示例图。
[0050] 图6为使用本发明的试剂盒中的测序引物对RS121918664测序的示例图。
[0051] 图7为使用本发明的五对引物扩增出的片段的电泳图。
【具体实施方式】
[0052] 试剂盒的组成
[0053] -个本发明的试剂盒包括1管PCR buffer，5管不同标记的引物混合液，1管阳性 质控品，1管阴性质控品，5管不同标记的测序引物。其中，PCR buffer为市售的成品，由 Taq酶、dNTP、Mg2+等构成。5管引物混合液分别为：① F1+R1 ;②F2+R2 ;③F3+R3 ;④F4+R4 ; ⑤F5+R5。阳性质控品由包含有上述5个位点的突变序列的质粒组成。阴性质控品由包含有 上述5个位点的非突变序列的质粒组成。5管测序弓丨物分别为：①Fl ;②F2 ;③F3 ;④F4 ; ⑤R5。
[0054] 检测过程
[0055] 使用者可用市售的DNA提取试剂提取待检测样本中基因组DNA (gDNA)，放于4? 8°C待用（或放于-20°C暂存)。
[0056] 按照需要检测样本数配置相应数量的PCR反应体系1-5,每份体系包括：PCR buffer44ul，①-⑤的引物混合液4ul，混勻后分装入PCR反应管中。
[0057] PCR反应前，在每个反应管中加入提取的gDNA2ul。每批反应必须同时设置5个阳 性质控管1_5、5个阴性质控管1-5和1个阴性对照，每管分别加入阳性质控品2ul，阴性质 控品2ul，灭菌单蒸水2ul。
[0058] 反应条件：94 °C 3分钟，1个循环；94 °C 30秒，63 °C 30秒，72 °C 50秒，30个循环； 72°C 5分钟，1个循环。反应结束后，每管PCR产物取3ul，用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0059] 检测结果需满足：阳性质控管1与阴性质控管1电泳条带在522bp左右，阳性质 控管2与阴性质控管2电泳条带在620bp左右，阳性质控管3与阴性质控管3电泳条带在 426bp左右，阳性质控管4与阴性质控管4电泳条带在736bp左右，阳性质控管5与阴性质 控管5电泳条带在711bp左右，阴性对照管无肉眼可见条带。反应管1电泳条带在522bp 左右，反应管2电泳条带在620bp左右，反应管3电泳条带在426bp左右，反应管4电泳条 带在736bp左右，反应管5电泳条带在711bp左右，目的条带明亮、清晰，且无其他非特异条 带。将满足条件的PCR产物及测序引物送测序公司测序。
[0060] 以上述方法对50份来自志愿者的血液样本和来自保藏机构的血液样本进行了 实际检测，结果证明，本发明的扩增引物完全可以在相同的PCR条件的特异性的扩增出含 RS34094720、RS61748181、RS121918661、RS121918662、RS121918663 和 RS121918664 的预 期片段，使用本发明的测序引物也可以完成对扩增出的片段的测序。各样品的测序结果得 到的序列均包含了 RS34094720、RS61748181、RS121918661、RS121918662、RS121918663 和 RS121918664位点及其邻近序列，50份样品的检测均获得了成功。
[0061] 其中检测出 RS34094720T 型 2 份，C 型 48 份；RS61748181G 型 45 份，A 型 5 份； RS121918661G 型 0 份，A 型 50 份；、RS121918662G 型 3 份，A 型 47 份；、RS121918663A 型 6 份，G 型 44 份；RS121918664G 型 1 份，A 型 49 份。
【权利要求】
1. 一种TERT基因组合突变位点的检测试剂盒，其包含引物对，所述引物对能扩增 出含选自 TERT 基因多态性位点 RS34094720、RS61748181、RS121918661、RS121918662、 RS121918663、RS121918664中的一个或多个位点的片段。
2. 权利要求1所述的试剂盒，其包含扩增RS34094720的引物对F1/R1、扩增 RS61748181 和 RS121918661 的引物对 F2/R2、扩增 RS121918662 的引物对 F3/R3、扩增 RS121918663的引物对F4/R4、以及扩增RS121918664的引物对F5/R5,5对引物序列分别 为： FI :5'-CGGCCCTCCTTCCTACTCAG-3'（SEQ ID NO :1); R1 :5'-CCGCACGCTCATCTTCCAC-3'（SEQ ID NO :2); F2 :5'-AACACGGTGACCGACGCA-3'（SEQ ID NO :3); R2 :5'-AAGTGCTTGGTCTCGGCGTA-3'（SEQ ID NO :4); F3 :5'-TGTTCAGCGTGCTCAACTACGA-3'（SEQ ID NO :5); R3 :5'-AGCCGTTGCGGTTCCTTCT-3'（SEQ ID NO :6); F4 :5'-CGTCCTGATCGGAAGAAACAAG-3'（SEQ ID NO :7); R4 :5,-CGAGCAAGTGCTAACAGGCAT-3，（SEQ ID NO :8); F5 :5'-CTGTGCCACCAAGCATTCC-3'（SEQ ID NO :9); R5:5'-GGATGGTCTTGAAGTCTGAGGG-3'（SEQ ID N0:10)。
3. 权利要求2所述的试剂盒，还包括5条测序引物，其序列分别为： RS34094720 的测序引物 FI :5'-CGGCCCTCCTTCCTACTCAG-3'（SEQ ID NO :1); RS61748181 和 RS121918661 的测序引物 F2 :5' -AACACGGTGACCGACGCA-3'（SEQ ID NO : 3)； RS121918662 的测序引物 F3:5'-TGTTCAGCGTGCTCAACTACGA-3'（SEQ ID N0:5) RS121918663 的测序引物 F4 :5' -CGTCCTGATCGGAAGAAACAAG-3'（SEQ ID NO :7); RS121918664 的测序引物 R5 :5' -GGATGGTCTTGAAGTCTGAGGG-3'（SEQ ID NO :10)。
4. 权利要求2所述的试剂盒，其特征在于试剂盒中的5对引物PCR扩增时的反应条件 同为：94°C 3分钟，1个循环；94°C 30秒，63°C 30秒，72°C 50秒，30个循环；72°C 5分钟，1 个循环。
5. 权利要求4所述的试剂盒，还包括阳性质控品和阴性质控品，阳性质控品由包含有 权利要求1所述5个位点的突变序列的质粒组成。阴性质控品由包含有权利要求1所述5 个位点的非突变序列的质粒组成。
6. 非诊断检测选自TERT基因多态性位点RS34094720、RS61748181、RS121918661、 RS121918662、RS121918663和RS121918664中的一个或多个位点的突变的方法，步骤包括 提取基因组DNA、使用引物对PCR扩增出包含位点的片段、对扩增产物测序。
7. 权利要求6的方法，其中使用权利要求2中所列的引物对F1/R1、F2/R2、F3/R3、F4/ R4 和 F5/R5 在相同 PCR 条件下分别扩增出包含 RS34094720、RS61748181、RS121918661、 RS121918662、RS121918663 和 RS121918664 的片段。
8. 权利要求7的方法，其中相同PCR条件为：94°C3分钟，1个循环；94°C30秒，63°C30 秒，72 °C 50秒，30个循环；72 °C 5分钟，1个循环。
9. 权利要求8的方法，其中使用权利要求3所列的测序引物FI、F2、F3、F4和R5对扩 增产物测序。
10.引物组 FI :5'-CGGCCCTCCTTCCTACTCAG-3'（SEQ ID NO :1); R1 :5'-CCGCACGCTCATCTTCCAC-3'（SEQ ID NO :2); F2 :5'-AACACGGTGACCGACGCA-3'（SEQ ID NO :3); R2 :5'-AAGTGCTTGGTCTCGGCGTA-3'（SEQ ID NO :4); F3 :5'-TGTTCAGCGTGCTCAACTACGA-3'（SEQ ID NO :5); R3 :5'-AGCCGTTGCGGTTCCTTCT-3'（SEQ ID NO :6); F4 :5'-CGTCCTGATCGGAAGAAACAAG-3'（SEQ ID NO :7); R4 :5'-CGAGCAAGTGCTAACAGGCAT-3'（SEQ ID NO :8); F5 :5'-CTGTGCCACCAAGCATTCC-3'（SEQ ID NO :9); R5 ：5'-GGATGGTCTTGAAGTCTGAGGG-3, (SEQ ID N0：10), 在制备检测TERT基因基因多态性位点RS34094720、RS61748181、RS121918661、 RS121918662、RS121918663 和 RS121918664 突变的试剂中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104404128SQ201410055011
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年2月18日 优先权日:2014年2月18日
【发明者】汤郡, 陈颖, 陈南, 何娟 申请人:广州金域医学检验中心有限公司