三重复合微球制剂及其制备方法

专利名称：：三重复合微球制剂及其制备方法
技术领域：
：本发明属于药剂学领域，涉及生物可降解微囊及微球制剂及其制备方法，尤其涉及海藻酸钙-壳聚糖-乙交酯丙交酯共聚物三重复合微球制剂及其制备方法。这种新型的复合制剂对解决蛋白类疫苗投药的瓶颈问题有着重大的意义。
背景技术：
：接种疫苗是除纯净水供应外最有效的抗感染性疾病的公共卫生措施。只是一些疫苗如乙肝疫苗、破伤风疫苗常需接种2-3次才能达到预期的免疫效果，漏种率很高，严重影响免疫效果也导致疫苗储运费用和医护开支的增加。因此，首次接种疫苗即获完全免疫是世界卫生组织疫苗发展规划的主要目标之一。开发一次接种便获全程免疫的单剂量疫苗是一种理想的解决办法。关键是选择合适的可生物降解的高分子材料，建立长时间脉冲释放抗原的传输系统。疫苗载体常用聚酯、聚氨基酸、聚酸酐等。聚酯类常用乙交酯丙交酯共聚物(PLGA)[1]，且PLGA微球用于疫苗给药具有佐剂作用。目前，PLGA微球作为水溶性蛋白、多肽类疫苗控释给药系统的发展所遇到的最大阻力便是此类药物的稳定性问题及药物从PLGA基质的突释和不完全释放问题，而且PLGA的疏水性使亲水性蛋白药物的包封效果亦较差。首先，能溶解PLGA的有机溶剂种类极少，以二氯甲烷最为常用。蛋白类药物与有机溶剂反复超声或搅拌导致蛋白聚集，活性受损。其次，随着聚合物的降解而产生的酸性成分也是蛋白失活的一个重要原因。已有许多方法报道用于避免蛋白的活性损失(1)制备时，直接以蛋白冻干粉分散于有机溶剂中，以增加蛋白的稳定性[2]；(2)先制成W/O乳液，初乳液中的油可以隔开蛋白药物和聚合物有机相；(3)采用新包囊技术，使用温和的有机溶剂如醋酸、苯甲醇、三乙酸甘油酯和N，N’-二甲乙酰胺溶解PLGA，使最低限度引起蛋白变性[3]；(4)加入蛋白保护剂，如海藻糖、环糊精、聚乙二醇(PEG)等多羟基类物质，吐温20等表面活性剂及牛血清白蛋白等。它们或先于蛋白吸附于两相界面，减少包囊蛋白与有机溶剂的接触，或依靠多羟基围绕在蛋白周围，固定蛋白的天然构象[4]；(5)消除PLGA降解过程中产生的酸性物质的不良影响，为抗原创造pH值相对稳定的微环境。可加入的稳定剂有明胶、阿拉伯胶、乙酰化甲壳质、谷氨酸钠等，也可直接应用氢氧化镁、碳酸镁、碳酸锌等碱性物质，甚至直接将蛋白药物溶于磷酸盐缓冲剂以维持PLGA降解过程中的pH值。对3％Mg(OH)2和10％蔗糖对包裹入PLGA微球内牛血清白蛋白(BSA)的稳定性结果考察比较不加附加剂微球在37℃孵育4周81％蛋白发生聚集，加糖后为50％；加碱后则少于7％[5]。(6)将蛋白药物包囊于琼脂糖水凝胶颗粒中，再进一步分散于PLGA微球。此复合微球包封率高，水合作用快，更重要的是琼脂糖水凝胶对蛋白质的稳定作用，但未能改变蛋白药物的突释[6]。此外，水溶性蛋白的PLGA微球的制备常采用W/O/W复乳法，多可形成多孔性微球，且真空干燥使孔隙率更大[7]。也有一系列方法用于减少药物突释如减少内水相体积比；外水相中加入缓冲盐；改变有机相组成或在有机相中加入甘油；改变操作方法如以减压溶剂挥发法代替常压溶剂挥发法，超声乳化代替高速搅拌等[8]。但始终水溶性蛋白、多肽类药物从PLGA微球中的突释现象及由于蛋白聚集等原因而导致的不完全释放等问题得不到很好的解决。天然的或合成的生物可降解材料在药物制剂方面的应用日益增加。较非生物降解材料，它具有更多优点如给药更为方便，有良好的顺应性，应用后期仍具有一定的释药速率，甚至随降解材料的变化有可能产生脉冲给药等。然而，无论是亲水性材料还是疏水性材料，单独应用于蛋白药物的投药系统均不理想。亲水性材料具有良好的生物相容性，但常常具有较快的释药速度。另一方面，疏水性材料具有缓释作用，但它与水溶性的蛋白、多肽类药物不相容，会引起原本处于折叠态的天然蛋白结构伸展，导致活性的改变，而且包封率也很难提高。
发明内容本发明提供一种新的复合微球制剂及其制备方法，即三重复合微球制剂及其制备方法，目的在于提供水溶性多肽、蛋白类疫苗以稳定的亲水性微环境，从而很好地保护蛋白药物，使其免受或少受有机溶剂及随PLGA生物降解产生pH下降所致的活性损失，同时提高药物包封率，大大减少药物的突释，并通过最外层的PLGA本身聚乳酸(PLA)与聚羟乙醇酸(PGA)比例的调整使药物的最终控释成为可能，这种新型的复合制剂对解决蛋白类疫苗投药的瓶颈问题有着重大的意义。本发明提供的三重复合微球制剂及其制备方法，是采用W/O乳化、异丙醇洗涤制备小粒径海藻酸钙微囊，并以壳聚糖进一步包裹海藻酸钙微囊，形成结构更为致密的海藻酸-壳聚糖双层微囊，再采用乳化-溶剂挥发法将海藻酸-壳聚糖双层微囊包裹入乙交酯丙交酯共聚物内形成三层复合微球。本发明微球制剂的主要组成为模型药物3％、海藻酸钙10％、壳聚糖2％、乙交酯丙交酯共聚物85％，还包括药用敷料。本发明制备方法主要通过以下方案实现(1)海藻酸钙微囊制备将模型药物溶于0.5％～2％(w/v)海藻酸钠溶液中为水相，另取第一乳化剂，按4％～6％(w/v)浓度溶于异辛烷作为油相，两相体积比为1∶2，高速乳匀转速为5000～20000rpm，两相高速乳匀1～5分钟后滴加第二乳化剂，再乳匀1～5分钟，逐滴加入1％～10％(w/v)交联剂后依然乳匀1～5分钟，加入异丙醇在相同转速下最后乳匀1～3分钟。离心后制得海藻酸钙微囊。(2)海藻酸钙-壳聚糖双层微囊制备用0.1％～2.0％、pH4～6的壳聚糖溶液孵育海藻酸钙微囊10～40分钟，离心收集微囊后用壳聚糖溶液和/或水清洗，冷冻干燥得到粒径均匀、形态圆整的海藻酸钙-壳聚糖双层微囊。(3)三层复合微球制备将上述双层微球以1％～1.5％(w/w)浓度分散至3.5～4.0g二氯甲烷中，探头式超声仪50～200w，10～40秒超声，再称取乙交酯丙交酯共聚物(PLGA)，消旋PLGA(DL-PLGA)及左旋PLA(L-PLA)(按40∶54∶6比例)共1g加入上述混悬液中，涡旋使溶解作为油相；另配制0.1％～0.5％羧甲基纤维素钠溶液5～10ml作为水相，将油相加至水相，1200～2000rpm搅拌下乳匀3～5分钟，随后，将其逐滴加入50～200ml，0.5％～1％聚乙烯醇(PVA)溶液中，500～600rpm下乳匀1～2分钟后提高转速至800rpm～2000rpm继续搅拌1～3分钟，减压旋转蒸发，除去二氯甲烷，离心收集复合微球，蒸馏水洗涤后冷冻干燥即可。(4)也可将海藻酸钙-壳聚糖微囊以≤1.2％(w/v)浓度分散至乙交酯丙交酯共聚物(PLGA)的乙腈溶液中(微球∶PLGA＝1∶4～1∶10)，探头式超声仪50～200w，5～30秒超声后作为混悬水相，司盘80按4％～8％(w/v)溶于花生油作为油相。油相在500～600rpm搅拌下缓慢滴入上述混悬液，随后，提高转速至800～2000rpm并继续搅拌1～2分钟，减压旋转蒸发，除去乙腈，离心收集复合微球，石油醚洗涤后37℃挥干或真空干燥即可。本发明的模型药物主要包括多肽类、蛋白类药物。海藻酸钠溶液的含量为0.5％～2％。第二乳化剂用量为第一乳化剂用量的15％～49％，第一乳化剂优选司盘80，第二乳化剂优选吐温80。三层复合微球制备中所用的PLGA，其PLA与PGA的比例为50～100∶50～0。海藻酸钙-壳聚糖微囊的粒径1～5μm。复合微球粒径为20μm～50μm。本发明的三层复合微球制剂的制剂形式包括注射剂型和口服剂型。本发明的优点及积极效果(1)发明首先采用较温和的修饰乳化及离子交联法将水溶性多肽、蛋白类疫苗包裹入海藻酸钙-壳聚糖双层微囊内，一方面提供一个稳定的水凝胶微环境，从而很好地保护蛋白类药物，使其免受或少受有机溶剂对活性的影响，另一方面PLGA生物降解产生的pH下降，也随壳聚糖的溶解可带走部分H+，从而减少因降解产物酸性所致的活性损失，减少蛋白的不完全释放。(2)大多数蛋白类药物在水中溶解度大，通过乳化交联技术制备海藻酸钠微囊时采用水洗法制得的微囊包封率为4％～18％，远远低于醇洗法的80％～100％。同时，水洗法所得微囊的量为醇洗法的50％左右。因此，本发明进一步用壳聚糖包裹的海藻酸钙微囊采用醇洗法制备得到，使复合微囊制备的第一步建立在较高的起点上。得到的海藻酸微囊进一步在壳聚糖溶液中孵育，通过静电作用包囊以及随后疏水性PLGA材料的第三次包囊，包封效率都可接近于100％，不仅使水溶性蛋白类药物在疏水性PLGA微球中包封率大大提高，也使海藻酸微囊对水溶性药物的泄漏和快速释放得以阻滞，从而更好地控制药物释放模式。(3)复合微球明显减少药物的突释现象，由单纯PLGA微球24h内释药约50％左右到复合微球的大约10％，并通过最外层的PLGA调整PLA与PGA比例控制药物的最终释放模式。图1为海藻酸钙-壳聚糖-乙交酯丙交酯共聚物三重复合微球的扫描电镜图。图2为水洗法和醇洗法制备所得海藻酸钙微球的收得率、包封率和载药率比较。图3为经不同浓度壳聚糖孵育后制得的海藻酸-壳聚糖微球的释放比较。图4为不同pH条件下制得的海藻酸-壳聚糖微球在体外释放比较。图5为海藻酸-壳聚糖微球的粒径和形态扫描电镜图。图6为单纯PLGA微球和三重复合微球中BSA的体外累积释放图。具体实施例方式实施例1本发明复合微球的一种制备方法(1)海藻酸钙微囊制备以BSA作为模型药物，将BSA用少量蒸馏水溶解后与1％海藻酸钠溶液充分混匀，第一乳化剂为司盘80，溶于异辛烷的浓度为5％(w/v)，两相体积比为1∶2，高速乳匀转速为12000rpm，时间为3分钟，然后加入第二乳化剂即吐温80，浓度为30％(w/w)，用量为司盘80的45％，再乳匀3min，加入交联剂氯化钙溶液，浓度为8％(w/v)，再乳匀3分钟，加入异丙醇以析出微囊的提取时间为2分钟。离心后制得海藻酸钙微囊。(2)海藻酸钙-壳聚糖微球制备将上述制的得海藻酸钙微囊，用1.0％pH4壳聚糖溶液孵育10～40分钟，离心收集微囊，再用同样的壳聚糖溶液清洗1次，用水清洗2次(或3次均用水清洗)，冷冻干燥得到＜5μm大小，粒径均匀、形态圆整的海藻酸钙-壳聚糖微囊。(3)三层复合微球制备将上述微囊以1.2％(w/w)浓度分散至3.5～4.0g二氯甲烷中，探头式超声仪200w，40秒超声，再称取PLGA，DL-PLGA及L-PLA(按40∶54∶6比例)共1g加入上述混悬液中，涡旋使溶解作为油相；另配制0.2％羧甲基纤维素钠溶液8ml作为水相。将油相加至水相，1800rpm搅拌下乳匀5分钟，随后，将其逐滴加入150ml，0.5％PVA溶液中，600rpm下乳匀2分钟后提高转速至1200rpm继续搅拌3分钟，减压旋转蒸发，除去二氯甲烷，离心收集复合微球，蒸馏水洗涤后冷冻干燥即可，制得的复合微球粒径为35μm，微球粒径参见图1。通过本发明方法制得的复合微球，可明显减少突释现象，而且，可通过改变外层PLGA的组成比调节药物的释放模式。本发明首先将水溶性蛋白或多肽类疫苗溶解在一定浓度的海藻酸钠溶液中，形成初始的保护，利用乳化-离子交联法制得海藻酸钙微囊[9]，醇洗法提高药物包封率，并在壳聚糖溶液中孵育形成双层复合微囊，从而使海藻酸钙微囊的结构更为致密，减少包囊药物的突释，并提供给药物双重的亲水性聚合物的保护，产生一个合适的亲水性微环境。而且，由于PLGA的初始降解速度较快，产生的酸性成分有利于壳聚糖的溶解及药物的首次释放，在减少或消除药物突释的前提下又不影响药物的第一次释放，甚至可以带走大部分因PLGA降解而产生的H+。使蛋白的稳定性问题及突释问题得以解决。此外，海藻酸-壳聚糖微胶囊对模型蛋白BSA的包封效率可高达97％，第二次PLGA包囊亦可大于90％，因此可使药物包封率大大提高。由于进一步用壳聚糖包裹海藻酸钠微囊，也使海藻酸微囊对水溶性药物的泄漏和快速释放得以阻滞，减少药物的突释，从而更好地控制药物的释放模式。第二次包囊亦采用W/O乳化法，其中一种方法参考文献中PLGA相图及聚合物合金理论[10]。同时，药物的不同释放模式可通过改变PLGA中PLA与PGA的比例，从50∶50到100∶0的范围或混合不同比例的PLGA微球加以控制。这种复合微球的制备不仅给予蛋白、多肽类药物以海藻酸凝胶亲水性微环境作为第一层保护，而壳聚糖的加入使药物的突释大为减少，并进一步地稳定蛋白，最外层的PLGA，通过本身PLA与PGA比例的调整使药物的最终控释成为可能。因此，对解决蛋白类疫苗制剂的瓶颈问题有重大的意义。实施例2本发明复合微球的第2种制备方法第一步中两相高速乳匀转速为5000rpm；第二步得到的双层复合微囊粒径＜8μm；第三步得到的微球粒径＜50μm；其余步骤同实施例1。实施例3本发明复合微球的第3种制备方法第一步中两相高速乳匀转速为20000rpm，第二步得到的双层复合微囊粒径＜2μm，第三步得到的微球粒径＜30μm，其余步骤同实施例1。实施例4本发明复合微球的第4种制备方法交联剂为氯化锌溶液，第二步得到的双层复合微囊粒径＜5μm，第三步得到的微球粒径＜40μm，其余步骤同实施例1。实施例5本发明复合微球的第5种制备方法交联剂为氯化钡溶液，第二步得到的双层复合微囊粒径＜5μm，第三步得到的微球粒径＜40μm，其余步骤同实施例1。实施例6本发明复合微球的第6种制备方法步骤基本同实施例1，但采用1％pH6壳聚糖溶液孵育，得到复合微囊粒径和形态相同。实施例7本发明复合微球的第7种制备方法步骤基本同实施例1，但第三步采用0.1％羧甲基纤维素钠溶液，得到复合微囊粒径＜30μm。实施例8本发明复合微球的第8种制备方法步骤基本同实施例1，但第三步采用0.5％羧甲基纤维素钠溶液，得到复合微囊粒径＜50μm。实施例9本发明复合微球的第9种制备方法步骤基本同实施例1，但第三步提高转速至2000rpm，得到复合微囊粒径＜30μm。实施例10本发明复合微球的第9种制备方法模型药物为超氧化物歧化酶(SOD)，其余制备方法同实施例1，制得的复合微球粒径、形态及释放特征同实施例1的BSA。实施例11本发明复合微球的第11种制备方法第一步和第二步采用与实施例1相同的方法。第三步方法为将海藻酸钙-壳聚糖微囊以0.86％(w/v)浓度分散至乙交酯丙交酯共聚物(PLGA)的乙腈溶液中(微囊∶PLGA＝1∶6)，探头式超声仪200w，20秒超声后作为混悬水相，司盘80按6.67％(w/v)溶于花生油作为油相。油相在600rpm搅拌下缓慢滴入上述混悬液，随后，提高转速至1200rpm并继续搅拌2分钟，减压旋转蒸发，除去乙腈，离心收集复合微球。石油醚洗涤后37℃挥干或真空干燥即可，制得的复合微球粒径为30.1μm，微球粒径参见图1。本发明方法利用亲水性生物可降解材料海藻酸钠与钙离子这种温和的交联方法提供水溶性多肽、蛋白类疫苗以稳定的亲水性微环境，然后采用另一亲水性生物可降解聚合物壳聚糖溶液孵育，通过阴、阳离子静电作用产生的双层海藻酸-壳聚糖微囊结构更为致密，使蛋白药物进一步免受或少受有机溶剂及随PLGA生物降解产生pH下降所致的活性损失，从而很好地保护蛋白药物，同时提高药物包封率，大大减少药物的突释，将上述双层微囊进一步分散于PLGA微球中制成三重复合微球，并最终得到缓释制剂，而且，通过最外层的PLGA本身聚乳酸(PLA)与聚羟乙醇酸(PGA)比例的调整控制药物的释放在要求的时间内。实施例12水洗法和醇洗法制备所得海藻酸钙微囊的收得率、包封率和载药率比较由于BSA在水中溶解度大，通过W/O乳化，钙离子交联固化制备海藻酸钙微囊时采用水洗法制得的微囊包封率为18.83％±0.11％，远远低于醇洗法的99.95％±0.06％。同时，水洗法所得微囊的量为醇洗法的49.43％，结果参见附图2。实施例13经不同浓度壳聚糖孵育后制得的海藻酸-壳聚糖微囊在生理盐水中的释放比较蛋白的释放随着包裹海藻酸钙微球的壳聚糖浓度上升而渐受抑制，药物用量为20％的海藻酸(1％)微球，用0％、0.1％、0.5％壳聚糖包裹，在生理盐水中48h蛋白释放率分别为99.50％±0.01％，93.20％±0.42％，44.19％±0.11％，继续提高至1.0％则无更大的延缓作用，为54.00±0.85％，结果参见附图3。实施例14海藻酸-壳聚糖微囊的体外释放比较将1％海藻酸微囊分别经pH4和pH6的1％壳聚糖溶液孵育后制得的海藻酸-壳聚糖微囊，经体外释放比较，表明1％，pH4的壳聚糖溶液较pH6溶液阻滞蛋白释放作用更强。前者48h蛋白释放率为20.35±1.07％，后者为55.96％±3.00％。双层复合微囊中蛋白在生理盐水中释放均可从48h延缓至7d以上，结果参见附图4。实施例15复合微囊的粒径和形态电镜扫描将用醇洗法制得的海藻酸微囊经pH为4，浓度在0.2％～0.5％范围的壳聚糖溶液包裹后大小均一，呈球形，表面光滑，在生理盐水或磷酸盐缓冲液中分散性好，平均粒径在1～2μm，包封率大于85％，电镜扫描结果参见附图5，体均粒径为1.15±0.21μm。实施例16单纯PLGA微球和三重复合微球中BSA的体外累积释放比较精密称取单纯PLGA微球30mg或三重复合微球150mg至eppendorf管，分别加入3.0ml生理盐水作为释放介质，涡旋分散后置37℃恒温振荡器，在700rpm下进行释放试验。间隔一定时间将样品液1,2000rpm(PLGA微球)或4000rpm(三重复合微球)，15min高速离心，取1.0ml上清夜用微量BCA试剂盒测定释出蛋白的含量，沉淀用1.0ml新鲜介质补足，分散后继续振荡。计算累积释药量，以各实验点的累积释药量与微球中所含蛋白总量的百分比为纵坐标，各实验取样点为横坐标作释放曲线。通过本发明方法制得的复合微球，可明显减少突释现象，而且可通过改变外层PLGA的组成比调节药物的释放模式，与BSA的PLGA微球的体外释放作比较参见附图6。本发明涉及的部分参考文献1.O′HaganDT，SinghM，GuptaRK.Poly(lactide-co-glycolide)microparticlesforthedevelopmentofsingle-dosecontrolled-releasevaccines.AdvancedDrugDeliveryReviews1998；32225-2462.DiwanM，ParkTG.PegylationenhancesproteinstabilitystabilityduringencapsulationinPLGAmicrospheres.JControlledRelease2001；73233-2443.KinamP.Anewmicroencapsulationprocessforproteindrugs.NewProjectX(2000)4.何应，柳林，魏树礼等。破伤风类毒素聚乳酸微球中蛋白质稳定性的研究。中国药学杂志2001；36(6)391-3945.KangJ，SchwendemanSP.ComparisonoftheeffectsofMg(OH)2andsucroseonthestabilityofbovineserumalbuminencapsulatedininjectablepoly(d，l-lactide-co-glycolide)implants.Biomaterials2002；23(1)239-2456.WangN，WuXS.Anovelapproachtostabilizationofproteindrugsinpoly(lactic-co-glycolicacid)microspheresusingagarosehydrogel.InternationalJPharm1998；1661-147.李岩，孙殿甲，毕殿洲。聚乳酸、聚乳酸乙醇酸共聚物微球的制备及体外释放影响因素研究进展。中国现代应用药学2002；19(4)281-2848.赵锋，高永良。乳化分散法制备聚乳酸微球的研究进展。中国新药杂志200211(2)123-1269.LemoineD，WautersF，Bouchend’hommeS，etal.，Preparationandcharacterizationofalginatemicrospherescontainingamodelantigen.IntJPharm1998；1769-1910.MatsumotoA，MatsukawaY，SuzukiT，etal.Thepolymer-alloysmethodasanewpreparationmethodofbiodegradablemicrospheresprincipleandapplicationtocisplatin-loadedmicrospheres.JControlledRelease1997；48(1)19-27在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。此外，前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。权利要求1.三重复合微球制剂及其制备方法，其特征是采用W/O乳化、异丙醇洗涤制备小粒径海藻酸钙微囊，并以壳聚糖进一步包裹海藻酸钙微囊，形成结构更为致密的海藻酸-壳聚糖双层微囊，再采用乳化-溶剂挥发法将海藻酸-壳聚糖双层微囊包裹入乙交酯丙交酯共聚物内形成三层复合微球。2.根据权利要求1所述的三重复合微球制剂，其特征是制剂的主要组成为模型药物3％、海藻酸钙10％、壳聚糖2％、乙交酯丙交酯共聚物85％。3.根据权利要求1所述的三重复合微球制备方法，其特征是主要通过以下方案实现(1)海藻酸钙微囊制备将模型药物溶于0.5％～2％(w/v)海藻酸钠溶液中为水相，另取第一乳化剂，按4％～6％(w/v)浓度溶于异辛烷作为油相，两相体积比为1∶2，高速乳匀转速为5000～20000rpm，两相高速乳匀1～5分钟后滴加第二乳化剂，再乳匀1～5分钟，逐滴加入1％～10％(w/v)交联剂后依然乳匀1～5分钟，加入异丙醇在相同转速下最后乳匀1～3分钟。离心后制得海藻酸钙微囊。(2)海藻酸钙-壳聚糖双层微囊制备用0.1％～2.0％、pH4～6的壳聚糖溶液孵育海藻酸钙微囊10～40分钟，离心、收集微囊后用壳聚糖溶液和/或水清洗，冷冻干燥得到粒径均匀、形态圆整的海藻酸钙-壳聚糖双层微囊。(3)三层复合微球制备将上述双层微囊以1％～1.5％(w/w)浓度分散至3.5～4.0g二氯甲烷中，探头式超声仪50～200w，10～40秒超声，再称取乙交酯丙交酯共聚物(PLGA)、消旋PLGA(DL-PLGA)及左旋PLA(L-PLA)(按40∶54∶6比例)共1g加入上述混悬液中，涡旋使溶解作为油相，另配制0.1％～0.5％羧甲基纤维素钠溶液5～10ml作为水相，将油相加至水相，1200～2000rpm搅拌下乳匀3～5分钟，随后，将其逐滴加入50～200ml，0.5％～1％聚乙烯醇(PVA)溶液中，500～600rpm下乳匀1～2分钟后提高转速至800～2000rpm继续搅拌1～3分钟，减压旋转蒸发，除去二氯甲烷，离心收集复合微球，蒸馏水洗涤后冷冻干燥即得三重复合微球。4.根据权利要求1和3所述的三重复合微球制备方法，其特征是第三步三层复合微球的制备也可将海藻酸钙-壳聚糖双层微囊以≤1.2％(w/v)浓度分散至乙交酯丙交酯共聚物(PLGA)的乙腈溶液中(微囊∶PLGA＝1∶4～1∶10)，探头式超声仪50～200w，5～30秒超声后作为混悬水相，司盘80按4％～8％(w/v)溶于花生油作为油相，油相在500～600rpm搅拌下缓慢滴入上述混悬液，随后，提高转速至800～2000rpm并继续搅拌1～2分钟，减压旋转蒸发，除去乙腈，离心收集复合微球，石油醚洗涤后37℃挥干或真空干燥即得三重复合微球。5.根据权利要求2所述的三重复合微球制剂，其特征是模型药物主要包括多肽类、蛋白类药物。6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是第二乳化剂用量为第一乳化剂用量的15％～49％，第一乳化剂优选司盘80，第二乳化剂优选吐温80。7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是海藻酸钙-壳聚糖微囊的粒径为1～5μm，三重复合微球粒径为20μm～50μm。8.根据权利要求3所述的三重复合微球制备方法，其特征是所用的PLGA，其PLA与PGA的比为50～100∶50～0。9.根据权利要求1所述的三重复合微球制剂，其特征是制剂形式包括注射剂型和口服剂型。全文摘要本发明提供的一种三重复合微球制剂及其制备方法，制剂的主要组成为有模型药物、海藻酸钙、壳聚糖、乙交酯丙交酯共聚物，制备方法是采用W/O乳化、异丙醇洗涤制备小粒径海藻酸钙微囊，并以壳聚糖进一步包裹海藻酸钙微囊，形成结构更为致密的海藻酸－壳聚糖双层微囊，再采用乳化－溶剂挥发法将海藻酸－壳聚糖双层微囊包裹入乙交酯丙交酯共聚物内形成三层复合微球。本发明提供的复合微球可使蛋白类及多肽类药物在亲水性的海藻酸钠－壳聚糖微囊环境中得到很好的保护并明显减少突释现象，减少不完全释放，可达到药物长时间的释放，并可通过改变PLGA组成调节药物的释放模式。本发明的三层复合微球制剂的制剂形式包括注射剂型和口服剂型。文档编号A61K9/62GK1557283SQ20041001606公开日2004年12月29日申请日期2004年1月18日优先权日2004年1月18日发明者梁文权,郑彩虹申请人:浙江大学